張航 李晶晶 曹亞男 董翔 高聰 李煩繁

肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率與死亡率最高的惡性腫瘤[1]。由于沒有特異性癥狀與體征，大部分肺癌患者在診斷階段已發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，其診斷后5年生存率不到20%[2]。因此，對肺癌相關(guān)危險因素的研究以及對其發(fā)病機制的深入了解在肺癌的防治中有著重要意義。脂肪組織及其相關(guān)代謝異常性疾病，近年已在流行病學與基礎(chǔ)性研究中被確定為某些惡性腫瘤的不良預(yù)后因素[3,4]。作為脂肪組織的主要組成成分，脂肪細胞已被應(yīng)用于多種癌癥的研究之中，包括前列腺癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌和黑色素瘤等，其通過提供代謝燃料或信號傳導(dǎo)媒介等方式以促進腫瘤細胞的增殖與侵襲[5-9]。然而，脂肪細胞在肺癌進展過程中的作用尚未被證實。雖然以往一般認為肺癌不是肥胖相關(guān)性癌癥，但高脂飲食（HFD）所誘發(fā)的超重或肥胖癥增加了小鼠肺癌形成率與癌癥相關(guān)死亡率[10,11]。此外，骨（骨髓脂肪細胞是骨髓微環(huán)境中數(shù)量最多的細胞類型；且隨著年齡的增加，其在骨髓中的比例不斷增高[12]）、腦（60%由脂質(zhì)組成）以及肝臟（機體內(nèi)主要的脂質(zhì)代謝器官）是肺癌的主要轉(zhuǎn)移部位，根據(jù)“種子與土壤”理論[13]，我們應(yīng)考慮到脂肪細胞及其代謝產(chǎn)物在肺癌轉(zhuǎn)移過程中的作用。本研究旨在探索脂肪細胞對肺腺癌A549細胞生物學行為的影響，并對其相關(guān)機制進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑 A549人肺腺癌細胞株與3T3-L1前脂肪細胞株由上海復(fù)旦大學惠贈。DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國HyClone公司；新生牛血清，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；油紅O染料購自生工生物工程（上海）股份有限公司（進口分裝）；青霉素/鏈霉素購自美國Gibco公司；地塞米松與3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）購自美國Sigma公司；牛胰島素購自上海索萊寶公司；結(jié)晶紫、溴化-3（4,5-二甲基噻唑基-2）-2,5-二苯基四唑（MTT）與牛血清白蛋白購自美國Amresco公司；甘油三酯（Triglyceride, TG）測定試劑盒（A110-1）購自南京建成生物工程研究所；Transwell（0.4 μm，8 μm孔徑）小室購自美國Corning公司；Matrigel膠購自美國BD公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及3T3-L1細胞的誘導(dǎo)分化 用含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基和含10%新生牛血清、1%青霉素/鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)A549細胞與3T3-L1細胞。待3T3-L1細胞生長至接觸抑制2天后開始誘導(dǎo)分化：細胞首先培養(yǎng)于誘導(dǎo)劑1（在含10%胎牛血清的DMEM中加入10 μg/mL胰島素，1 μM/L地塞米松和0.5 mM/L IBMX）。兩天后，培養(yǎng)液替換成誘導(dǎo)劑2（在含10%胎牛血清的DMEM中加入10 μg/mL胰島素），并繼續(xù)培養(yǎng)2天。隨后每兩天更換一次培養(yǎng)基。待培養(yǎng)至第8天時，大約80%的前脂肪細胞可分化為成熟脂肪細胞。

1.3 油紅O染色 用PBS洗滌成熟脂肪細胞或A549細胞兩次，4%多聚甲醛固定20 min，再用PBS清洗2遍后，每孔加入0.6 mL油紅O染液染色20 min，棄去染液，用60%異丙醇洗滌至背景清晰后，在光學顯微鏡下觀察細胞。

1.4 Transwell間接共培養(yǎng)及實驗分組 采用Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)（0.4 μm孔徑；Corning，USA），將前脂肪細胞和成熟脂肪細胞分別與A549細胞間接共培養(yǎng)：取對數(shù)生長期A549細胞鋪于6孔板或24孔板中（即下室），前脂肪細胞或成熟脂肪細胞鋪于Transwell小室中（即上室）。實驗分組如下：Group 1（A549細胞單獨培養(yǎng)，即空白對照組）；Group 2（A549細胞與3T3-L1前脂肪細胞共培養(yǎng)，即前脂肪細胞共培養(yǎng)組）；Group 3（A549細胞與成熟脂肪細胞共培養(yǎng)，即成熟脂肪細胞共培養(yǎng)組）。

