陳福祥，路欽越，陳 蘭，郭艷麗，莫魁霞，吳鵬飛，張跟喜，王金玉

（揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009）

Smad蛋白（Drosophila Mothers Against Decapentaplegic Protein）家族是把轉(zhuǎn)化生長因子β（Transforming Growth Factor-β， TGF-β）與其受體結(jié)合后產(chǎn)生的信號從細(xì)胞質(zhì)傳導(dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)的信號分子，且不同的Smad介導(dǎo)不同的TGF-β家族的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[1]。目前為止，已有8種Smad成員被報(bào)道，分別是Smad1～Smad8。按照結(jié)構(gòu)和功能將Smad家族分為限制型Smads（R-Smad）、共有型 Smads（Co-Smad）和抑制型Smads（I-Smad）3類[2]。Smad3屬于限制型 Smads，是TGF-β誘導(dǎo)生長中重要的介導(dǎo)因子。Smad3對細(xì)胞生長作用是雙向的，既有促進(jìn)，又有抑制，具體機(jī)制目前尚未完全清楚。Verrecchia等[3]研究表明，Smad3是抑制細(xì)胞和組織纖維化的關(guān)鍵基因。雞的Smad3基因位于10號染色體，基因總長度為60 196 bp，由9個外顯子組成。Smad3基因翻譯可產(chǎn)生2種功能的蛋白質(zhì)，一種mRNA（NM_204475.1）全長1 280 bp，編碼426個氨基酸殘基，另一種mRNA（XM_015292068.1）全長1 201 bp，編碼321個氨基酸殘基。劉育林[4]使用電子克隆方法預(yù)測并通過分子生物手段克隆了雞Smad3的cDNA，發(fā)現(xiàn)雞Smad3在各種組織中廣泛表達(dá)，在雞骨骼肌發(fā)育過程中Smad3表達(dá)下調(diào)。關(guān)于Smad3基因?qū)﹄u經(jīng)濟(jì)性狀的影響，僅檢索到魏岳[5]的一篇報(bào)道，其研究發(fā)現(xiàn)邊雞Smad3基因外顯子8處的1個突變與MSTN基因G2283A位點(diǎn)的基因型組合對生長和屠體性狀有顯著或極顯著的影響。

本研究采用PCR-SSCP技術(shù)檢測到京海黃雞Smad3基因第6、7外顯子的多態(tài)性，并結(jié)合生長性狀進(jìn)行相關(guān)分析，旨在探討Smad3基因作為京海黃雞生長性狀遺傳標(biāo)記的可能性，為京海黃雞生長性狀標(biāo)記輔助選擇提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 349只飼養(yǎng)條件相同的京海黃雞來自江蘇京海禽業(yè)集團(tuán)有限公司，記錄京海黃雞初生重和2、4、6、8、10、12、14、16周齡體重。翅靜脈采集血樣1.5 mL，肝素鈉抗凝，-20℃保存。采用常規(guī)酚-氯仿抽提法提取DNA，用分光光度計(jì)（NanoDrop 1000，Thermo Fisher）測定基因組DNA的OD值，記錄后放置在-20℃冰箱備用。

1.2 引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增 根據(jù)GenBank已發(fā)表的雞Smad3基因序列（NC_006097.4），采用Primer5.0針對Smad3基因的外顯子6和外顯子7分別設(shè)計(jì)1對引物。引物序列信息見表1。

PCR反應(yīng)體系為20 μL：上、下游引物各0.8 μL（10 μmol/L）；2×Taq Master Mix for PAGE （Dye plus）10 μL；超純水 7.4 μL；DNA 模板 1 μL。

PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，用56℃退火30 s（PCR梯度試驗(yàn)獲得P1和P2最佳退火溫度均為56℃），72℃延伸30 s，30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min，4℃保存。

1.3 PCR-SSCP分析和DNA測序 2.5 μL PCR產(chǎn)物和7 μL變性劑混合后98℃變性10 min，迅速放置冰盒上，在-20℃冰箱里放置6 min，使溫度迅速下降。加5 μL變性產(chǎn)物（在冰盒上操作）在30%的聚丙烯酰胺凝膠（丙烯酰胺∶雙丙烯酰胺=29:1）孔中。首先在250 V電壓下電泳10 min，待條帶明顯分層后用120 V電壓跑14 h（P2的產(chǎn)物跑15 h）。電泳結(jié)束后，進(jìn)行銀染顯色并用紫外凝膠成像系統(tǒng)照相分析。不同基因型挑選3個個體送上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 將不同基因型個體分類并統(tǒng)計(jì)數(shù)目，計(jì)算基因型頻率和基因頻率以及雜合度（He）、有效等位基因數(shù)（Ne）和多態(tài)信息含量（PIC）。配合下列模型進(jìn)行最小二乘法分析，比較京海黃雞的生長性狀在Smad3不同基因型間的差異：

模型中，yij為性狀的測定值；μ為群體平均值；Gi為基因型效應(yīng)；eij為隨機(jī)殘差。統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測結(jié)果 利用所設(shè)計(jì)的引物分別對Smad3基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物用30%的變性聚丙烯酰胺凝膠（29:1）電泳檢測，通過DL500 DNA Marker（Sangon Biotech）比對發(fā)現(xiàn)P1引物片段出現(xiàn)在250 bp左右的位置，P2引物片段出現(xiàn)在200 bp左右的位置，與目的片段一致，而且條帶清晰，特異性好，可用于SSCP分析。

