駱金紅，苑洪霞 ，王 鑫，張 勇，陳 祥

（貴州大學(xué)高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州省動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025）

白洗豬又稱苗寨豬，原產(chǎn)于施秉縣白洗鄉(xiāng)（今楊柳塘鎮(zhèn)），是貴州省東南部的一個(gè)地方豬品種[1]，具有肌纖維細(xì)膩、肌肉系水能力強(qiáng)[2]、不含氟烷基因[3]、生長(zhǎng)緩慢、瘦肉率低[4]等特點(diǎn)。LYRM1 （LYR Motif Containing 1）基因是應(yīng)用抑制性差減雜交技術(shù)從肥胖與正常人網(wǎng)膜脂肪組織中篩選出的差異性高表達(dá)基因，其開放閱讀框369 bp，定位于人染色體16P11.2，mRNA全長(zhǎng)1 589 bp，包含3個(gè)內(nèi)含子和4個(gè)外顯子，編碼122個(gè)氨基酸[5-6]，具有促進(jìn)前體脂肪細(xì)胞增殖、抑制其凋亡的作用[6-7]，可為提高瘦肉率以改善白洗豬肉質(zhì)提供參考[8]。對(duì)白洗豬LYRM1基因5個(gè)外顯子進(jìn)行多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)，LYRM1基因不具多態(tài)性，在多個(gè)物種間進(jìn)化上高度保守。與LYRM1基因一樣，LYRM2（LYR Motif Containing 2）基因也是LYR復(fù)合體1超家族成員[9-10]，定位于人類第6號(hào)染色體的長(zhǎng)臂15區(qū)，在人類、小鼠、犬、大鼠和斑馬魚中高度保守，編碼88個(gè)氨基酸[9,11]。目前，關(guān)于白洗豬、DBF1（杜洛克與白洗豬的雜交一代）豬的LYRM1和LYRM2基因的研究較少。因此，開展白洗豬、DBF1豬的LYRM1和LYRM2基因的研究對(duì)白洗豬種質(zhì)資源開發(fā)及利用具有較高的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 從白洗豬種質(zhì)資源保護(hù)中心選取10月齡健康白洗豬8頭、DBF1豬6頭，屠宰后立刻采集心、肝、脾、肺、腎、胃、皮下脂肪、背最長(zhǎng)肌，用錫箔紙包好并標(biāo)記，保存液氮中，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 組織RNA的提取與cDNA第1鏈的合成 采用Trizol法提取總RNA，HiFiScript cDNA第1鏈合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄mRNA獲得cDNA，均用超微量紫外分光光度計(jì)和凝膠電泳分別測(cè)量其濃度和純度。

1.2.2 引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank提供的LYRM1基因序列（XM_005662096.2）、LYRM2基因序列（XM00 3121299.3）和GAPDH基因序列（NM_001206359.1）設(shè)計(jì)引物，引物由上海生物技術(shù)有限公司合成（表1）。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR條件優(yōu)化及反應(yīng) 按照SYBR Green 1試劑盒推薦體系，在其他條件相同的情況下，對(duì)退火溫度和引物濃度進(jìn)行摸索、優(yōu)化，篩選最佳退火溫度和引物濃度。反應(yīng)體系為10 μL：Master mix 5.8 μL，上、下游引物各 0.6 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 1 μL。95℃ 預(yù)變性10 min，95℃變性 13 s；58℃退火28 s；72℃延伸32 s，43個(gè)循環(huán)，95℃，15 s，最后從60℃到95℃按0.5℃增值進(jìn)行熔解曲線分析，熒光采集時(shí)間為5 s。本實(shí)驗(yàn)采用的最佳引物濃度為100 ng/μL，每個(gè)樣品進(jìn)行3管平行實(shí)驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用 2-△△Ct法[12]分析 LRYM1、LYRM2基因在白洗豬和DBF1豬的心、肝、脾、肺、腎、胃、皮下脂肪、背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)水平。應(yīng)用Excel 2013進(jìn)行前期數(shù)據(jù)的排序等整理，應(yīng)用SPSS 19.0中Duncan's法在0.01和0.05水平進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 組織 RNA的特異性檢測(cè) 提取RNA的A260/A280均在1.8～2.0，表明提取的RNA質(zhì)量較好；凝膠電泳鑒定發(fā)現(xiàn)28 s、18 s條帶清晰、未出現(xiàn)拖尾和降解（圖1），滿足下一步實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 不同組織LYRM1、LYRM2和GAPDH基因提取RNA的凝膠電泳圖