1.5 MTT法 每組設(shè)5個平行孔。用無血清DMEM培養(yǎng)基將A549細胞密度調(diào)整為1.2×104/孔，取600 μL細胞懸液置于24孔板中，培養(yǎng)12 h后待其貼壁（此時計為Day 0）。吸棄舊培養(yǎng)基，應(yīng)用Transwell小室（0.4 μm）將3T3-L1前脂肪細胞、成熟脂肪細胞分別與A549細胞間接共培養(yǎng)1天-3天后，將小室取出，在鋪有A549細胞的24孔板中每孔避光加入60 μL MTT（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)。棄去孔內(nèi)舊培養(yǎng)液，每孔加入600 μL DMSO，搖床上振蕩混勻10 min使甲瓚結(jié)晶充分溶解。分別吸取150 μL/孔溶解物至 96 孔板，用酶標儀檢測波長490 nm處各孔的吸光度（OD）值，以O(shè)D值來表示細胞的增殖活力。

1.6 平板克隆形成實驗 A549細胞以1,000/孔接種于6孔板，待其貼壁后，將鋪有前脂肪細胞或成熟脂肪細胞的小室懸掛于培養(yǎng)有A549細胞的6孔板上，上下室疊放開始間接共培養(yǎng)。2周后，移去小室，PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定20 min，隨后加入0.1%結(jié)晶紫染液染色15 min并置于顯微鏡下觀察計數(shù)。

1.7 細胞劃痕實驗 接種A549細胞于6孔板中，待細胞融合度達80%以上時，用200 μL移液槍槍頭沿直尺，并垂直于6孔板底面均勻劃3道橫線，PBS洗滌兩次后，將鋪有前脂肪細胞或成熟脂肪細胞的小室懸掛于培養(yǎng)有A549細胞的6孔板上，間接共培養(yǎng)于含1%牛血清白蛋白的DMEM中。分別于0 h、24 h在倒置光學顯微鏡下拍攝照片，并測量劃痕區(qū)域面積的變化。

1.8 Transwell遷移與侵襲實驗 與前脂肪細胞或成熟脂肪細胞共培養(yǎng)2天的A549細胞經(jīng)胰酶消化及離心后，用無血清DMEM培養(yǎng)基重懸并調(diào)整細胞密度為1×105/mL，將200 μL細胞懸液加入Transwell（8 μm）上室；下室加入600 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室，用4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色，鏡下拍照并統(tǒng)計穿膜細胞數(shù)，以此來反映A549細胞遷移能力。侵襲實驗除去向Transwell小室加入細胞懸液之前，在小室內(nèi)面鋪一層50 μg/mL Matrigel膠，其余實驗步驟基本與Transwell遷移實驗相同。

1.9 胞內(nèi)甘油三酯檢測 肺腺癌A549細胞以1×105/mL的密度接種于6孔板中，待其貼壁后，將鋪有前脂肪細胞或成熟脂肪細胞的小室懸掛于6孔板上。共培養(yǎng)48 h后，移去上室，消化下A549細胞并經(jīng)超聲破碎處理后，使用甘油三酯測定試劑盒檢測細胞內(nèi)甘油三酯的含量。

1.10 統(tǒng)計學處理 實驗結(jié)果的統(tǒng)計分析均用SPSS 13.0和GraphPadPrism 7進行。所有實驗均獨立重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以Mean±SD表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用Tukey檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 3T3-L1前脂肪細胞誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細胞 3T3-L1前脂肪細胞呈梭形成纖維細胞形態(tài)，胞內(nèi)無脂滴（圖1A）。誘導(dǎo)分化后，細胞逐漸變圓，胞內(nèi)開始出現(xiàn)脂滴。隨著誘導(dǎo)時間的延長，胞內(nèi)脂滴逐漸增多，且圍繞胞核形成成熟脂肪細胞特征性結(jié)構(gòu)，即“戒環(huán)”樣結(jié)構(gòu)，表明前脂肪細胞已成功誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細胞（圖1B）。油紅O染液可將成熟脂肪細胞內(nèi)的脂滴染成紅色（圖1C）。

2.2 前脂肪細胞與成熟脂肪細胞對A549細胞形態(tài)的影響將肺腺癌A549細胞分別與前脂肪細胞、成熟脂肪細胞共培養(yǎng)2天后，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)：空白對照組A549細胞貼壁生長，呈菱形、三角形或鵝卵石樣上皮細胞形態(tài)（圖2A）。與前脂肪細胞共培養(yǎng)后，A549細胞形態(tài)無明顯變化（圖2B）。而與成熟脂肪細胞共培養(yǎng)兩天后，A549細胞變得更加纖長，呈紡錘樣、成纖維樣細胞形態(tài)（圖2C）。

圖 1 前脂肪細胞的誘導(dǎo)分化及油紅O染色。A：3T3-L1前脂肪細胞；B：成熟脂肪細胞；C：成熟脂肪細胞的油紅O染色（×400）Fig 1 Differentiation of pre-adipocytes and Oil red-O staining.A: 3T3-L1 pre-adipocytes; B: Mature adipocytes; C: Oil red-O staining of mature adipocytes (×400).

