張 禹，李麗娟，鐘佳琳，雷初朝，陳 宏，黃永震*

（1.西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，陜西楊凌 712100；2.貴州工程應用技術學院畢節(jié)試驗區(qū)研究院，貴州畢節(jié) 551700）

Altman和Cech發(fā)現(xiàn)了RNA的“酶”作用，為人類探索生命的奧密打開了一扇新的大門。Cech[1]用原始RNA世界、當代RNA世界、RNA技術和生物醫(yī)學應用的世界概括了RNA領域的發(fā)展及未來。在這3個RNA世界當中，非編碼RNA（Non-coding RNA，ncRNA），即那些目前大家認為不作為蛋白翻譯模板（mRNA）的各種RNA，在基因的表達調(diào)控中起著至關重要的作用，對于動物的育種工作具有指導意義。

1 ncRNA在基因表達中的調(diào)控作用

調(diào)控基因表達是ncRNA的一個核心功能。例如，在X染色體失活過程中，Xist（An Essential lnc RNA for X Chromosome Inactivation）與 XCI（X-chromosome Inactivation）位點相互作用，引起該染色體構(gòu)象變化，更加容易與各種蛋白因子相結(jié)合，最終導致X染色體失活[2-3]。近年來研究人員對ncRNA做了大量研究，其中，以非編碼長鏈RNA（lncRNA）、miRNA和環(huán)狀RNA（circRNA）的研究為主。同時，研究還發(fā)現(xiàn)相當數(shù)目的ncRNA調(diào)控轉(zhuǎn)錄都是通過別位作用（Trans Effect）完成的，即調(diào)控離此ncRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生處距離較遠位點的基因表達或染色質(zhì)表觀遺傳狀態(tài)。

1.1 miRNA對基因表達的調(diào)控 之前大多數(shù)研究認為，miRNA在細胞漿中通過結(jié)合靶基因3′UTR抑制或降解mRNA，從而導致翻譯的終止或抑制，最終造成相應功能的障礙，以此機制來發(fā)揮負調(diào)控作用[4]。但也發(fā)現(xiàn)部分miRNA所在基因組的位置與一些增強子區(qū)域重疊，于是便引出了miRNA與增強子有何關系的疑問，并成功通過后來的一些研究證明了miRNA是一種雙功能分子[5]。當miRNA位于細胞核中時，通過結(jié)合增強子改變其染色質(zhì)狀態(tài)激活表達；而在胞漿中時，則可通過作用于mRNA 3′UTR區(qū)域阻斷翻譯（圖1）[5]。研究人員把定位于核內(nèi)并具有激活作用的RNA稱為NamiRNA（Nuclear Activating miRNA）。基于此，提出了NamiRNA-增強子靶基因網(wǎng)絡激活模型[5]，用于揭示miRNA在細胞核內(nèi)的功能，并可借此模型解釋一些表達上調(diào)現(xiàn)象，如腫瘤細胞中的“上調(diào)基因”。

圖1 miRNA在胞漿與胞核中的雙向性功能[5]

1.2 lncRNA對基因表達的調(diào)控 lncRNAs雖然很久以前就被發(fā)現(xiàn)，但直到近年才逐漸被關注。lncRNAs對于基因的表達調(diào)控滲透在基因表達的每一個階段：表觀遺傳水平調(diào)控、轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控、翻譯水平調(diào)控[6]。在表觀遺傳水平，主要通過介導組蛋白修飾與甲基化來改變?nèi)旧|(zhì)表觀狀態(tài)，從而影響基因的正常表達。如HOTAIR可以通過對蛋白PRC2、LSD1、CoR-RESTREST的招募，完成對于人類HoxD基因表達的調(diào)控[7]。在基因的轉(zhuǎn)錄過程中，一些lncRNA可通過干擾轉(zhuǎn)錄因子與啟動子的結(jié)合干擾轉(zhuǎn)錄。如DHFR上游的1個lncRNA能與DHFR啟動子形成RNA-DNA螺旋結(jié)構(gòu)，抑制轉(zhuǎn)錄因子TFIID的結(jié)合，從而抑制DHFR基因表達[8]。在轉(zhuǎn)錄完成后，lncRNA可與miRNA相互作用參與轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控、可作為小RNA的前體、調(diào)控mRNA的選擇性剪接、影響mRNA穩(wěn)定性。如NLC1-C也稱為基因間RNA162（LINC00162），在細胞核中可抑制miR-320a和miR-383的轉(zhuǎn)錄，進而成功地對人類精子發(fā)生進行調(diào)節(jié)[9]。在mRNA翻譯階段，lncRNA可在翻譯起始及延伸階段進行調(diào)控改變蛋白活性，或與特定蛋白結(jié)合，改變其在胞質(zhì)中的定位[10]。

