郝建，郝華，徐芬，徐靜，張建，李里香，曾磊

(1蚌埠市第三人民醫(yī)院，安徽蚌埠233000；2南昌大學第二附屬醫(yī)院)

敗血癥是重癥醫(yī)學科的常見病癥，臨床表現(xiàn)為全身系統(tǒng)性炎癥應答，可由細菌感染或外傷引起，最常見的病因為革蘭陰性菌中的脂多糖(LPS)刺激。敗血癥發(fā)生的病理生理過程中常伴有腫瘤壞死因子α(TNF-α)的大量釋放，引起細胞和組織的過度氧化應激，造成細胞和組織的廣泛損傷。核因子E2相關因子2(Nrf2)參與炎癥的啟動、發(fā)生發(fā)展過程及氧化應激的調控過程[1～3]。Nrf2作為氧化還原反應中的關鍵酶，調控了抗氧化反應元件和其下游所編碼的很多二期解毒酶和抗氧化酶，其中包括醌氧化還原酶(NQO1)、血紅素加氧酶1(HO-1)等。單核-巨噬細胞在敗血癥及腫瘤等諸多病理過程中扮演重要角色。LPS可誘導單核細胞內HO-1表達增加。前期研究[4～6]結果表明，脂氧素及其類似物BML-111在抗炎、促進炎癥消退方面發(fā)揮重要作用。本研究以人單核細胞株U937為研究對象，以LPS模擬炎癥模型，采用BML-111預處理U937細胞，觀察BML-111對炎癥狀態(tài)U937細胞中氧化應激標志物表達的影響，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要實驗材料 人單核細胞株U937購于中科院上海生化與細胞生物學研究所，用含20%胎牛血清、雙抗的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5%CO2、37 ℃。當80%～90%的細胞融合時進行傳代，取第3～5代細胞進行后續(xù)實驗。RPMI1640干粉購于美國GIBCO公司。TRIzol試劑購于美國Invitrogen公司。逆轉錄試劑、PCR擴增儀均購于美國MJ Research公司。兔抗人Nrf2抗體購于美國Santa Cruz公司。FITC熒光二抗(山羊抗兔)購于武漢博士德公司。BML-111購于美國Cayman公司。LPS購自美國Sigma公司。胎牛血清購于杭州四季青生物工程有限公司。羥乙基哌嗪乙硫磺酸及L-谷胺酰胺、雙抗均購于Amresco公司。PCR引物由上海賽百盛公司合成。

1.2 炎癥細胞模型制作及BML-111給藥方法 將U937細胞分為對照組、模型組、實驗組。對照組不加入藥物；模型組加入1 μg/L[7,8]的LPS制作炎癥模型；實驗組先加入200 μg/L[7]的BML-111預處理30 min后再加入1 μg/L的LPS。

1.3 各組細胞中Nrf2蛋白檢測 將U937細胞接種于24孔板，待細胞生長融合至30%時按“1.2”中的分組進行給藥，作用24 h后棄上清液，部分細胞即黏附于蓋玻片上。用PBS沖洗2次，加入冰甲醇漿培養(yǎng)板放置在-20 ℃冰箱固定約10 min。用濃度為0.2%的Triton PBS洗2次，再用濃度為0.5%的Triton PBS破膜10 min，PBS沖洗5 min。采用濃度為5%的牛血清白蛋白(BSA)封閉約40 min。加入Nrf2一抗后放置于4 ℃冰箱孵育4 h后，PBS沖洗3次、每次5 min，用FITC標記的熒光二抗在室溫條件下孵育約1 h，最后用Hoechest33258染料染細胞核約15 min。在熒光顯微鏡下觀察Nrf2的表達定位，拍照，采用Image J軟件對熒光圖片進行半定量分析，以熒光強度表示Nrf2的表達水平。每組實驗均重復3次。

1.4 各組細胞中Nrf2、NQO1、HO-1、TNF-α mRNA檢測 采用TRIzol試劑提取細胞總RNA，逆轉錄為cDNA，進行PCR反應。以GAPDH為內參。PCR反應總體積為25 μL，其中包括12.5 μL的PCR混合液，5 mmol/L的上、下游引物各1 μL，1.5 μL的cDNA，其余用無菌水補足總體積。基因引物用Primer5.0軟件設計，目的基因、內參基因的引物序列和相應的反應條件見表1。將上述樣本放置在PCR擴增儀上進行擴增，產物用1.6%瓊脂糖凝膠進行電泳，采用凝膠成像系統(tǒng)對條帶進行半定量統(tǒng)計學分析。實驗均重復3次。各目的基因的相對表達量以目的基因的拷貝數(shù)與GAPDH基因的拷貝數(shù)之比表示。