2.2 Smad3基因PCR-SSCP分析及測序結(jié)果 Smad3基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)過SSCP分析后，發(fā)現(xiàn)第6外顯子和第7外顯子分別出現(xiàn)不同的基因型，第6外顯子2種基因型分別命名AA和AB（圖1），第7外顯子3種不同的基因型分別命名為TT、TM和MM（圖2）。不同基因型的PCR產(chǎn)物的DNA測序結(jié)果顯示，Smad3基因第6外顯子上的第53424堿基發(fā)生T→C的突變（圖3），命為g.T＞C53424；Smad3基因第7外顯子上的第54959堿基發(fā)生C→G突變（圖4），命為g.C＞G54959。2.3 Smad3基因多態(tài)性數(shù)據(jù)分析 由表2可見，對于Smad3基因來說，不論是第6外顯子還是第7外顯子，均表現(xiàn)為雜合型個體所占的比重最高，純合型所占的比重小，AB和TM是優(yōu)勢基因型，A和T是優(yōu)勢基因，g.T＞C53424位點(diǎn)和g.C＞G54959均屬于中度多態(tài)，遺傳差異較大。

圖1 基因型AA和AB條帶

圖2 基因型TT、TM和MM條帶

2.4 Smad3基因與體重的相關(guān)分析 由表3可知，在京海黃雞2～16周齡階段，基因型AB個體體重均大于AA個體，且8周齡時差異顯著（P＜0.05），所以雜合子是生長性狀的優(yōu)勢基因型。對于外顯子7處的突變，TT、TM和MM 3種基因型從初生重到16周齡的體重差異均不顯著（P＞0.05），TT基因型的體重最小。

表1 引物序列信息

圖3 AA和AB基因型序列比對

圖4 TT、TM和MM 3種基因型序列比對

3 討 論

關(guān)于Smad3基因的功能已有一定的研究報(bào)道。王運(yùn)濤等[6]研究發(fā)現(xiàn)，野生型Smad3基因抑制間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）增殖，并通過非細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）通路促進(jìn)MSC向成骨分化和成熟。阮井玲[7]研究發(fā)現(xiàn)，Smad3基因通過正向調(diào)節(jié)抑制素基因GDF-8，負(fù)向調(diào)節(jié)生肌調(diào)節(jié)因子MyoD基因，表明Smad3基因?qū)ωi肌肉生長有一定的調(diào)控作用。Shi等[8]檢測到的4個SNP位點(diǎn)與中國牛Smad3基因表達(dá)及生長性狀顯著相關(guān)。以上研究結(jié)果表明，Smad3基因?qū)Σ煌锓N的生長性狀具有影響。當(dāng)前Smad3基因多態(tài)性的研究主要集中在人上，如Zhang等[9]研究發(fā)現(xiàn)，Smad3基因可能與膝關(guān)節(jié)炎發(fā)育有關(guān)；Turner等[10]通過全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)1個單核苷酸多態(tài)性與增強(qiáng)子活性和Smad3基因表達(dá)相關(guān)，會改變?nèi)藙用}平滑肌的增殖；Wang等[11]研究Smad3在甲狀腺乳頭狀癌遺傳易感性中的作用時發(fā)現(xiàn)1個25 kb的單倍型，單核苷酸多態(tài)性豐富，可為甲狀腺癌的前期診斷提供依據(jù)。

魏岳[5]報(bào)道，邊雞Smad3基因外顯子8處的1個突變與MSTN基因G2283A位點(diǎn)的基因型組合對生長和屠體性狀有顯著或極顯著的影響。本實(shí)驗(yàn)以Smad3基因作為影響京海黃雞生長性狀的的候選基因，在第6、7外顯子共檢測到 2處突變（g.T＞C53424和g.C＞G54959），PIC分別是0.315和0.349，都屬于中度多態(tài)，說明所選群體遺傳變異較大。這2處突變均未導(dǎo)致編碼氨基酸的改變，為同義突變。關(guān)聯(lián)分析顯示，g.T＞C53424位點(diǎn)僅對京海黃雞的8周齡體重有顯著影響，而g.C＞G54959位點(diǎn)對京海黃雞各周齡體重影響都不顯著，說明這2個位點(diǎn)不是影響京海黃雞生長性狀重要位點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)對京海黃雞繁殖性狀以及其他雞品種重要經(jīng)濟(jì)性狀的遺傳效應(yīng)有待進(jìn)一步研究。

表2 Smad3基因的多態(tài)性

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)在京海黃雞Smad3基因第6外顯子和第7外顯子分別發(fā)現(xiàn)1個多態(tài)位點(diǎn)，第6外顯子的多態(tài)位點(diǎn)僅對京海黃雞的8周齡體重有顯著影響，而第7外顯子的多態(tài)性位點(diǎn)對各階段體重沒有顯著影響。綜上所述，檢測到的Smad3基因多態(tài)位點(diǎn)對京海黃雞的體重增長有一定影響，但不適合作為京海黃雞生長性狀的有效遺傳標(biāo)記。