李 合, 王人衛(wèi), 趙 璨, 劉曉麗, 洪潤肖

(1. 上海師范大學 體育學院，上海 200234；2. 上海體育學院 運動科學學院，上海 200438；3. 湖北民族學院 體育學院，湖北 恩施 445300)

由于長期處于高強度的運動訓練應激，女性運動員發(fā)生月經周期紊亂的比例要遠高于普通人[1]。長期月經周期紊亂可影響骨代謝，不利于骨骼健康[2-4]，并且會對運動員以后的生育健康埋下隱患[5]。研究發(fā)現(xiàn)，長期高強度運動訓練狀態(tài)下，機體攝入的能量遠不能滿足運動所需要的能量，造成機體可利用能量的負平衡是引起月經周期紊亂的起始因素[6-7]。因此，增加可利用能量的攝入和降低運動量及強度是緩解月經周期紊亂的方法[8]。在實際訓練中，為了提高或維持運動能力，采用降低運動量及強度對于運動員而言不現(xiàn)實，而通過增加可利用能量攝入的方法具有實用意義[9]。本文通過補充低聚糖的方法，探討在外源性能量補充的情況下，是否可以緩解動情周期抑制大鼠的HPO軸(hypothalamus-pituitary-ovarian axis)激素釋放紊亂，為運動員月經周期紊亂的防治提供理論基礎。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象 選取由上海實驗動物資源中心西普爾-必凱實驗動物有限公司提供的健康成熟2月齡雌性SD大鼠36只，平均體質量為(200.0±5.9) g。將符合國家飼料衛(wèi)生標準的嚙齒類動物飼料(由上海仕林生物科技有限公司提供，產品標準編號為Q/TJCX 1-2007)作為基礎標準飼料(1 337 kJ/100 g，每100 g飼料中含有脂肪4 g、蛋白質19 g、糖類52 g)。低聚糖干預組所用的低聚糖由河北華辰淀粉糖有限公司提供，生產許可證號為QS130123010057，質量管理體系認證證書編號為00109Q23299R0M/1300。本實驗設計通過上海市營養(yǎng)學會醫(yī)學倫理委員會的鑒定，并接受其監(jiān)督([倫審]2013-002)。

1.2 研究方法

1.2.1 分組及干預方法 選取2月齡SD雌性大鼠36只，在適應運動2周后，隨機分為4組，每組9只。為了全面觀察實驗組的干預效果，對照組設計為2組，分別為陰性對照組(negative control group，Nco組)，該組為常規(guī)對照組，不進行運動訓練，以維持正常的動情周期；陽性對照組(postive control group，Pco組)，該組為動情周期抑制模型組，進行9周運動訓練，前6周為遞增負荷訓練，后3周為恒定負荷訓練，以維持動情周期抑制狀態(tài)。

實驗組設計為2組，前6周均采用遞增負荷訓練，后3周采取不同的干預方式，其中后3周不再進行運動訓練，只進行安靜休息的為安靜休息組(rest intervention group，Res組)，用于觀察安靜休息的干預方法對動情周期抑制的緩解作用，并與補充低聚糖的干預方法進行效果比較；繼續(xù)進行3周恒定負荷訓練，采用低聚糖進行補充的為低聚糖補充組(oligosaccharide intervention group，Oli組)。實驗組的運動負荷方案同Pco組一致，后3周采用的恒定訓練負荷是第6周的訓練負荷(圖1)。

圖1 實驗設計Figure 1 Experimental design

本實驗模擬運動訓練中周期性耐力跑的方式，參照Bedford大鼠運動負荷標準[10]和王人衛(wèi)教授建立的大鼠動情周期抑制模型時的運動方案[11]，采用段氏PT98型鼠類跑臺進行訓練。每籠3只，每周連續(xù)訓練6 d，然后休息1 d，每天上、下午各訓練1次(訓練負荷見表1)，第9周最后一天下午訓練結束后，晚上再加訓1次。對照組和實驗組前6周均采用普食喂養(yǎng)，每天固定為每籠投喂相同量的飼料(每天早上稱量對照組一天消耗的飼料量，然后以此為參考，給實驗組進行喂食)和200 mL飲用純凈水；后3周，Oli組在普食喂養(yǎng)的基礎上，每天下午飲用含有24 g低聚糖(17.2 kJ/g)的100 mL溫水(第二天早上補充100 mL飲用純凈水，以保障每組每天飲水總量相同)其余組仍200 mL飲用純凈水?？傮w上，Oli組平均每天增加能量攝入17.2 kJ/g×24 g/3只=137.6 kJ/只。