1.3 circRNA對基因表達的調(diào)控 circRNA作為ncRNA，廣泛存在于生物細胞內(nèi)，且占據(jù)了約所有轉(zhuǎn)錄本的10%[11]。然而，由于技術限制，早在1976年植物中就發(fā)現(xiàn)了的circRNA，在被驗證之前，一直被認為是mRNA合成過程中錯誤剪接的產(chǎn)物。直到2012年被證實，circRNA穩(wěn)定且廣泛地存在于包括人類在內(nèi)的真核生物界[12]。至此，circRNA的存在再次引起了研究者的廣泛重視。已發(fā)現(xiàn)的circRNA的主要作用是調(diào)節(jié)基因表達，具體機制主要包括以下3種[13]。

1.3.1 miRNA分子海綿作用 一些circRNA上具有miRNA結(jié)合位點，能夠競爭性結(jié)合miRNA，從而抑制其對相應mRNA的降解作用，主要見于外顯子構(gòu)成的circRNA（如CDR1as、circRNA-SRY以及circRNA-ZNF19等）。哈佛醫(yī)學院Salmena等[14]的ceRNA調(diào)控假說在2011年7月做出了合理推斷。ceRNA具有數(shù)量和種類不等的MRE（miRNA應答元件，miRNA Response Element），可競爭性結(jié)合miRNA，降低miRNA對靶基因的負性調(diào)控。在李強等[15]對circRNA的miRNA海綿功能的檢測實驗中，以人胚胎細胞HEK293T、人工合成的has_circ_0000254的全長序列和突變序列、miR-125b、inhibitor及Mir-NC和Trans1 T1 感受態(tài)細胞為材料，采用雙熒光素酶報告基因法進行實驗，結(jié)果顯示miR-125b能通過結(jié)合hsa-circ-000254影響熒光素酶報告載 體 psiCHECK2-has_circ_0000254（C254） 熒 光 活性改變，miR-125b inhibitor能封閉miR-125b與hsacirc-000254結(jié)合影響其熒光活性改變。

1.3.2 調(diào)控經(jīng)典的RNA剪接 以MBL的表達為例[16]。circMbl是muscleblind基因的第2個外顯子形成的circRNA。muscleblind基因編碼剪接因子MBL（甘露糖結(jié)合凝集素），與mRNA的穩(wěn)定性密切相關。circMbl的側(cè)翼內(nèi)含子上具有很多MBL蛋白結(jié)合位點，可以特異性結(jié)合MBL蛋白，二者的結(jié)合促進circMbl的產(chǎn)生，而circMbl的產(chǎn)生則進一步結(jié)合MBL蛋白促進circMbl的產(chǎn)生。circRNA是通過轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的，經(jīng)典的mRNA剪接與外顯子的環(huán)化作用是相互競爭的，因此經(jīng)典的mRNA剪接就會被競爭性的抑制，即muscleblind基因相關mRNA的剪接會因此而受到抑制。

1.3.3 與轉(zhuǎn)錄調(diào)控原件結(jié)合調(diào)控母基因的轉(zhuǎn)錄 有研究顯示，有些circRNA分子可以通過吸附蛋白質(zhì)因子，影響蛋白功能從而參與到基因的表達調(diào)控中[17]。如ciankrd52可與RNA聚合酶復合體相互作用，從而影響該酶的活性，最終達到調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的作用。Li等[18]研究發(fā)現(xiàn)，ElciRNA（如circPAIP2）能夠與U1互補配對，進而與U1小核核糖核蛋白（U1small Nuclear Ribonucleoproteins，snRNP）相互作用，從而順式調(diào)控作用促進自身編碼基因轉(zhuǎn)錄。

2 ncRNA對于動物育種的重要意義

2.1 ncRNA對于動物育種的重要作用

2.1.1 ncRNA對繁殖的影響 許多研究表明，miRNA在卵泡的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用[19]。Tesfaye等[20]通過研究體外成熟與未成熟牛卵母細胞發(fā)現(xiàn)了59種miRNA的差異表達，其中，31個miRNA優(yōu)先在未成熟牛卵母細胞中表達，28個優(yōu)先在成熟牛卵母細胞表達。有研究發(fā)現(xiàn)，通過人為干擾降低miRNA會導致卵母細胞發(fā)育受阻，降低排卵率，對雌性生殖造成影響[21]。

lncRNA在哺乳動物精子的生長發(fā)育過程中有著重要的作用[22]。HongrES2是一個長1 588 bp的lncRNA，特異性地在附睪尾部區(qū)域表達，該轉(zhuǎn)錄物優(yōu)選位于細胞核中，在細胞核中它被加工成23bp miRNA類小RNA，稱為mil-HongrES2，其抑制附睪特異性蛋白CES7的表達，從而抑制其膽固醇酯酶活性，調(diào)節(jié)精子的成熟[23]。

