郭雷鳴 丁高峰 徐文才 葛紅 蔣月 陸寓非

晚期非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）的預(yù)后差，目前同步放化療是其標(biāo)準(zhǔn)的治療方案。放射性肺炎（radiation pneumonitis, RP）是肺癌放射治療的主要限制性并發(fā)癥，也是重要的劑量限制性毒性反應(yīng)，而同步放化療亦會加重肺損傷[1]。目前，有關(guān)預(yù)測RP生物學(xué)標(biāo)記物的研究較少，不利于個體化治療方案的推進。因此深入探索RP發(fā)生發(fā)展過程中的相關(guān)生物學(xué)指標(biāo)，對制定個體化的治療方案具有非常重要的臨床指導(dǎo)意義。

研究表明，放射性肺炎的主要特征有肺泡上皮及內(nèi)皮細(xì)胞損傷、炎性因子異常表達、纖維母細(xì)胞增殖及纖維基質(zhì)合成，與這些特征相關(guān)的細(xì)胞因子與放射性肺炎的發(fā)生緊密相關(guān)[2-3]。脫嘌呤脫嘧啶核酸內(nèi)切酶1又稱氧化還原因子-1（apurinic/apyrimidinic endonuclease 1/redox factor-1,Ape1/Ref-1）是一種在多種腫瘤中表達的多功能蛋白，其與放射治療密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在放射性肺損傷進展過程中，放射導(dǎo)致的氧化應(yīng)激使Ape1/Ref-1表達增加，但是肺損傷修復(fù)會消耗掉過量的Ape1/Ref-1蛋白。細(xì)胞間粘附分子-1（intercellular adhesion molecules 1, ICAM-1）是一種與細(xì)胞侵襲性相關(guān)細(xì)胞因子，在腫瘤放射過程中參與細(xì)胞損傷修復(fù)。白細(xì)胞介素（interleukin, IL）-17A是一種促炎癥細(xì)胞因子，可促進關(guān)鍵放射性肺炎標(biāo)記分子IL-6的表達。以上說明，Ape1/Ref-1、ICAM-1及IL-17A可作為肺炎潛在的生物學(xué)標(biāo)記物。因此，我們檢測晚期NSCLC同步放化療患者放療前和放療后血清脫嘌呤脫嘧啶核酸內(nèi)Ape1/Ref-1、ICAM-1和IL-17A水平變化，并研究其變化與放射性肺炎發(fā)生的相關(guān)性，探索放射性肺炎的預(yù)測因子。

1 材料與方法

1.1 一般資料 2014年12月-2015年12月接受同步放化療的晚期NSCLC患者共68例，男36例，女32例，年齡52歲-76歲，中位年齡64歲。所有患者均經(jīng)組織病理學(xué)或細(xì)胞學(xué)確診，其中鱗癌32例，腺癌34例，大細(xì)胞癌2例；臨床分期IIIa期32例，IIIb期36例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 治療方案 采用逆向調(diào)強放療（intensity modulated radiation therapy, IMRT），熱縮體膜或真空體架固定，CT模擬定位掃描，掃描層間距3 mm；在 Varian Eclipse DX 計劃系統(tǒng)勾畫靶區(qū)設(shè)計計劃；根據(jù)ICRU50、62號報告對靶區(qū)和肺、食管、心臟、脊髓等重要器官進行勾畫。大體靶區(qū)（gross tumor volume, GTV）為影像學(xué)上可見腫瘤（包括肺內(nèi)病灶和縱隔淋巴結(jié)）；臨床靶區(qū)（clinicaltarget volume, CTV）為GTV外擴6 mm（鱗癌）或8 mm（腺癌），支氣管方向外放13 mm，包括部分淋巴引流區(qū)；計劃靶區(qū)（planning target volume, PTV）為相應(yīng)的CTV 外擴6 mm-10 mm（綜合考慮呼吸運動幅度和擺位誤差等因素確定）；利用射野方向觀視功能設(shè)計照射野；應(yīng)用放射治療計劃劑量體積直方圖（dose volume histogram, DVH）和等劑量曲線，結(jié)合患者肺功能狀態(tài)和危及器官受量綜合評價確定治療計劃；放療處方劑量為60 Gy-70 Gy/30-35次/6周-7周；收集GTV的平均劑量、最大劑量、最小劑量，肺V5、V10、V20、平均劑量，正常組織并發(fā)癥概率（normal tissue complieation probability,NTCP），食管V45，心臟平均受照劑量和脊髓最大受照劑量，共11個物理參數(shù)資料，確保每位患者放射的同時對正常組織無明顯影響；同步化療2個周期，采用化療方案為順鉑+依托泊苷方案：順鉑50 mg/m2第1、8、29、36天，依托泊苷50 mg/m2第1天-5天、29天-33天。治療結(jié)束后，無特殊情況每3個月隨訪1次。