表1 大鼠運動負荷的設定標準

1.2.2 大鼠陰道脫落細胞學檢查 參考Marcondes的方法[12]，為避免造成待檢查大鼠應激反應，檢查的大鼠和待檢查的大鼠分置于不同的實驗室。待檢查大鼠放置動物手術臺后，安撫并清理大鼠毛上的墊料，用拇指和食指捏住大鼠尾巴，其余三指輕壓其后腰背部，翻起尾巴露出陰道口，清理糞便后，用醫(yī)用棉簽蘸少許生理鹽水，在大鼠陰道按照順時針方向輕轉一周。將采集物涂于玻璃載玻片后，在無水乙醇中浸泡10 min，采用常規(guī)HE染色，通過普通光學顯微鏡觀察陰道脫落細胞的狀況。

1.2.3 激素指標檢測 為了消除運動應急對內分泌系統(tǒng)產生的不必要影響，大鼠處死前安靜休息36 h，并禁食12 h。大鼠稱重后，采用體積分數(shù)為10%的水合氯醛作為麻醉劑，按照每千克大鼠注射40 mg麻醉劑的量進行麻醉。待大鼠完全麻醉后，將大鼠四肢固定在手術臺，迅速打開腹腔，剝離下腔靜脈，用一次性負壓真空管采血5～8 mL，低溫離心(3 000 r/min)15 min，取上清液置于-80 ℃的冰箱中，待測GnRH、FSH、LH、E2、P及PRL。GnRH采用雙抗體兩步夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定，試劑盒由美國R & D公司提供。

E2的測定采用免疫化學發(fā)光法，試劑盒由 Beckman Coulter 公司提供，采用Beckman Coulter 公司生產的 Access 2 immunoassay system(全自動化學發(fā)光免疫測定系統(tǒng))進行測試。采用雙抗體放射免疫分析法測定FSH、LH、P、PRL，放射免疫分析試劑盒由第二軍醫(yī)大學神經生物學教研室提供。

1.3 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 20.0數(shù)據(jù)軟件包對數(shù)據(jù)進行分析處理，所有結果均以均值±標準差(M±SD)表示。采用單因素方差分析進行組間比較，采用LSD法進行兩兩比較。P<0.05表示具有顯著性差異。

2 實驗結果

2.1 大鼠體質量的變化情況 由圖2可見，在前6周建立動情周期抑制狀態(tài)，未進行任何干預措施前，各組大鼠的體質量的自然生長發(fā)育變化基本一致；動情周期抑制建立后，自第7周開始，體質量的不同變化趨勢開始顯現(xiàn)，Res組體質量開始迅速增加；而Oli組也呈增長趨勢，但無Res組明顯；Nco組體質量基本不再變化；Pco組體質量下降明顯。

圖2 大鼠體質量的變化Figure 2 Changes of body weight of rats

2.2 大鼠內臟脂肪情況 禁食12 h后對大鼠進行處死，處死前測量大鼠的體長、體質量；處死后取大鼠內臟周圍的脂肪進行稱量。由表2可見，各組大鼠的體長無組間統(tǒng)計學意義，但體質量、內臟脂肪含量均有統(tǒng)計學意義。為了避免體質量對內臟脂肪質量的影響，將內臟脂肪質量/體質量×100作為衡量大鼠體脂率的指標。經過統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)：Pco組大鼠體脂率顯著低于Nco組，但無統(tǒng)計學意義；Oli組大鼠體脂率顯著低于Nco組；Res組合Oli組大鼠體脂率顯著高于Pco組；Oli組大鼠體脂率低于Res組，但無統(tǒng)計學意義。

表2 大鼠形態(tài)指標比較(M±SD)

注：*表示與Nco組比較，P<0.05；#表示與Pco組比較，P<0.05

2.3 大鼠陰道脫落細胞情況 大鼠的動情周期一般為4～5 d，圖3(a)～(d)為Nco組大鼠一個動情周期的陰道脫落細胞HE染色結果，該組為動情周期正常組。由圖3可見，不同動情周期階段表現(xiàn)出不同的陰道脫落細胞特征：圖3(a)為動情前期，該階段以大量有核表層細胞為特征；圖3(b)為動情期，該階段以大量無核表層細胞為特征；圖3(c)為動情后期，該階段以大量有核表層細胞和白細胞為特征；圖3(d)為動情間期，該階段以出現(xiàn)大量白細胞為特征。