由此可見，ncRNA在動物生殖細胞生長發(fā)育過程中具有一定的調(diào)控作用。目前，關于各類家畜有關繁殖性能的基因已經(jīng)有相當多的研究，并且，自2002年lncRNA正式被提出到2010年報道lncRNA可調(diào)控細胞重編程，再到Weikard等[24]利用RNA深度測序，發(fā)現(xiàn)牛皮膚組織中存在4 848個潛在的長鏈非編碼RNA，再到Y(jié)ue等[25]發(fā)現(xiàn)lncYYW在成肌細胞分化過程中上調(diào)表達，過表達lnc YYW能增加細胞周期中S期的細胞數(shù)目，不難發(fā)現(xiàn)目前關于ncRNA對基因表達調(diào)控的研究也在快速發(fā)展。若能將ncRNA作為調(diào)控相關基因的重要工具，在原有的分子標記輔助選擇（MAS）基礎上加入ncRNA對于基因表達調(diào)控的內(nèi)容，將會對品種改良與新品種的培育有很大幫助。

2.1.2 ncRNA對胚胎發(fā)育的影響 近些年的研究表明，ncRNA在胚胎發(fā)育的各個時期都發(fā)揮著重要作用。Dicer酶突變的斑馬魚的卵母細胞和受精卵在胚胎發(fā)育過程中出現(xiàn)了嚴重缺陷但可通過體外注射成熟miRNA恢復正常的實驗表明，miRNA對于胚胎發(fā)育具有重要作用[26-28]。在ncRNA對早期胚胎發(fā)育影響的研究中，Elmira等[29]在非洲爪蟾胚胎上通過使用HTSeq根據(jù)Tophat將轉(zhuǎn)錄表達轉(zhuǎn)換為了RPKM值，并通過高斯過程模擬了表達。在眾多l(xiāng)ncRNA中發(fā)現(xiàn)了8個lncRNA可能對早期胚胎的發(fā)育具有調(diào)控作用。同時，有研究表明，HOTAIR通過反式作用調(diào)控在動物胚胎早期發(fā)育中對細胞的分化至關重要的Hox基因的表達[30]。在關于胚胎后期發(fā)育的相關研究中，Boris等[31]對胎盤中基因端粒較長做出了解釋，胎盤中的低甲基化有利于lncRNA TERRA的表達，而在癌細胞的研究中發(fā)現(xiàn)TERRA可以通過與端粒酶的結(jié)合抑制端粒酶的作用，因此胎盤中的端粒酶因受高表達的TERRA的抑制而降低了對胎盤中基因端粒的損傷，造成胎盤中端粒較長的現(xiàn)象。Zhang等[32]使用短干擾RNA對As-api5表達的下調(diào)導致A.sinica的死亡率和胚胎畸形增加。其實驗結(jié)果表明，API5在胚胎滯育終止和早期胚胎發(fā)育中起關鍵作用。miRNA在胚胎干細胞增殖與自我更新方面也具有重要的作用，小鼠miR-290-295（人miR-371-373家族）在其中高度表達，而在其他組織表達下調(diào)，且有研究闡明了一個新的ESC的維持和增殖中β-catenin/LEF1-miR-372和miR-DKK1正反饋調(diào)節(jié)循環(huán)[33]?？梢?，ncRNA的調(diào)控作用存在于動物從胚胎發(fā)育到胎兒誕生的各個時期，并且一些ncRNA對于某些在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用的基因具有調(diào)控作用。

2.1.3 ncRNA對表觀遺傳的影響 ncRNA存在并在體細胞和生殖細胞中起作用。體細胞中的ncRNA變化導致mRNA轉(zhuǎn)錄組改變，而種系ncRNA可能介導表觀遺傳記憶的傳播。在受精過程中，精子與卵子在結(jié)合時都攜帶了部分RNA（mRNA與ncRNA）。Carrell等[34]通過表觀遺傳記憶的研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境導致的表觀特征會通過雄性精子遺傳給后代，ncRNA可能是DNA序列與其最終表觀遺傳狀態(tài)之間的連接。Bony等[35]在分析由類視黃醇誘導的鼠類ES細胞中Hox簇的轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳學特征的動態(tài)變化中發(fā)現(xiàn)，來自Hox簇的2條ncRNA可代表ES細胞中快速誘導產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物，并且它們與動態(tài)表觀遺傳學變化相關。該團隊解釋了Hox B簇中的ncRNA（Hobbit1）和Hox編碼基因的共調(diào)節(jié)是由共享的RARE依賴性增強子介導的。ncRNA可以通過影響基因組的表觀遺傳修飾來直接作用于表觀遺傳學水平，或者通過控制表觀遺傳調(diào)節(jié)劑的表達，從而間接誘導表觀遺傳改變。