1.3 分組 應(yīng)用美國腫瘤放射治療協(xié)作組和歐洲腫瘤治療研究協(xié)作組（Radiation Therapy Oncology Group/European Organization For Research and Treatment, RTOG/EORTC）診斷分級標(biāo)準(zhǔn)作為急性和晚期肺放射損傷分級標(biāo)準(zhǔn)評價，有肺炎癥狀與體征，特別是胸部CT顯示與射野區(qū)域一致的彌漫性片狀密度升高影，診斷為放射性肺炎。0級：癥狀體征同治療前比無明顯變化；1級：輕微咳嗽、用力時氣短；2級：持續(xù)性咳嗽需用麻醉性鎮(zhèn)咳藥、輕微用力時呼吸困難但靜息時消失；3級：嚴(yán)重咳嗽、麻醉性鎮(zhèn)咳藥無效、靜息時氣短、臨床或放射影像證實的急性肺炎、可能需要間斷吸氧或應(yīng)用皮質(zhì)激素；4級：嚴(yán)重呼吸功能不全、持續(xù)吸氧或輔助通氣。診斷放射性肺炎時必須排除肺內(nèi)感染及肺內(nèi)病變進展且相關(guān)癥狀分級至少較治療前增加1級。觀察終點：≥2級判定為放射性肺炎。根據(jù)是否發(fā)生放射性肺炎，將患者分為放射性肺炎組和非放射性肺炎組。

1.4 Ape1/Ref-1、ICAM-1及IL-17A的檢測治療前及治療后第14周清晨空腹靜脈采血2 mL-3 mL，肝素抗凝4 ℃ 1200 r/min離心10 min 后取血清存放于-80 ℃冰箱保存，檢測時室溫下融化后2 h內(nèi)測量。Ape1/Ref-1、ICAM-1 ELISA試劑盒購自美國R&D公司，IL-17A ELISA試劑盒購自美國Chemicon公司，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進行。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行檢驗。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，采用t檢驗。計數(shù)資料采用率（%）表示，采用卡方檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料、隨訪及放射性肺炎發(fā)生情況 全組患者一般資料（性別，年齡，吸煙史等）與放射性肺炎的發(fā)病率無明顯相關(guān)性（表1）。隨訪至2016年12月，隨訪12個月-24個月，中位隨訪18個月，無失訪。68例患者中有18例在放療結(jié)束后15周內(nèi)發(fā)展為放射性肺炎（2例發(fā)生在放療結(jié)束后1周-2周，16例發(fā)生在放療結(jié)束后6周-13周），其中2級10例，3級8例。

表 1 患者一般資料Tab 1 General information of patients

2.2 放療前后患者血清中Ape1/Ref-1、ICAM-1、IL-17A的水平變化 放射性肺炎組放療前后Ape1/Ref-1水平無顯著性變化（P＞0.05）；放射性肺炎組與非放射性肺炎組Ape1/Ref-1水平無顯著性變化（P＞0.05）（表2）。與放療前相比，放療后放射性肺炎組ICAM-1水平上調(diào)幅度比非放射性肺炎組ICAM-1水平上調(diào)幅度大（P＜0.05）（表3）。放射性肺炎組患者的IL-17A水平在放療后顯著上升（P＜0.05），而非放射性肺炎組IL-17A水平放療前后水平無顯著性變化（P＞0.05）；放療后，放射性肺炎組IL-17A水平比非放射性肺炎顯著性升高（P＜0.05）（表4）。

2.3 IL-17A、ICAM-1變化和放射性肺炎發(fā)生的相關(guān)性 采用卡方檢驗進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)放療后與放療前相比血清中細(xì)胞因子IL-17A的變化和放射性肺炎發(fā)生具有明顯的相關(guān)性；而ICAM-1的變化與放射性肺炎的發(fā)生無明顯相關(guān)性（表5）。