圖 2 共培養(yǎng)后鏡下觀察各組A549細胞形態(tài)的改變。A: A549細胞單獨培養(yǎng)后的細胞形態(tài)；B: A549細胞與前脂肪細胞共培養(yǎng)后的細胞形態(tài)；C: A549細胞與成熟脂肪細胞共培養(yǎng)后的細胞形態(tài)（×100）。Fig 2 Morphological changes of A549 cells in different groups observed by microscope following co-culture.A: A549 cells morphology after cultivation alone; B: A549 cells morphology after co-cultivation with pre-adipocytes; C: A549 cells morphology after co-cultivation with mature adipocytes (×100).

2.3 共培養(yǎng)體系中脂肪細胞可促進A549細胞的增殖 為了評估脂肪細胞在A549細胞生長中的潛在作用，本實驗采用了MTT法與平板克隆形成實驗檢測肺癌細胞增殖率的變化。MTT檢測結(jié)果顯示（圖3A），空白對照組在A549細胞培養(yǎng)24 h、48 h以及72 h后的OD值分別為：（0.309,8±0.019,7）、（0.430,8±0.024,6）、（0.651,8±0.031,9）；前脂肪細胞共培養(yǎng)組分別為：（0.327,0±0.026,3）、（0.467,6±0.027,8）、（0.606,0±0.023,7）；成熟脂肪細胞共培養(yǎng)組分別為：（0.379,8±0.030,0）、（0.575,2±0.039,2）、（0.855,6±0.048,5）。3組A549細胞的生長曲線均呈現(xiàn)出明顯的時間依賴性。其中，前脂肪細胞共培養(yǎng)組與空白對照組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；而A549細胞與成熟脂肪細胞僅共培養(yǎng)24 h，其增殖速率就明顯高于對照組（P＜0.01），共培養(yǎng)48 h、72 h后，成熟脂肪細胞的促進作用相較于對照組而言更加明顯（P＜0.001）。

此外，平板克隆形成實驗檢測共培養(yǎng)兩周后各組肺腺癌A549細胞的克隆形成能力，結(jié)果顯示（圖3B、圖3C），前脂肪細胞共培養(yǎng)組與空白對照組的克隆形成數(shù)分別為（115.7±9.2）個、（108.3±10.0）個，此兩組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；而與成熟脂肪細胞共培養(yǎng)后，A549細胞的克隆形成數(shù)為（164.3±17.6）個，明顯高于空白對照組（P＜0.05）。

2.4 共培養(yǎng)體系中脂肪細胞可促進A549細胞的遷移 細胞劃痕實驗檢測A549細胞的橫向遷移能力，結(jié)果顯示（圖4A）：相較于前脂肪細胞共培養(yǎng)組（29.31±5.33）%和空白對照組（26.25±4.12）%，與成熟脂肪細胞共培養(yǎng)24h后的A549細胞的愈合率（47.97±4.26）%明顯提高（P＜0.05）。Transwell 遷移實驗檢測A549細胞的縱向遷移能力。結(jié)果顯示（圖4B）：共培養(yǎng)24 h后，空白對照組細胞的穿膜數(shù)為（83.6±9.3）個，前脂肪細胞共培養(yǎng)組為（90.2±11.3）個，此兩組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。而成熟脂肪細胞共培養(yǎng)組的細胞穿膜數(shù)為（123.8±14.1）個，明顯高于空白對照組與前脂肪細胞組（P＜0.01）。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示成熟脂肪細胞在共培養(yǎng)體系中增強了A549細胞的遷移能力。

圖 3 成熟脂肪細胞對A549細胞生長的促進作用。A：MTT法檢測結(jié)果顯示成熟脂肪細胞組中的A549細胞增殖能力明顯高于空白對照組與前脂肪細胞組，圖表縱坐標表示細胞在波長為490 nm處的吸光度，橫坐標表示時間；B-C：平板克隆形成實驗：相較于對照組，成熟脂肪細胞可明顯促進A549細胞的克隆形成能力，圖表縱坐標表示細胞克隆數(shù)，橫坐標表示相應(yīng)分組。*P＜0.05; **P＜0.01; ***P＜0.001 vs control。Fig 3 Mature adipocytespromote the growth of A549 cells.A: MTT assay shows that the proliferation of A549 cells in mature adipocytes group was significantly higher than that in blank control group and pre-adipocytes group, Y-axis represents the absorbance of the cells at wavelength of 490 nm and X-axis represents time period; B-C: Colony formation assay: Compared to the control group，mature adipocytes can significantly promote the cloning ability of A549 cells, Y-axis represents the colony number and X-axis represents thecorresponding groups.*P＜ 0.05; **P＜ 0.01;***P＜0.001 vs control.