2.2 LYRM1、LYRM2基因各組織PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)用反轉(zhuǎn)錄獲得的組織cDNA為模板進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物（圖2），可見(jiàn)產(chǎn)物清晰度高、特異性強(qiáng)，未發(fā)現(xiàn)有引物二聚體，且擴(kuò)增片段與目的片段大小一致，可用于下一步實(shí)驗(yàn)。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR產(chǎn)物特異性 擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，LYRM1、LYRM2基因擴(kuò)增曲線均呈現(xiàn)“S”形，無(wú)明顯上揚(yáng)趨勢(shì)且整體平行性較好（圖3）；LYRM1、LYRM2基因熔解溫度分別是76.7、76.1℃，熔解曲線均呈單峰，無(wú)引物二聚體，無(wú)雜峰，符合實(shí)驗(yàn)要求。

圖2 LYRM1、LYRM2和GAPDH基因普通PCR驗(yàn)證凝膠電泳圖

圖3 LYRM1（左）、LYRM2（右）基因擴(kuò)增曲線

2.4 LYRM1基因在白洗豬和DBF1豬不同組織中的表達(dá) LYRM1基因表達(dá)量的分析發(fā)現(xiàn)，LYRM1基因在白洗豬和DBF1豬心、肝、脾、肺、腎、胃、皮下脂肪、背最長(zhǎng)肌中均有表達(dá)，在皮下脂肪組織中高表達(dá)，在背最長(zhǎng)肌低表達(dá)（圖4）。

圖4 LYRM1基因在白洗豬和DBF1豬8個(gè)組織中的相對(duì)表達(dá)量

LYRM1基因表達(dá)量在白洗豬中8個(gè)組織中高低順序?yàn)槠は轮荆灸I＞肝＞胃＞脾＞肺＞心＞背最長(zhǎng)肌，其中，皮下脂肪組織中表達(dá)量極顯著高于其他各組織（P＜0.01），其他各組織之間無(wú)顯著差異。LYRM1基因表達(dá)量在DBF1豬中高低順序?yàn)槠は轮荆靖危疚福灸I＞肺＞心＞脾＞背最長(zhǎng)肌，皮下脂肪組織中表達(dá)量極顯著高于其他各組織（P＜0.01），除皮下脂肪，胃、腎、肝表達(dá)量顯著高于心、脾、肺、背最長(zhǎng)肌（P＜0.05），其中，肝與其他各組織達(dá)到差異極顯著水平（P＜0.01）。LYRM1基因表達(dá)量在白洗豬和DBF1豬各組織間均未達(dá)到差異顯著水平。

2.5 LYRM2基因在白洗豬和DBF1豬組織中的表達(dá)LYRM2基因在白洗豬和DBF1豬8個(gè)組織中均有表達(dá)，且表達(dá)趨勢(shì)為皮下脂肪組織中最高，背最長(zhǎng)肌中最低，且皮下脂肪中表達(dá)量與其他各組織差異極顯著（P＜0.01）（圖5）。在白洗豬中，LYRM2基因表達(dá)量高低順序?yàn)槠は轮荆酒ⅲ靖危灸I＞肺＞心＞胃＞背最長(zhǎng)肌，除皮下脂肪，脾、肝中表達(dá)量顯著高于心、胃、腎、肺、背最長(zhǎng)?。≒＜0.05）。在DBF1豬中，LYRM2基因表達(dá)量高低順序?yàn)槠は轮荆灸I＞肺＞胃＞肝＞心＞脾＞背最長(zhǎng)??；除皮下脂肪，胃、腎、肺中表達(dá)量顯著高于心、脾、肝、背最長(zhǎng)?。≒＜0.05），其中腎中表達(dá)量與其他6個(gè)組織中表達(dá)量差異極顯著（P＜0.01）。白洗豬皮下脂肪中LYRM2基因表達(dá)量顯著高于DBF1豬（P＜0.05）。