2.4 不同部位放射劑量相關(guān)參數(shù)情況 放射性肺炎組和非放射性肺炎組大體靶區(qū)（GTV）平均劑量、最大劑量、最小劑量，肺臟V5、V10、V20、平均劑量，正常組織并發(fā)癥概率（NTCP），食管V45，心臟平均受照劑量，脊髓最大受照劑量等相關(guān)參數(shù)兩組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（表6）。

表 2 兩組放療前后血清Ape1/Ref-1水平測定結(jié)果比較（ng/mL）Tab 2 Comparisons of the serum Ape1/ ref-1 level during different groups (ng/mL)

表 3 兩組放療前后血清ICAM-1水平測定結(jié)果比較（ng/mL）Tab 3 Comparisons of the serum ICAM-1 level during different groups (ng/mL)

表 4 兩組放療前后血清IL-17A水平測定結(jié)果比較（ng/mL）Tab 4 Comparisons of the serum IL-17A level during different groups (ng/mL)

表 5 血清中細(xì)胞因子水平變化與放射性肺炎發(fā)生的關(guān)系Tab 5 The relationship analysis between cytokines levels and radiation pneumonitis

3 討論

晚期NSCLC是指不能手術(shù)的IIIa期和IIIb期病變，整體預(yù)后較差。目前，美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network, NCCN）等多個腫瘤研究組織均推薦同步放化療作為晚期NSCLC的標(biāo)準(zhǔn)治療模式。放射性肺損傷是肺癌放射治療過程中的主要劑量限制性并發(fā)癥，其在接受根治性放療的肺癌患者中的發(fā)生率約為13%-37%[1]。放射性肺損傷的發(fā)生發(fā)展包括肺泡上皮及內(nèi)皮細(xì)胞等的損傷、炎性因子的表達、纖維母細(xì)胞的增殖及纖維基質(zhì)的合成等過程，這些過程是通過一系列的細(xì)胞及細(xì)胞間信號的表達、傳導(dǎo)、放大、反饋及調(diào)節(jié)過程實現(xiàn)的[2,3]。通過發(fā)現(xiàn)放射性肺損傷發(fā)生發(fā)展過程中的標(biāo)記性細(xì)胞因子，有望為預(yù)測及早期發(fā)現(xiàn)放射性肺損傷的發(fā)生提供理論支持。誘導(dǎo)放射性肺損傷發(fā)生的因素可分為以下幾個方面：放射物理學(xué)方面如肺受照劑量-體積因素等劑量學(xué)方面；患者基本狀況如年齡、性別、既往肺病史、肺功能情況、吸煙史、營養(yǎng)狀況、合并癥；放射生物因素如患者內(nèi)在易感性生物學(xué)的特征、某些細(xì)胞因子活性的不同及其在治療中的變化與放射性肺炎的相關(guān)性不同?；熕幬锟赏ㄟ^直接細(xì)胞毒損傷、氧化損傷、炎性反應(yīng)介導(dǎo)損傷、膠原纖維合成與分解平衡破壞等機制導(dǎo)致肺損傷，同時放化療藥物還能阻礙機體對正常組織的修復(fù)。因此，同步放化療在提高肺癌療效的同時也增加了放射性肺炎的發(fā)生幾率[4]。因而有必要探尋可靠的生物學(xué)標(biāo)志分子來預(yù)測個體發(fā)生放射性肺炎的危險性，從而為個體化治療方案的制定提供幫助。