2.5 共培養(yǎng)體系中脂肪細胞可促進A549細胞的侵襲Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示（圖5）：共培養(yǎng)24 h后，空白對照組細胞的穿膜數(shù)為（76.6±9.2）個，前脂肪細胞共培養(yǎng)組為（69.0±10.7）個，此兩組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。而成熟脂肪細胞共培養(yǎng)組的細胞穿膜數(shù)為（105.2±13.2）個，明顯高于空白對照組與前脂肪細胞組（P＜0.01）。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示成熟脂肪細胞在共培養(yǎng)體系中增強了A549細胞的侵襲能力。

2.6 間接共培養(yǎng)下脂肪細胞對肺癌細胞內(nèi)脂滴含量的影響 在建立共培養(yǎng)模型的基礎(chǔ)上培養(yǎng)48 h后，利用油紅O染色顯示肺癌細胞中脂滴的形態(tài)和數(shù)量。結(jié)果表明：與空白對照組和前脂肪細胞共培養(yǎng)組相比，成熟脂肪細胞共培養(yǎng)組中的A549細胞內(nèi)聚集了大量脂滴（圖6A）。此外，甘油三酯測定實驗的結(jié)果與形態(tài)學觀察結(jié)果相一致（圖6B）：與成熟脂肪細胞共培養(yǎng)48 h的A549細胞胞內(nèi)的甘油三酯含量（0.903±0.095 ）mmol/g相較于空白對照組（0.501±0.066）mmol/g與前脂肪細胞共培養(yǎng)組（0.476±0.052） mmol/g明顯增多（P＜0.05）。

3 討論

腫瘤微環(huán)境對腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著十分重要的作用。近年來，已有大量基礎(chǔ)性研究證實腫瘤微環(huán)境中的脂肪細胞與腫瘤細胞間的相互作用可促進多種惡性腫瘤的演進。在腫瘤細胞的影響下，其附近的脂肪細胞能異常分泌大量脂肪因子（如瘦素、脂聯(lián)素、內(nèi)脂素等），生長因子和免疫/炎癥/血管生成因子等，這些細胞因子有助于腫瘤細胞的增殖、侵襲、新血管生成、逃避免疫監(jiān)視和治療抵抗[5-9]。此外，在已被證實為代謝性寄生蟲的腫瘤細胞的影響下，脂肪細胞可異常分泌大量代謝底物，如甘油和脂肪酸。這些代謝物可被腫瘤細胞所攝取，用以合成大分子中間產(chǎn)物，并且為腫瘤細胞的增殖、遷移提供所需能量[14]。盡管已提出將脂肪細胞與腫瘤聯(lián)系起來的幾種潛在機制，但目前還沒有發(fā)現(xiàn)關(guān)于脂肪細胞及其相關(guān)代謝底物在肺癌進展中的作用的確鑿證據(jù)。

圖 4 成熟脂肪細胞可促進A549細胞遷移。A：細胞劃痕實驗（×100）：相較于對照組，成熟脂肪細胞可明顯促進A549細胞的橫向遷移能力（*P＜0.05 vs control），圖表縱坐標表示細胞劃痕愈合率，橫坐標表示相應(yīng)分組；B：Transwell遷移實驗（×200）：相較于對照組，成熟脂肪細胞可明顯促進A549細胞的縱向遷移能力（**P＜0.01 vs control），圖表縱坐標表示細胞的穿膜數(shù)，橫坐標表示相應(yīng)分組。Fig 4 Mature adipocytes promote the migration of A549 cells.A: Wound-closure assay (×100): Compared to the control group, mature adipocytes can significantly promote the lateral migration of A549 cells (*P＜0.05 vs control), Y-axis represents the wound-healing rate of cells and X-axis represents the corresponding groups; B: Transwell migration assay (×200): Compared to the control group, mature adipocytes can significantly promote the longitudinal migration of A549 cells (*P＜0.01 vs control), Y-axis represents the number of migrated cells and X-axis represents thecorresponding groups.

