劉佳慧，劉 陽，王冬梅

(1.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；2. 西北民族大學(xué) 實驗中心，甘肅 蘭州 730030)

氧化和自由基的產(chǎn)生是機(jī)體衰老和疾病的最大威脅[1].糖尿病、心腦血管疾病、慢性腎功能衰竭、缺血-再灌注損傷、腫瘤以及衰老等均伴有氧應(yīng)激.植物中有效成分的藥理及對人類的保健作用等的研究已成為中藥材研究領(lǐng)域的熱點.植物天然總黃酮類物質(zhì)具有降血糖、降血脂、抗骨質(zhì)疏松、抗氧化和消除自由基等生物活性作用，還可降低罹患結(jié)腸癌、前列腺癌、乳腺癌等癌癥的風(fēng)險[2，3].植物提取物具有安全、穩(wěn)定、可控、無毒等優(yōu)點，因此，從植物中尋找高效、廉價、無毒的天然抗氧化劑已成為目前保健醫(yī)學(xué)發(fā)展的一個必然趨勢[4].

蒲公英[1](Taraxacum officnala)別號婆婆丁、丁奶奶、燈籠草及奶汁草等，是一種多年生草本植物和中藥材[5].其性味苦寒，具有消痛散結(jié)和利尿的作用，為中醫(yī)傳統(tǒng)清熱解毒藥物，賦有“天然抗生素”的美稱.蒲公英富含各類維生素及礦物質(zhì)，如鉀、鎂、鐵、鈣、銅等，含有多種活性成分，如生物堿類、有機(jī)酸類及黃酮類化合物等，報道具有抗腫瘤、防衰老、降血糖、降血脂等藥理功用[2，5]，國內(nèi)外均有對蒲公英整株抗氧化性的研究.

本實驗以本地產(chǎn)蒲公英的根為實驗材料，提取根中的總黃酮類物質(zhì)，對提取物的體內(nèi)抗氧化性活性進(jìn)行了探討，以期為本地蒲公英中生物活性物質(zhì)的研究和開發(fā)利用奠定一些實驗基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 原料、試劑與儀器

蒲公英：于9月底采摘于蘭州某高校榆中校區(qū)，依據(jù)《中國藥物志》本地生蒲公英屬藥用蒲公英(T. officnala).試樣預(yù)處理：經(jīng)恒溫干燥、粉碎后置于干燥容器中備用.

試驗動物：健康雄性小鼠36只，雌鼠24只，用基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為六組，每組雄鼠6只，雌鼠4只.分組后記錄每只體重約19 ～ 22g.

超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-px)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒；蘆丁、D-半乳糖、乙醇、乙醚、硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等均為分析純試劑.

設(shè)備及器材：干燥烘箱，離心機(jī)，電熱恒溫水浴鍋，紫外可見光分光光度計，粉碎機(jī)，玻璃勻漿器等.

1.2 實驗方法

1.2.1 蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色體系測定[6].分別移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0ml與25ml容量瓶中，初加30%乙醇至12.5ml，加入5% NaNO21ml，6min后加入10% Al(NO3)31ml，6min后加1mol/L NaOH 10ml，再用30%乙醇定容，搖勻，15min后以空白試劑為參比，510nm波長處測定吸光度.以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.2.2 蒲公英根總黃酮的提取

將采集的蒲公英根清洗晾曬，65℃干燥烘箱中烘干36h后粉碎，過80目篩，每次準(zhǔn)確稱取蒲公英根粉末5.0g，放入圓底燒瓶中，加入200ml無水乙醇，用索式提取法50℃下萃取2h，將所得溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸餾[2]濃縮得到總黃酮粗提取物.提取物中總黃酮定量以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用顯色體系進(jìn)行定量測定[7].總黃酮物質(zhì)的提取率計算公式：

提取率/%=C×V×n/m×100%

公式中，n:提取液稀釋倍數(shù)；C:被測液中黃酮類物質(zhì)濃度(g/mL)；V:提取液體積(mL)；m:蒲公英干粉的質(zhì)量(g).

1.2.3 動物抗氧化實驗

實驗設(shè)計共六組，分別為陰陽性對照組、模型組和給藥組.陽性對照組、模型組和給藥組皮下注射D-半乳糖300mg/(kg·d).造模同時各組灌胃給藥，小鼠每天灌胃一次，連續(xù)28天；陽性對照組蘆丁100mg/(kg·d)灌胃，陰性對照組灌等量生理鹽水，給藥組以分別高、中、低劑量提取物(50mg /(kg·d)、150mg /(kg·d)、300mg/(kg·d)灌胃.

1.2.4 測試樣品的處理和指標(biāo)檢測

動物喂養(yǎng)結(jié)束后，禁食12 h，摘眼球取血，3000 rpm離心5 min分離血清備用[5].頸椎脫臼法處死小鼠后無菌取出小鼠肝臟，用冰冷的生理鹽水洗滌數(shù)次，濾紙吸干水分，稱取0.5g放入無菌平皿中剪碎，轉(zhuǎn)入玻璃勻漿器，加相應(yīng)試劑盒中的提取液5ml，冰浴勻漿為10 % 的肝組織勻漿，4℃、8000g離心10min，取上清液置冰上待用.

小鼠血清和肝組織各指標(biāo)的檢測方法參照試劑盒說明.超氧化物歧化酶(SOD)活力采用羥胺法；谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-px)活力測定采用比色法；丙二醛(MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸(TBA)測定法.