自克隆羊“多利”誕生以來，克隆技術在各國快速發(fā)展起來，雖然在人類方面涉及倫理問題還有待商榷，但在動物方面可謂前景廣闊。然而，在目前的克隆技術中，存在的最大問題是成功率極低。Ibtishama等[36]指出，由于各種原因?qū)е驴寺∈。ㄔ缙诤屯砥趬櫶?、免疫系統(tǒng)受損、循環(huán)和呼吸問題以及高死亡率，且失敗多發(fā)生于克隆體出生前，其主要原因似乎是非典型表觀遺傳重編程，即在受精卵最初幾次卵裂中，去甲基化酶清除了DNA分子上幾乎所有從親代遺傳來的甲基化標志；在胚胎植入子宮時，一種新的甲基化遍布整個基因組，甲基化酶使DNA重新建立一個新的甲基化模式[37]。而在這一過程中，許多克隆胚胎卻顯示總體DNA甲基化模式異常。然而，在顧永娟等[38]關于胃癌中ncRNA與DNA甲基化的關系綜述中列舉了大量有關ncRNA以及DNA甲基化相互調(diào)控的研究，指出啟動子區(qū)域的異常甲基化可能導致miRNA的異常表達，而miRNA并不只受表觀遺傳機制調(diào)控，也能通過直接作用于DNMT、HDAC和組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶（HMT）調(diào)控表觀遺傳修飾從而調(diào)控DNA甲基化和組蛋白修飾過程。且ncRNA可通過影響與重編程相關的基因的表達調(diào)控細胞的重編程過程[39]。ncRNA的作用與克隆的成功與否有可能具有一定的聯(lián)系，在這一過程中對于ncRNA作用的研究或許有助于提高克隆技術的成功率與準確性。而克隆技術的成熟對于動物遺傳育種的研究及應用將會有極大的推進作用。

2.2 ncRNA在動物育種上的探索 對于ncRNA的研究表明，ncRNA在表達上具有組織特異性，即在不同的組織中或組織的不同時期有著不同表達量的ncRNA參與細胞基因表達等生命活動。因此目前關于ncRNA對于動物生產(chǎn)性能的影響也大多是依據(jù)這個思路。

近期在產(chǎn)奶性能方面有一些新的發(fā)現(xiàn)。金晶等[40]以泌乳期高乳品質(zhì)和低乳品質(zhì)中國荷斯坦奶牛乳腺組織作為實驗對象，通過高通量測序技術檢測miRNA，發(fā)現(xiàn)了56個差異表達miRNA，并成功預測了相關功能靶基因CSN3、SCD、LALBA和DGAT2。紀志賓[41]研究表明，miR-143與IGFBP5在不同泌乳時期乳腺組織表達趨勢相同，均在泌乳高峰期低表達，且發(fā)現(xiàn)miR-143靶向IGFBP5 3'-UTR，并正向調(diào)控其表達；miR-143延緩了乳腺上皮細胞周期進程，可抑制乳腺上皮細胞的增殖，并促進其凋亡。林先滋等[42]研究表明，F(xiàn)ASN（脂肪酸合酶基因）與BTN1A1（嗜乳脂蛋白基因）的3'UTR上的結(jié)合位點分別有3個和2個，其中miR-103位于BTN1A1的靶位點與已知物種間同源性較高。Wang等[43]的研究表明，miR-221、miR-33b、miR-31在奶牛泌乳期高表達，而miR-223在泌乳高峰期則下降。胎衣不下奶牛母體胎盤中bta-miR-31與正常排出組奶牛相比表達量明顯偏高[44]。這些研究表明，ncRNA的差異表達與奶牛的產(chǎn)奶相關性狀的差異相關聯(lián)?？梢宰鳛榻窈罄胢iRNA調(diào)控奶牛產(chǎn)奶性能的重要依據(jù)。miRNA在奶牛乳腺發(fā)育和泌乳機理方面的研究才剛剛起步[45]。