2 結果

對照組細胞中Nrf2蛋白主要定位于胞核與胞質；模型組細胞中Nrf2蛋白主要定位于胞核，即從胞質轉位至核內；實驗組Nrf2蛋白表達定位與對照組相近。對照組、模型組、實驗組細胞中Nrf2蛋白相對表達量分別為1.000 0±0.065 57、2.223 3±0.080 21和0.973 3±0.045 09；模型組Nrf2蛋白相對表達量高于對照組，實驗組Nrf2蛋白相對表達量低于模型組(P均<0.05)。模型組中Nrf2、NQO1、HO-1、TNF-α mRNA相對表達量高于對照組，實驗組細胞中Nrf2、NQO1、HO-1、TNF-α mRNA相對表達量低于模型組(P均<0.05)。詳見表2。

表1 目的基因、內參基因的引物序列及PCR反應條件

表2 各組U937細胞中Nrf2、NQO1、HO-1、TNFα mRNA表達比較

3 討論

單核-巨噬細胞在炎癥及腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色。巨噬細胞在致炎因子的作用下，發(fā)揮其氧化應激作用，目的是消除病原體、清除腫瘤細胞，維持機體內環(huán)境的穩(wěn)定。但如果機體的炎癥反應過強，勢必造成細胞和組織的過度損傷，不利于組織修復。有學者認為腫瘤即是慢性炎癥經(jīng)久不愈的結果。因此，如何使炎癥可控，如何使腫瘤組織中的炎癥及時消退，成為當前炎癥領域研究的熱點。

氧化應激是指機體在一些有害因子的作用下，產生過多的活性氧簇(ROS)和活性氮自由基(RNS)，而機體的清除能力有限，從而導致氧化與抗氧化平衡被打破的病理過程。各種炎癥過程特別是敗血癥(LPS引起)的發(fā)生涉及了氧化應激過程，其中發(fā)揮主要作用的是各種炎細胞包括單核細胞。敗血癥的促發(fā)因素有很多，主要包括細菌感染(內毒素釋放)、缺血、缺氧等因素，其中細菌感染是最常見的病因。在氧化應激過程中，Nrf2發(fā)揮著調控功能。ROS能激活轉錄因子如Nrf2、NF-κB的表達。Nrf2作為氧化還原反應中的關鍵酶，調控抗氧化反應元件和其下游所編碼的許多二期解毒酶和抗氧化酶，其中包括NQO1、HO-1等。脂氧素類似物BML-111在體內和體外實驗中都表現(xiàn)出強大的抗炎和促炎癥消退功能。前期研究[9]表明，脂氧素能緩解大鼠缺血缺氧性腦損傷。在大鼠體內實驗中發(fā)現(xiàn)，BML-111能減輕肝損傷和肝纖維化[4,5]。脂氧素還能調控RAW264.7細胞的細胞周期[6]，而且在調節(jié)細胞間的免疫反應、抑制腫瘤等多方面發(fā)揮著重要作用[10,11]。新近研究[12]表明，脂氧素A4(LXA4)能明顯抑制LPS誘導的HK2細胞的氧化應激。

本研究發(fā)現(xiàn)，在LPS的作用下，Nrf2蛋白及基因表達明顯增強，意味著巨噬細胞內抗氧化酶系統(tǒng)增強。而在BML-111預處理后，U937細胞中Nrf2、NQO1、HO-1基因表達明顯減弱，以促進細胞氧化應激，更好地發(fā)揮其氧化吞噬及抗炎功能。生理狀態(tài)下，Nrf2與Keapl結合，在細胞內處于失活或抑制狀態(tài)。而在外界刺激因素作用下，細胞內的Nrf2蛋白與Keapl蛋白發(fā)生分離，Nrf2蛋白轉位至核內，這樣Nrf2就可以與抗氧化反應元件ARE上的相應位點進行結合，從而啟動下游酶的表達，發(fā)揮抗氧化功能[13～19]。NQO1是細胞內的一種黃素酶，可調節(jié)細胞的氧化還原狀態(tài)，抑制氧化應激。HO-1蛋白的激活可由很多因素誘導，如內毒素、高熱、缺氧等，對機體具有保護作用。炎癥過程中，通常伴有促炎細胞因子的釋放，TNF-α即是炎癥過程中非常重要的促炎因子。本研究發(fā)現(xiàn)，BML-111能明顯抑制LPS誘導的TNF-α表達。還有研究[20，21]發(fā)現(xiàn)，Nrf2還在腫瘤發(fā)生及腫瘤耐藥方面發(fā)揮著關鍵作用，因此推測BML-111在抗腫瘤方面的作用也可能與Nrf2密切相關。

綜上所述，BML-111預處理后，炎癥狀態(tài)的U937細胞中Nrf2蛋白核轉位受抑制，Nrf2蛋白及其下游基因表達下調，TNF-α基因表達下調；BML-111可能是通過調節(jié)Nrf2蛋白及其下游基因表達、下調TNF-α表達從而發(fā)揮抗氧化應激作用。本研究結果為BML-111用于治療敗血癥及炎癥相關性腫瘤提供了新的實驗依據(jù)。然而BML-111調控Nrf2的具體信號通路非常復雜，有待進一步深入研究，并需要在動物模型上進一步驗證上述實驗結果。