唐富琴 姜云瀚 朱雨 孟永勝 蹇朝 肖穎彬

心力衰竭(心衰)是各種心血管疾病發(fā)展的終末階段。其發(fā)病率逐年上升，已成為世界范圍內(nèi)的主要公共衛(wèi)生問題。我國衛(wèi)生部統(tǒng)計信息顯示，心血管疾病是我國居民第二位的死亡原因。其中，心力衰竭住院率占同期心血管疾病的20%，但死亡率卻高達(dá)40%，心力衰竭患者的5年生存率甚至低于許多惡性腫瘤[1]。我國現(xiàn)有超過400萬的心衰患者，每年醫(yī)療費(fèi)用超過100億元。隨著人口老齡化進(jìn)程，心力衰竭的發(fā)病率和醫(yī)療耗資必將繼續(xù)增長。盡管近二十年來在心力衰竭和臨床治療技術(shù)取得重大進(jìn)步，大大改善了心力衰竭的治療現(xiàn)狀，有效延長了患者的生存率并降低了慢性心力衰竭患者急性發(fā)作的機(jī)率，但是，這些治療策略只是在一定程度上延緩了心力衰竭的進(jìn)程，并沒有對心衰進(jìn)行早期干預(yù)[2-2]。而目前對于心衰的疾病進(jìn)程的具體情況并不清楚，特別是心肌肥厚如何失代償進(jìn)展為心衰的具體演變的過程和分子機(jī)制尚不清楚。

主動脈弓縮窄致左室肥厚模型是能有效模擬人心臟左室肥厚病理生理過程的動物模型。本實驗采用國際通用的雄性c57 小鼠主動脈弓縮窄術(shù)(Transverse aortic constriction, TAC)制備小鼠心肌肥厚模型，旨在觀察從心肌肥厚向心力衰竭的疾病進(jìn)展中心臟功能、心肌間質(zhì)和血流動力學(xué)的動態(tài)改變。

材料和方法

一、實驗材料和儀器

1. 實驗動物: 8～10周齡雄性c57小鼠50只，體重22～25 g，由陸軍軍醫(yī)大學(xué)(第三軍醫(yī)大學(xué))大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所提供。隨機(jī)分為對照組10只和TAC組40只。兩組按時間又分為1周組(n=9)、2周組(n=9)、4周組(n=10)和8周組(n=10)。

2. 主要試劑及儀器: 異氟烷、顯微器械、熒光倒置生物顯微鏡(德國萊卡DMI 3000B)、呼吸機(jī)(美國肯特醫(yī)療設(shè)備公司)、小動物麻醉機(jī)(美國Matrx),小動物超聲(VEV02100)、心導(dǎo)管儀(ADINSTRUMENTS)、氧氣。

二、實驗方法

1. 主動脈弓縮窄模型: c57小鼠吸入異氟烷麻醉后，然后氣管插管接呼吸機(jī)(呼吸頻率：120次/min，潮氣量：0.2 ml/次)?？梢娦乩S呼吸機(jī)頻率規(guī)整運(yùn)動。將小鼠仰臥固定在雙目體視顯微鏡下操作，取胸前正中切開皮膚，上至胸骨上窩，下至第二肋骨水平。用顯微鑷分離胸腺暴露主動脈弓，用5-0絲線在右頸總動脈分出處,用27 G針結(jié)扎，結(jié)扎確實后抽出針頭，逐層關(guān)胸，縫皮。關(guān)麻醉機(jī)，皮下注射0.5 ml生理鹽水，待小鼠自主呼吸后脫機(jī)拔管。以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。正常對照組開胸后不做結(jié)扎縫合皮膚。

2. 取材和檢測： 在TAC術(shù)后第1周、第2周、第4周、第8周，用小動物超聲檢測TAC組和正常對照組的心臟功能和心臟結(jié)構(gòu)變化，用心導(dǎo)管檢測兩組的血流動力學(xué)情況。肝素化兩組小鼠，靜脈注射飽和氯化鉀后取出心臟，稱取心臟重量，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，進(jìn)行HE染色和Masson染色，分別觀察心肌結(jié)構(gòu)改變和纖維化情況。

3. 小動物超聲評價心臟功能： 用1%戊巴比妥鈉(80 mg/kg)麻醉小鼠，仰臥位固定，沿胸骨旁長軸和短軸切面觀察，在二尖瓣腱索乳頭肌平面，取平均5個心動周期測量得出左心室后壁舒張末厚度(left ventricular posterior wall thickness of diastole, LVPWd)，左心室后壁收縮末厚度(left ventricular posterior wall thickness of systole, LVPWs)以及左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction, LVEF)和左心室縮短分?jǐn)?shù)(left ventricular fractional shortening, LVFS)[4]。