在肌肉調(diào)控方面，尤其是對于豬肉與牛肉的研究較多。miR-206作為在2012年以前發(fā)現(xiàn)唯一在骨骼肌中特異表達的miRNA，其表達異常與一些肌肉相關疾病如肌肉營養(yǎng)不良、肌萎縮性側(cè)索硬化癥等有關[46]。HMGCS1基因?qū)τ谪i的骨骼肌發(fā)育具有一定影響，而miRNA-18a/b則可通過調(diào)控HMGCS1的表達間接影響骨骼肌的發(fā)育[47]。王亞輝等[48]通過在牛骨骼肌中做EDU增殖發(fā)現(xiàn)，mir-133b對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖具有促進作用。在牛肌內(nèi)脂肪的研究中發(fā)現(xiàn)，牛肌內(nèi)脂肪和皮下脂肪組織確實存在一些差異表達的miRNAs[49]，根據(jù)其在相關信號通路中的富集程度可推測其作用機制，如miR-27b的預測靶基因在MAPK信號通路中富集度最高，可推測其作用機制并進行下一步研究。大量研究表明，miRNA對于骨骼肌性狀或其他性能有具有調(diào)控作用。Sun等[50]研究表明，lncRNA同樣可以調(diào)控這些性狀，一種在成肌細胞分化過程中逐漸上調(diào)的新型肌肉特異性RNA lnc MD，其表達上調(diào)和沉默可以引起肌原性標志物——肌球蛋白重鏈（MHC）和肌細胞生成素（Myo G）的上調(diào)和下降。Jin等[51]發(fā)現(xiàn)，通過過表達或抑制lnc133b可促進衛(wèi)星細胞分化的增殖或抑制；Li等[52]發(fā)現(xiàn)了一種脂肪細胞分化中差異表達的lncRNA并命名為脂肪細胞分化相關長鏈ncRNA（ADNCR），可通過作為miR-204的競爭性內(nèi)源RNA（ce RNA）抑制脂肪細胞分化。以上研究表明，不僅miRNA對于動物生產(chǎn)性能具有調(diào)控作用，lncRNA也有，很有可能circRNA等其他ncRNA都有這方面的作用。最初認為在分子層面是表達的基因片段對性狀的調(diào)控起作用，然而現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)miRNA、lncRNA也可以。由于性狀是多方面協(xié)調(diào)作用最終的結(jié)果，如未對這一體系有確切了解，在動物育種工作中將無法保證準確度與效率。

對于不同畜禽及ncRNA的作用也開展了相關研究。截止2015年,已報道的豬miRNAs僅有326個，且miRNAs調(diào)控豬脂肪發(fā)育的研究十分欠缺[53]。顧真真等[54]研究發(fā)現(xiàn)，lnc LER在盧氏綠殼蛋母雞各組織中均有表達，尤其在產(chǎn)蛋高峰期肝臟中的表達量較高。作為lncRNA而廣為人知的H19轉(zhuǎn)錄物（印記的母本表達轉(zhuǎn)錄物），被認為H19基因啟動子區(qū)甲基化非常可能參與了遼寧絨山羊次級毛囊的轉(zhuǎn)錄抑制[55]。miR-191、miR-25-3p、SNORD44和SNORD48在懷孕和未懷孕的母牛體內(nèi)均出現(xiàn)了差異表達[56]，可利用這一特點作為檢測參考標準。譚婭等[57]通過對豬心肌與骨骼m(xù)iRNA轉(zhuǎn)錄組的比較分析揭示了二者生理學特征不同的原因。miRNA因這一特性而成為了獸藥研究領域中最有利的生物標志物的候選者[58]。

3 展 望

ncRNA因其功能特性而具有與DNA 同樣重要的地位，但同時它作為基因表達過程的中間調(diào)控工具而非遺傳信息本質(zhì)。隨著分子生物技術的不斷發(fā)展，越來越多的ncRNA被發(fā)現(xiàn)，其功能和結(jié)構(gòu)研究也越來越深入。對這些ncRNA的研究仍將是不斷地發(fā)現(xiàn)新的ncRNA及新的ncRNA的調(diào)控機制及作用的過程。ncRNA很可能對于克隆技術的成功起著重要的作用，但仍有待研究和證明；ncRNA在畜禽遺傳育種方面表現(xiàn)出了巨大的潛力，但國內(nèi)外的研究目前都還很少，國內(nèi)尤為匱乏。因此，參照基因研究過程中的基因文庫，建立ncRNA 文庫，可為推進ncRNA的研究及實際生產(chǎn)應用提供幫助。