Ape1/Ref-1是一種高度保守的多功能大分子蛋白，Ape1和Ref-1這2個具有截然不同功能的亞基逐漸整合到一起，形成了一個密不可分的功能復(fù)合體[5]。研究表明，Ape1/Ref-1在多種惡性腫瘤中過度表達，其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[6-8]。另外一些研究發(fā)現(xiàn)，電離輻射可使肺組織細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞代償性合成Ape1/Ref-1蛋白，進一步調(diào)控參與細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，而隨著放射性肺損傷的進一步展，Ape1/Ref-1蛋白在肺損傷修復(fù)過程中的消耗超過了其在肺組織細(xì)胞的合成，從而造成放射治療組Ape1/Ref-1水平明顯低于未放射治療組[9]。余舒亮等[10]人的研究報道指出，電離輻射可以刺激APE1/Ref-1蛋白過表達，并可使其發(fā)生由核內(nèi)轉(zhuǎn)向胞漿和出現(xiàn)表達先增高后降低的特征，表明Ape1/Ref-1可以作為放射性肺損傷防治的分子靶點，在放射性肺損傷發(fā)生、發(fā)展過程中可能起著損傷修復(fù)的重要作用。本研究中檢測了68例晚期非小細(xì)胞肺癌患者在放療前后以及放療后，放射性肺炎發(fā)生組和未發(fā)生組組患者血清中Ape1/Ref-1的變化情況，均發(fā)現(xiàn)無論放療前后放射性肺炎組和非放射性肺炎組相比，Ape1/Ref-1均無明顯變化。因此，盡管Ape1/Ref-1與腫瘤的發(fā)生和放射性損傷密切相關(guān)，但其是否在預(yù)測放射性肺炎發(fā)生中有較為明確的指標(biāo)作用，仍有待于進一步研究。

表 6 兩組放射劑量相關(guān)參數(shù)比較Tab 6 Comparison of relevant parameters between RP and NRP groups

細(xì)胞間粘附分子-1（ICAM-1）是腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過程中非常重要的細(xì)胞因子，在多種類型的腫瘤組織中存在異常表達[11]。在關(guān)于不同組織器官的放射性損傷研究中，均發(fā)現(xiàn)ICAM-1與放射性損傷存在相關(guān)性[12-15]。但既往研究對患者基線水平一致性要求的不足，可能導(dǎo)致觀察結(jié)果出現(xiàn)偏倚。因此，我們在本次研究中僅納入基線水平無顯著差異的患者，在排除了放射物理因素可能導(dǎo)致的偏倚以后，分別檢測了放療前后患者血清中ICAM-1水平，發(fā)現(xiàn)放療前放射性肺炎組患者ICAM-1水平明顯高于非放射性肺炎組，而在放療后放射性肺炎組仍高于非放射性肺炎組，說明ICAM-1確實在肺癌患者血清中高表達，與之前研究一致，但通過相關(guān)性檢驗發(fā)現(xiàn)血清ICAM-1水平是否有顯著性（≥50%）變化與放射性肺炎的發(fā)生并無相關(guān)性。依據(jù)臨床標(biāo)準(zhǔn)，本研究規(guī)定50%為顯著和不顯著的標(biāo)準(zhǔn)，由于病例數(shù)較少，未能充分分析ICAM-1升高程度的不同與放射性肺炎的相關(guān)性，存在一定的局限性。

白細(xì)胞介素17A（interleukin 17A, IL-17A）作為一種促炎癥細(xì)胞因子，參與了慢性炎癥過程和自身免疫性疾病[16-17]。IL-17A能夠增加人成纖維母細(xì)胞黏附分子-1（ICAM-1）的表達，刺激上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、IL-8、G-CSF。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子白介素-6（IL-6）可以作為預(yù)測放射性肺炎的重要因子[3,18]。作為細(xì)胞產(chǎn)生IL-6的IL-17A，也可能成為預(yù)測放射性肺炎的重要因子。因此，本研究中也檢測了患者放療前后血清中IL-17A水平變化，發(fā)現(xiàn)放療前放射性肺炎組與非放射性肺炎組血清中IL-17A水平無明顯差異，放療后出現(xiàn)明顯的差異，相關(guān)性檢驗發(fā)現(xiàn)血清中IL-17A升高與放射性肺炎的發(fā)生成正相關(guān)。因此，IL-17A作為重要的促炎癥細(xì)胞因子之一，可能對放射性肺炎的發(fā)生有較好的預(yù)測價值。

綜上所述，本研究選取符合條件的68例晚期NSCLC同步放化療患者，檢測治療前后患者血清中Ape1/Ref-1、ICAM-1及IL-17A水平，發(fā)現(xiàn)血清中IL-17A可能會為預(yù)測放射性肺炎的發(fā)生提供有力參考。但是放射性肺損傷的發(fā)生是多種細(xì)胞因子參與的復(fù)雜過程，單個細(xì)胞因子的變化可能無法精準(zhǔn)反應(yīng)這一過程。應(yīng)用細(xì)胞因子預(yù)測放射性肺炎的發(fā)生時，需要對更多的細(xì)胞因子進行篩選，從而為尋找到更為有效的生物學(xué)參考指標(biāo)提供理論依據(jù)。