圖5 LYRM2基因在白洗豬和DBF1豬8個(gè)組織中的相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用SYBR Green I熒光嵌合染料法[13-14]檢測(cè)白洗豬和DBF1豬LYRM1、LYRM2基因 mRNA的相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)熔解曲線呈單峰且無(wú)其他雜峰，表明所用引物特異性良好[15]。LYRM1基因是在人網(wǎng)膜脂肪組織中高度表達(dá)的基因，具有抑制前體脂肪細(xì)胞的凋亡、促進(jìn)前體脂肪細(xì)胞增殖的功能[6]。但是，LYRM1基因過(guò)表達(dá)則會(huì)下調(diào)3T3-L1 脂肪細(xì)胞中線粒體的代謝關(guān)鍵酶基因表達(dá)水平，提示LYRM1基因可能參與調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞線粒體的代謝，從而影響脂肪細(xì)胞的凋亡和增殖[16]。張翔等[17]發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可能通過(guò)降低LYRM1 mRNA水平來(lái)抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖。邱潔等[5]應(yīng)用在線分析工具分析LYRM1基因的mRNA序列，發(fā)現(xiàn)存在多個(gè)與肥胖密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，提示該基因可能受到其他脂代謝調(diào)節(jié)基因的調(diào)控。Li等[18]發(fā)現(xiàn)，LYRM1基因可能通過(guò)脂肪沉積對(duì)秦川牛肉質(zhì)性狀有潛在的影響，可用于標(biāo)記輔助選種。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LYRM1 mRNA在白洗豬和DBF1豬心、肝、脾、肺、腎、胃、皮下脂肪、背最長(zhǎng)肌均有表達(dá)，總體趨勢(shì)趨于一致，均在皮下脂肪組織中表達(dá)最高，背最長(zhǎng)肌組織中表達(dá)最低，與邱潔等[6]的研究結(jié)果相一致。白洗豬皮下脂肪組織中LYRM1基因表達(dá)水平均高于DBF1豬，推測(cè)白洗豬瘦肉率低可能與LYRM1基因高表達(dá)有關(guān)，雜交有望提高DBF1豬瘦肉率。

LYRM2和LYRM1基因同是LYR復(fù)合體1超家族成員[9-10]，這個(gè)家族被認(rèn)為可能參與了真核細(xì)胞NADH復(fù)合體的組成。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LYRM2基因在白洗豬和DBF1豬中均有表達(dá)，且在皮下脂肪組織中表達(dá)最高，背最長(zhǎng)肌中表達(dá)最低，與LYRM1基因在白洗豬和DBF1豬中表達(dá)情況類似。白洗豬和DBF1豬皮下脂肪組織中，LYRM1基因表達(dá)量均高于LYRM2，推測(cè)LYRM1基因在皮下脂肪沉積中較LYRM2基因發(fā)揮著更大的作用。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研究顯示，LYRM1和LYRM2基因表達(dá)均高于白洗豬和DBF1豬的皮下脂肪組織，相對(duì)低于背最長(zhǎng)肌，且表達(dá)趨勢(shì)趨于一致，LYRM1基因在白洗豬皮下脂肪組織中表達(dá)水平略高于DBF1豬，LYRM2基因在白洗豬皮下脂肪組織中的表達(dá)水平顯著高于DBF1豬。本研究結(jié)果表明，LYRM1與LYRM2基因可能為影響豬脂肪沉積的候選基因。