實驗開始2周后，每2天進行陰道脫落細胞學檢查，結果顯示：運動訓練第3周后，實驗干預組各組陰道涂片出現(xiàn)中層細胞和少量底層細胞；第4～5周時，出現(xiàn)大量的中層細胞和相對少量的底層細胞；第6周時，出現(xiàn)大量底層細胞和相對少量的中層細胞，并且陰道脫落細胞數(shù)量明顯較前幾周減少(圖3(e)、(f))。這表明，經過6周的遞增負荷訓練，動情周期開始出現(xiàn)抑制，這與王人衛(wèi)等[11]觀察到的一致。

在第7周開始進行干預，陰道脫落細胞學觀察發(fā)現(xiàn)：Res、Oli組陰道脫落細胞數(shù)量開始增加(圖3(g))；至第9周后，以上2組大鼠陰道脫落細胞數(shù)量同Nco組無顯著性差異(圖3(h))；隨著運動的繼續(xù)，Pco組陰道脫落細胞顯著減少。

圖3 大鼠陰道脫落細胞HE染色結果Figure 3 Results of HE staining of vaginal exfoliated cells in rats

2.4 HPO軸激素濃度情況 通過陰道脫落細胞學檢查確認大鼠的動情周期抑制狀態(tài)建立后，再進行3周恒定負荷訓練，并采取不同的干預措施。結果顯示，HPO軸釋放的各激素濃度均有組間統(tǒng)計學差異(表3)。兩兩比較的結果顯示，Pco組的GnRH、FSH、LH、E2及P濃度均顯著低于Nco組，而Pco組的PRL濃度則顯著高于Nco組。Res組和Oli組的GnRH、FSH、LH、E2及P濃度均低于Nco組，而Nco組的PRL濃度高于Res組和Oli組，但均無統(tǒng)計學意義。Res組和Oli組的GnRH、FSH、LH、E2及P濃度均顯著高于Pco組，而Res組和Oli組的PRL濃度則顯著低于Pco組。Oli組同Res組比較發(fā)現(xiàn)，除釋放的GnRH濃度顯著高于Res組外，其余激素濃度，Res組和Nco組均無統(tǒng)計學差異(表4～表9)。

表3 HPO軸激素濃度情況比較(M±SD)

表4 GnRH組間比較結果

注：*表示P<0.05，具有統(tǒng)計學意義；表5～表9同此

表5 FSH組間比較結果

表6 LH組間比較結果

表7 E2組間比較結果

表8 P組間比較結果

表9 PRL組間比較結果

3 分析與討論

動情周期是有胎盤類哺乳動物擁有的一種經常性的生理變化，與人類的月經周期相似，是受身體性腺軸釋放的性激素影響而產生的周期性變化。動情周期抑制類似于女性的閉經，是一種病理狀態(tài)，長期處于這種狀態(tài)，不僅會影響身體健康，還會抑制生殖功能。本文以大鼠動情周期抑制模型模擬女性閉經，通過補充低聚糖，增加外源性能量攝入，觀察是否可以促進HPO軸激素釋放恢復正常，以逆轉動情周期抑制狀態(tài)。

3.1 對內臟脂肪含量的影響 體質量是早期衡量月經周期是否規(guī)律的直觀指標。早期學者發(fā)現(xiàn)從事形體類運動項目的運動員，如體操運動員[13]，普遍存在體質量過輕，月經周期不規(guī)律的問題，體質量與月經周期存在密切的相關性。本文各組雌性大鼠體質量在前6周未采取干預措施前，隨著自然生長發(fā)育體質量變化基本一致，但當動情周期抑制形成后，隨著不同干預措施的施行，大鼠的體質量呈現(xiàn)不同的變化。主要原因是由于運動訓練負荷的降低和外源性可利用能量的補充，使得安靜休息組和補充低聚糖組大鼠的體質量得以繼續(xù)維持生長，而運動強度和飲食保持不變的陽性對照組(即動情周期抑制模型組)則由于缺乏足夠的外源性能量補充，體質量呈現(xiàn)下降趨勢。