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 蒲公英根總黃酮的提取

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液在509nm處有最大吸收峰，以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1.

擬合得回歸方程:Y=0.0744X+0.2946，R2=0.9995.蒲公英根總黃酮的提取率6.55%.董默[8]報道的蒲公英提取率為4.33%.本實驗總黃酮提取物的提取率較高，原因可能與取樣僅為蒲公英根部有關(guān)，有研究[6]認(rèn)為蒲公英整株中根的總黃酮含量最高.

2.2 提取物對SOD、GSH酶活性和MDA的影響

衡量抗氧化能力常用的指標(biāo)有超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)[7].用不同劑量蒲公英根的提取物對小鼠灌胃給藥后，提取物對小鼠血清和肝組織中SOD、GSH酶活性和MDA的影響，結(jié)果見表1～3.

圖1 蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 提取物對小鼠血清和肝組織中GSH-Px的影響(x±S，n=10) (x±S，n=10)

表3 提取物對小鼠血清和肝組織中MDA相對含量的影響(x±S，n=10)

從表中的實驗數(shù)據(jù)可以看出，實驗中衰老小鼠的模型造模是成功的.模型組與陰性對照組相比，小鼠的血清和組織中的SOD、GSH-Px的酶活力均下降顯著，MDA含量上升明顯(P<0.05).

超氧化物歧化酶( SOD) 是體內(nèi)一種重要的氧自由基清除劑，對機(jī)體的氧化與抗氧化平衡有著重要的作用.體內(nèi)自由基水平失衡時會導(dǎo)致腫瘤、衰老、炎癥等各種疾病[3]，SOD 能清除超氧離子自由基 O2-·，保護(hù)細(xì)胞免受損傷，其活力的高低與疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系.實驗數(shù)據(jù)顯示：低劑量給藥組和陰性對照組之間無顯著差異(P>0.05)，中、高劑量組和陽性對照組顯著高于陰性對照組(P<0.01)，蒲公英根提取物濃度與SOD活性呈正相關(guān)，酶的活性隨提取物濃度的增加而升高.中高劑量蒲公英根提取物可明顯提高小鼠血清和肝臟中SOD活性.

過氧化脂質(zhì)(LPO)是自由基對不飽和脂肪酸引發(fā)的脂質(zhì)過氧化作用的最終產(chǎn)物，其含量的多少反映組織細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化速率或強(qiáng)度.GSH-Px是細(xì)胞內(nèi)抗脂質(zhì)過氧化作用的酶性防御體系的主要成分，可催化LPO分解生成相應(yīng)的醇，防止LPO均裂和引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用的鏈?zhǔn)街ф湻磻?yīng)，減少LPO的生成以保護(hù)機(jī)體免受損害.本實驗中，提取物低劑量給藥組與陰性對照組間GSH-Px活性無顯著差異(P>0.05)，中、高劑量組GSH活性顯著高于陰性對照組(P<0.01)，蒲公英根提取物對GSH活性的影響呈正相關(guān).根提取物可清除脂類氫過氧化物，清除H2O2.

丙二醛(MDA)是體內(nèi)脂類過氧化物的主要代表，其水平的高低可以反映體內(nèi)不飽和脂質(zhì)的過氧化程度，間接地反映機(jī)體產(chǎn)生自由基的水平和細(xì)胞膜的損傷程度[8].實驗數(shù)據(jù)顯示，各處理組與陰性對照組中小鼠肝臟和血清中MDA的影響存在顯著差異(P<0.01)，低劑量組與陽性對照組之間無顯著差異(P>0.05)，隨著提取物濃度與MDA的含量呈負(fù)相關(guān).

近年來研究表明糖尿病和高血壓、慢性腎功能衰竭、缺血-再灌注損傷等以及衰老均伴有氧應(yīng)激.GSH-Px活性降低可能是動脈粥樣硬化發(fā)生的獨立危險因素，與動脈粥樣硬化、原發(fā)性高血壓、心肌炎等均密切有關(guān)[2，3，11].GSH-Px降低還可能與腦智力發(fā)育障礙，大腦缺血、缺氧損傷、神經(jīng)變性及重金屬中毒有關(guān).綜合分析實驗數(shù)據(jù)，陽性對照組與提取物中、高劑量給藥組中，小鼠血清和組織中的SOD、GSH-Px的酶活力、MDA含量相近，這些實驗組與模型組比較，實驗結(jié)果差異顯著(P<0.05)，說明中、高劑量的蒲公英根總黃酮提取物和蘆丁有相似的作用，能抵抗由D-半乳糖引起的衰老現(xiàn)象.

植物中有效成分的藥理及對人類的保健作用等的研究已成為中藥材研究領(lǐng)域的熱點[8].虎眼萬年青、銀杏葉、蒲公英、姜黃素和某些中草藥提取物中活性成分，如皂苷、生物堿、總黃酮、萜類內(nèi)酯、有機(jī)酸類、糖類、氨基酸類、香豆素類等的抗氧化研究均有文獻(xiàn)報道[9-11].

本實驗中，蒲公英根總黃酮的提取率達(dá)6.55%，中、高劑量根提取物可有效地提高機(jī)體內(nèi)SOD、GSH-Px的酶活力、降低MDA水平，說明甘肅本地生蒲公英根中總黃酮類物質(zhì)的含量較高，有較好的抗自由基、抗衰老的活性.作為天然抗氧化劑的來源，本地區(qū)蒲公英根有一定的開發(fā)和利用價值.