圖 5 成熟脂肪細胞可促進A549細胞侵襲。Transwell侵襲實驗（×200）：相較于對照組，成熟脂肪細胞可明顯促進A549細胞的侵襲能力（**P＜0.01 vs control），圖表縱坐標表示細胞的穿膜數(shù)，橫坐標表示相應(yīng)分組。Fig 5 Mature adipocytes promote the invasion of A549 cells.Transwell invasion assay (×200): Compared to the control group, mature adipocytes can significantly promote the invasion of A549 cells (*P＜0.01 vs control), Y-axis represents the number of invaded cells and X-axis represents thecorresponding groups.

圖 6 成熟脂肪細胞可促進A549細胞胞內(nèi)脂質(zhì)的累積。A：鏡下觀察共培養(yǎng)后各組A549細胞胞內(nèi)脂滴的含量；B：成熟脂肪細胞組中的A549細胞的甘油三酯含量明顯高于對照組（**P＜0.05 vs control），圖表縱坐標表示細胞內(nèi)的甘油三酯含量，橫坐標表示相應(yīng)分組。Fig 6 Mature adipocytes can promote the accumulation of intracellular lipid in A549 cells.A: The lipid level of A549 cells in different groups observed by microscopefollowing co-culture; B: The TG content of A549 cells in mature adipocyte group was significantly higher than that in control group (**P＜0.05 vs control), Y-axis represents the TG content of cells and X-axis represents thecorresponding groups.

本研究采用Transwell體外共培養(yǎng)模式，探究成熟脂肪細胞對肺腺癌A549細胞生物學行為的影響。通過鏡下觀察細胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)與脂肪細胞共培養(yǎng)后的A549細胞由菱形、三角形或鵝卵石樣上皮細胞形態(tài)向紡錘樣、成纖維樣細胞形態(tài)發(fā)展。采用MTT法和平板克隆形成實驗檢測肺腺癌A549細胞增殖率的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，成熟脂肪細胞能明顯促進A549細胞的增殖以及克隆形成能力。通過細胞劃痕實驗、Transwell遷移與侵襲實驗發(fā)現(xiàn)，成熟脂肪細胞亦可明顯促進A549細胞的遷移與侵襲。而前脂肪細胞對A549細胞的生物學行為無明顯影響。前脂肪細胞無論在細胞形態(tài)、胞質(zhì)內(nèi)容物以及基因表達等方面均與脂肪細胞有著明顯的區(qū)別，其對乳腺癌的影響目前亦存在爭論[8,14]。此外，本研究中使用的3T3-L1前脂肪細胞來源于小鼠胚胎，且考慮到脂肪細胞的功能可因其在體內(nèi)部位的不同而有一定的差異[15]，未來應(yīng)將人體內(nèi)的內(nèi)臟脂肪，皮下脂肪與骨髓脂肪組織應(yīng)用到此研究中。

腫瘤細胞的糖、脂代謝不同于正常細胞[16,17]。早在20世紀，Warburg等[18]發(fā)現(xiàn)即使在有氧條件下，腫瘤細胞也以糖酵解途徑作為主要代謝方式，稱為Warburg效應(yīng)。此外，F(xiàn)ord等[19]研究發(fā)現(xiàn)相較于正常細胞，腫瘤細胞的脂肪酸從頭合成明顯增強。Balaban等研究表明，在乳腺癌MDA-MB-231細胞的影響下，脂肪細胞脂解能力增強，其所大量分泌的甘油與游離脂肪酸被乳腺癌細胞攝取，為乳腺癌細胞提供能量，從而促進乳腺癌的生長與轉(zhuǎn)移[14]。本實驗中，通過油紅O染色以及比色分析實驗，我們發(fā)現(xiàn)成熟脂肪細胞可促進肺腺癌A549細胞的脂質(zhì)累積，表明此兩組細胞的相互作用所導(dǎo)致的脂質(zhì)代謝的變化可能與A549細胞生物學行為的改變存在某種聯(lián)系。在未來的研究中，我們將進一步探索肺癌細胞內(nèi)所累積的脂質(zhì)是否源于腫瘤微環(huán)境中的脂肪細胞及其對肺癌細胞的能量代謝有何影響。

總之，腫瘤微環(huán)境中的脂肪細胞可促進肺腺癌A549細胞的增殖、遷移與侵襲, 且這一促進作用可能與脂質(zhì)代謝相關(guān)。研究腫瘤微環(huán)境中的脂肪細胞與腫瘤細胞之間的關(guān)系將為更好地明確腫瘤進展的機制提供實驗依據(jù)，而且有可能成為未來肺癌生物治療的新靶點。