4. 心導(dǎo)管檢測血流動力學(xué)變化： 用1%異氟烷吸入麻醉小鼠，取仰臥位固定，分離并暴露右頸總動脈，5～0絲線結(jié)扎遠(yuǎn)心端，眼科剪在動脈上剪一小口，Miller導(dǎo)管從開口處進(jìn)入右頸總動脈，將導(dǎo)管送入左心室，固定導(dǎo)管。觀察波形和壓力-體積環(huán)的形態(tài)，記錄左心室內(nèi)壓最大上升速率(dp/dt max)、左心室舒張末期壓力(left ventricular end-diastolic pressure, LVEDP)和左心室收縮末期壓力(left ventricular end-systolic pressure, LVESP)。

5. HE染色觀察心肌結(jié)構(gòu)改變： 石蠟包埋心臟后，自心底向心尖以3 μm厚度切片。進(jìn)行HE染色，在普通光鏡下觀察心肌細(xì)胞和心肌間質(zhì)的排列和結(jié)構(gòu)等病理學(xué)改變并拍照。

6. Masson染色觀察纖維化情況： 將石蠟切片脫蠟，用Harris′s蘇木素染核10 min，用水沖洗后，用麗春紅-酸性復(fù)紅染色液染色10 min，用水沖洗，1%磷鉬酸處理5 min，1%亮綠SF染色10 min，用水沖洗，無水乙醇脫水、透明、中性樹脂封片。晾干后在光學(xué)顯微鏡下觀察，用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)分析膠原含量。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

分析采用SPSS 20.0軟件，作圖使用Graphpad prism 6.0軟件。計量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組比較采用單因素方差分析，組間比較采用Tukey法。計數(shù)資料采用率表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、主動脈弓縮窄模型的手術(shù)情況

TAC組小鼠40只，術(shù)后存活38只，死亡2只，1只由于結(jié)扎彎鉤抽離時損傷主動脈弓引起出血死亡，1只由于主動脈弓破裂引起死亡，主動脈弓縮窄手術(shù)總成功率為95%，見圖1。術(shù)后一周時，用超聲對TAC組所有的存活的小鼠進(jìn)行主動脈狹窄處進(jìn)行評價，TAC組小鼠均可見狹窄處彩色血流，血流速度增加，峰值血流500 mm/s以上，管腔直徑狹窄66%左右。存活的小鼠造模成功率為100%。

二、各時間點(diǎn)兩組小鼠心臟超聲情況

與對照組比較，縮窄2周后，縮窄組小鼠左心室射血分?jǐn)?shù)開始顯著降低(P<0.05)，左心室縮短分?jǐn)?shù)開始顯著降低(P<0.05)。LVPWd在縮窄2周開始明顯增加(P<0.05)，而在縮窄8周時降低至和對照組水平相當(dāng)(P>0.05)。LVPWs在縮窄8周時明顯降低(P<0.05)。超聲結(jié)果提示TAC 2周開始小鼠左心室肥厚，代償反應(yīng)逐漸增強(qiáng)，到TAC 8周時已進(jìn)入失代償期，后壁收縮末厚度降低，收縮能力明顯下降，心功能顯著下降，見圖2。

三、各時間點(diǎn)兩組小鼠血流動力學(xué)情況

與對照組相比，從縮窄1周開始，LVEDP開始明顯升高(P<0.05)，到縮窄8周時降低至于對照相當(dāng)水平(P>0.05)；LVESP從縮窄1周開始明顯升高(P<0.05)。dp/dt max在縮窄2周升高(P<0.05)，在縮窄8周時降低(P<0.05)。血流動力學(xué)的結(jié)果提示，從縮窄2周開始，心室內(nèi)壓力出現(xiàn)明顯的代償反應(yīng)， 到縮窄8周，心肌進(jìn)入失代償階段，收縮能力明顯降低，見圖3。

圖1 主動脈縮窄模型的手術(shù)圖片；注：A：暴露并分離主動脈弓(7.5×)；B：結(jié)扎27G針頭和主動脈弓(7.5×)；C．抽離27G針頭，建立主動脈弓縮窄(7.5×)

圖2 手術(shù)后8周時兩組的超聲結(jié)果；注：A：對照組超聲圖；B：對照組的血流圖；C：TAC 8周組的超聲圖；D：TAC 8周組的血流圖；E：各時間點(diǎn)兩組的射血分?jǐn)?shù)；F：各時間點(diǎn)兩組的縮短分?jǐn)?shù)；G：各時間點(diǎn)兩組的左心室后壁舒張末厚度；H：各時間點(diǎn)兩組的左心室后壁收縮末厚度。*與對照組相比，P<0.05；#與TAC 2周組相比，P<0.05；※與TAC 4周組相比，P<0.05

圖3 小鼠心導(dǎo)管的手術(shù)圖片及心導(dǎo)管測量結(jié)果；注：A：暴露并分離右側(cè)頸內(nèi)動脈(7.5×)；B：導(dǎo)管插入右側(cè)頸內(nèi)動脈并固定(7.5×)；C：各時間點(diǎn)兩組的左心室舒張末壓力；D：各時間點(diǎn)兩組的左心室收縮末壓力；E：各時間點(diǎn)兩組的左心室內(nèi)壓最大上升速率；*與對照組相比，P<0.05；#與TAC 2周組相比，P<0.05；※與TAC 4周組相比，P<0.05