體質量的變化只是直觀現(xiàn)象，內臟脂肪含量的變化才是客觀原因。研究表明，內臟脂肪對維持正常的動情周期具有重要作用。總結已有的研究[14-16]，學者認為：①內臟脂肪是能量存儲器，可以為動情周期的維持提供必需的可利用能量；②內臟脂肪也具有分泌瘦素(leptin)的作用，能直接作用于中樞神經系統(tǒng)的leptin受體，對中樞神經系統(tǒng)釋放進行機體能量儲存的信號，并且與下丘腦GnRH脈沖性釋放密切相關，從而直接影響HPO軸。本文發(fā)現(xiàn)，雖然補充低聚糖組的內臟脂肪含量低于安靜休息組和陰性對照組(均無統(tǒng)計學差異)，卻顯著高于陽性對照組，表明通過補充低聚糖可以有效阻止內臟脂肪的消耗，并達到與安靜休息近似的效果。3.2 對陰道脫落細胞學的影響 研究發(fā)現(xiàn)，長期力竭運動致動情周期紊亂大鼠的卵巢顆粒細胞凋亡指數(shù)顯著高于正常對照組[17]。對動情周期正常的大鼠進行遞增負荷訓練時發(fā)現(xiàn)：當訓練進行到第3周時，陰道涂片出現(xiàn)中層細胞和少量底層細胞，卵巢功能開始表現(xiàn)出輕度低落；當訓練至第7周時，則出現(xiàn)大量底層細胞和相對少量的中層細胞，表現(xiàn)為卵巢功能大幅下降[11]。經過6周遞增負荷訓練后發(fā)現(xiàn)，陰道脫落細胞的數(shù)量急劇減少，與已有研究結果[11]基本一致，表明第6周后，動情周期抑制模型已成功建立。隨后進行為期3周的不同手段的干預，根據(jù)陰道脫落細胞學可知：陽性對照組的底層細胞數(shù)量顯著增加，表明動情周期抑制狀態(tài)加深；而安靜休息組和補充低聚糖組陰道脫落細胞數(shù)量逐漸增加，開始出現(xiàn)無核表層細胞，表明動情周期抑制狀態(tài)逐步解除。

3.3 對HPO軸合成分泌激素的影響 HPO軸是由下丘腦-垂體-性腺軸組成的神經內分泌系統(tǒng)，控制女性發(fā)育、正常月經和性功能，因此又稱性腺軸。HPO軸的每個環(huán)節(jié)均有其獨特的神經內分泌功能，并且彼此調節(jié)和影響。下丘腦分泌的GnRH作用于腦垂體，促使其分泌FSH、LH和PRL；卵巢在FSH和LH的作用下分泌E2、P；子宮內膜的周期性變化又受卵巢分泌的E2、P的控制；卵巢分泌的E2、P又可通過負反饋抑制下丘腦GnRH的釋放，從而使HPO軸重新調整相應激素的釋放[18]。

通過比較血清激素檢查結果可以發(fā)現(xiàn)，陽性對照組的GnRH、FSH、LH、E2及P濃度均顯著低于其余各組，而PRL則顯著高于其余各組。研究發(fā)現(xiàn)，內分泌系統(tǒng)由多條內分泌軸組成，每條內分泌軸對運動負荷的反應不一致，從而引起內分泌穩(wěn)態(tài)失衡，導致HPO軸分泌出現(xiàn)紊亂[19]。有研究報道，長期高強度的劇烈運動可導致多巴胺神經元活性降低[19]。多巴胺神經元是下丘腦和腦垂體間重要的神經遞質，可以通過Kp(神經細胞產生的一類多肽類激素)保持GnRH的脈沖頻率。過高的PRL通過短路反饋影響下丘腦多巴胺神經元活性，由于機體長期處于負能量平衡狀態(tài)，易導致下丘腦弓狀核神經元的老化、凋亡及神經遞質的傳遞出現(xiàn)障礙，從而抑制GnRH的合成與釋放，破壞其正常的脈沖分泌[20]。當PRL分泌升高時，其通過破壞GnRH的正常脈沖式分泌導致FSH和LH分泌的減少，使卵巢合成的E2及P分泌也減少，從而造成月經周期紊亂和閉經等問題。

本文通過補充低聚糖或采取安靜休息的方法發(fā)現(xiàn)：補充低聚糖組或安靜休息組分泌的PRL水平顯著低于陽性對照組，而與陰性對照組無統(tǒng)計學差異；且GnRH、FSH、LH、E2及P濃度均顯著高于陽性對照組，并與陰性對照組無統(tǒng)計學差異。表明補充低聚糖或安靜休息后，多巴胺神經元活性升高，且神經遞質傳遞增多，從而緩解了因PRL分泌增加而引起的GnRH脈沖式分泌的抑制，使性腺軸各環(huán)節(jié)激素的合成與釋放恢復正常，陰道脫落細胞數(shù)量逐漸增加，無核表層細胞開始出現(xiàn)，動情周期的抑制狀態(tài)得到緩解。

4 結論

通過補充低聚糖，增加大負荷運動訓練狀態(tài)下雌性大鼠的外源性能量攝入，使HPO軸合成分泌激素恢復正常。由此推斷大鼠能量負平衡狀態(tài)得到改善，使可利用能量增加，緩解了動情周期抑制狀態(tài)。