四、各時間點(diǎn)兩組小鼠的大體標(biāo)本情況

與對照組相比，縮窄2周開始，心臟體重比和肺臟體重比明顯增加(P<0.05)。從大體標(biāo)本上，可觀察到縮窄8周的肺水腫明顯，肺臟呈粉紅色，見圖4。

五、病理組織學(xué)變化

HE染色發(fā)現(xiàn)，對照組心肌纖維排列正常,無血管擴(kuò)張及血管壁增厚等表現(xiàn)，而縮窄8 周的心肌細(xì)胞胞漿變寬，細(xì)胞核變大，心肌細(xì)胞排列不整齊、著色不均勻，細(xì)胞間連接松散。Masson染色可見，縮窄1周開始心肌纖維化程度明顯增加(P<0.05)，縮窄8周時，血管周圍纖維化和間質(zhì)纖維化明顯，以血管周圍纖維化為主，見圖5。

討 論

心力衰竭是最常見的心血管疾病之一，近年發(fā)病率和病死率逐漸升高。雖然每年有大量心衰相關(guān)的研究成果發(fā)表，但目前心衰的治療仍不理想，僅僅以延緩疾病進(jìn)程的治療為主[5-6]。而心衰疾病進(jìn)展的具體機(jī)制和確切的疾病分期方法均不清楚，只有在更為精確的疾病分期方法的基礎(chǔ)上，心衰的早期治療才能更好實現(xiàn)[7-8]。

圖4 小鼠主動脈縮窄模型的心臟和肺臟的大體觀；注：A：對照組心臟的大體照片(10×)；B：對照組肺臟的大體照片(10×)；C：TAC 8周組心臟大體照片；D：TAC 8周組肺臟大體照片；E：各時間點(diǎn)兩組的心臟體重比；F：各時間點(diǎn)兩組的肺臟體重比；*與對照組相比，P<0.05，#與TAC 2周組相比，P<0.05；※與TAC 4周組相比，P<0.05

本研究通過建立小鼠主動脈弓縮窄模型，觀察心臟超負(fù)荷引發(fā)的心肌肥厚，最終引起心衰的演變過程，來探討心衰各時期具體改變，為進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)機(jī)制研究提供模型平臺。在本實驗中，縮窄1周時，長時間的壓力負(fù)荷增加，最先表現(xiàn)為左心室收縮末壓力升高，在心臟代償反應(yīng)中，逐漸出現(xiàn)左心室舒張末壓力升高，提示心肌舒張功能逐漸受損。同時心臟逐漸出現(xiàn)纖維化?？s窄2周至縮窄4周時，隨著壓力負(fù)荷的持續(xù)存在，心肌的收縮功能逐漸出現(xiàn)功能不全，表現(xiàn)為射血分?jǐn)?shù)和縮短分?jǐn)?shù)逐漸降低，左心室內(nèi)壓最大上升速率增加，肺臟體重比明顯增加。心臟開始出現(xiàn)結(jié)構(gòu)性改變，心肌細(xì)胞肥大，心肌間質(zhì)增加，表現(xiàn)為左心室后壁舒張末厚度逐漸增加，纖維化進(jìn)一步加重，心臟體重比明顯增加?？s窄8周時，長時間持續(xù)的壓力負(fù)荷引起心臟功能失代償，射血分?jǐn)?shù)和縮短分?jǐn)?shù)進(jìn)一步降低，左心室內(nèi)壓最大上升速率明顯降低，肺臟體重比進(jìn)一步增加，左心室舒張末壓力較前降低至正常值。心臟結(jié)構(gòu)進(jìn)一步改變，左心室后壁舒張末厚度和收縮末厚度不同程度減少，纖維化程度進(jìn)一步加重，心臟體重比進(jìn)一步增加。因此，本模型很好的模擬了持續(xù)壓力負(fù)荷引起心衰發(fā)生和進(jìn)展的整個演變過程。同時，為后續(xù)研究各階段心衰的不同的機(jī)制提供了動物模型基礎(chǔ)。

以往的研究一般都集中于某一個時間點(diǎn)，而沒有觀察心衰進(jìn)展的各個階段的變化。主動脈縮窄模型主要研究以大鼠為主[9-14]。由于c57小鼠與人類基因組相似程度最高，能很好反映人類疾病的病理生理學(xué)改變，因此，用小鼠作為TAC模型可更好的模擬心衰過程。而小鼠TAC模型研究中，其病變又以縮窄2周和4周改變?yōu)橹?，而對于心衰失代償階段和心衰早期的研究均非常缺乏[15-20]。

本文探討壓力負(fù)荷引起心衰的疾病演變的過程，主要關(guān)注心臟結(jié)構(gòu)和血流動力學(xué)的動態(tài)改變。發(fā)現(xiàn)左心室舒張末壓力是射血分?jǐn)?shù)降低前的一個早期指標(biāo)，為進(jìn)一步早期診斷和干預(yù)心衰提供了基礎(chǔ)。