張曦 ，黃選章 ，曾云云 ，張為民 *

（1.溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，浙江 溫州 325000；2.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院，廣東 廣州510010）

肺癌已經進入分子靶向治療的時代，以吉非替尼、厄洛替尼為代表的表皮生長因子酪氨酸激酶抑制劑 （epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs）被廣泛應用于晚期非小細胞肺癌的各線治療，然而耐藥現象的出現成為制約靶向治療進一步應用的瓶頸[1-2]。因此，發(fā)現非小細胞肺癌對EGFR-TKIs的獲得性耐藥機制、尋找逆轉耐藥的新途徑具有重要的臨床意義。既往研究發(fā)現，胰島素樣生長因子I型受體（insulin-like growth factor-1 receptor，IGF-1R）參與介導非小細胞肺癌EGFR-TKIs的獲得性耐藥[3-4]，但抑制IGF-1R表達是否能逆轉肺癌細胞對EGFR-TKIs的獲得性耐藥未見報道。因此，本研究擬通過RNAi技術，觀察抑制IGF-1R表達對非小細胞肺癌細胞EGFR-TKIs的敏感性及IGF-1R下游相關信號通路的影響，以探討靶向抑制IGF-1R對逆轉非小細胞肺癌EGFR-TKIs獲得性耐藥的影響及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 非小細胞肺癌EGFR-TKIs耐藥細胞株H460/ER由課題組前期培養(yǎng)所得；三質粒慢病毒載體系統(tǒng)購自吉凱基因公司；DMSO、MTT購自Sigma公司；1640培養(yǎng)基購自Gibco公司；限制性內切酶、T4DNA ligase M0202v、T4DNA ligase buffer購自NEB公司；Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；Trizol購自 Invitrogen公司；QIAGEN Plasmid大抽Kit購自QIAGEN公司；PCR引物由上海吉凱基因公司合成 （IGF-1R上游引物：5’-TGCGTGAGAGGATTGAGTTTC-3’，下游引物：5’-CTTATTGGCGTTGAGGTATGC-3’；內參GAPDH上游引物：5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’，下游引物：5’ -CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’；qRT-PCR試劑盒購自羅氏公司；EGFR、IGF-1R、ERK、AKT、p-IGF-1R、p-EGFR、p-AKT、p-ERK、β-actin 等蛋白一抗和二抗均由Cell Signaling公司提供；24孔Transwell板購自Corning公司。

1.2 siIGF-1R重組慢病毒載體的構建及病毒包裝

1.2.1 慢病毒載體的構建 按照GeneBank提供的IGF-1R基因編碼區(qū)，設計3對相應shRNA序列，通過BLAST分析及前期預實驗，確定干擾靶序列“GCTTCACCGTTTACTACAA”，委托上海吉凱公司合成干擾序列的雙鏈DNA oligo。將退火后的dsDNA與雙酶切后的穿梭載體連接轉化，挑選陽性克隆行PCR鑒定與測序。

1.2.2 病毒的包裝及滴度測定 以lipofectamine 2000試劑介導的瞬時感染方法轉染293T細胞，培養(yǎng)8小時后倒去含有感染混合物的培養(yǎng)基，以少量PBS洗滌殘余的感染混合物，加入含血清的新鮮細胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48小時，收集并離心濃縮細胞上清液，分裝后-80℃保存。取其中一管測定：取出凍存細胞接種于96孔板中，24小時后每孔吸去90μL 培養(yǎng)基，分別為 10、1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6μL的病毒顆粒稀釋液中加入等量病毒原液，培養(yǎng)24小時后換成完全培養(yǎng)基，熒光顯微鏡下觀察帶綠色熒光的細胞數量。病毒滴度=帶熒光的細胞數/病毒原液。

1.3 慢病毒轉染H460/ER細胞 用胰酶消化對數生長期的H460/ER細胞，將其制成懸液后接種于6孔板中，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)使細胞融合至約30%，根據預實驗摸索的MOI值（20）加入適量病毒，48小時后用含5μg/mL嘌呤霉素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，感染72小時后在熒光顯微鏡下拍照，觀察感染率。

1.4 qRT-PCR法和Western Blot法檢測慢病毒對H460/ER細胞IGF-1R的抑制效應

1.4.1 qRT-PCR法測定IGF-1R的mRNA水平 用TRIzol法提取細胞總RNA，反轉錄為cDNA，行引物PCR擴增。采用20μL反應體系：滅菌水7μL，2xSYBR GreenMaster10μL，10μM上、下游各引物 0.6μL，DNA模板2μL。PCR擴增條件：95℃預變性5秒，95℃5秒，60℃30秒，一共進行40個循環(huán)（95℃，15秒→60℃，15秒→95℃，15秒）。重復測定3次。數據由PCR儀自帶軟件完成收集。實驗結果采用2-△CT法分析。

1.4.2 Western Blot法檢測IGF-1R的蛋白表達水平取消化后的各組細胞用蛋白提取液提取其中的總蛋白質。BCA法測定蛋白濃度，行10%SDS-PAGE電泳分離，轉至PVDF膜上，用含5%牛血清白蛋白封閉約2小時，按說明書及前期實驗所得比例加入各蛋白一抗，于4℃搖床上反應過夜，洗膜3次，再加入二抗，搖床反應1小時，再次洗膜3次，得到的蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發(fā)光。以β-actin為內參照，用Quantity One圖像軟件對條帶進行光密度值分析。

1.5 MTT法檢測 靶向抑制IGF-1R后H460/ER細胞對EGFR-TKIs敏感性變化 收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度為 1×105個/mL，5%CO2，37℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）。設9個濃度梯度，每組取4個平行復孔，邊緣孔用無菌PBS填充。細胞貼壁后，每孔加入100μL含不同濃度厄洛替尼的培養(yǎng)液，培養(yǎng)72小時再向孔內加入20μL 0.5%的MTT，培養(yǎng)4小時棄掉上清液后再加入150μL二甲基亞砜，振蕩10分鐘后酶標儀下測定各孔吸光度值（492nm波長），計算細胞存活率及其半抑制率（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.6 劃痕實驗和Transwell實驗 檢測靶向抑制IGF-1R后H460/ER細胞轉移侵襲能力的變化（1）劃痕實驗：收集兩組細胞，按 5.0×104個細胞/孔接種于6孔板上，融合至80%時用無血清培養(yǎng)液饑餓過夜，第2天用200μL無菌移液器槍頭在皿底部劃3條平行直線，用PBS洗細胞3次，去除劃下的細胞，加入無血清培養(yǎng)基，放入5%CO237℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24小時后取樣，置于熒光顯微鏡（×40）下拍照。 （2）Transwell侵襲實驗：Transwell板上室每孔加入無血清培養(yǎng)液200μL（含5×105個細胞），下室每孔加入500μL含10%新生胎牛血清的培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24小時后取出上室，用棉簽拭去上室表面的非侵襲細胞，然后染色，置于熒光顯微鏡（×200）下拍照，取其中3個細胞分布良好的視野計數，計算平均值。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 14.0軟件進行統(tǒng)計學分析所有實驗重復3次，取平均值。實驗數據以（±s）表示，采用 t檢驗。

2 結果

2.1 重組慢病毒載體的鑒定及滴度測定 挑選陽性克隆送上海吉凱公司測序。鑒定及測序結果符合預期，說明合成的IGF-1R shRNA oligo DNA序列插入正確。按逐孔稀釋法，計算出IGF1R-siRNA重組慢病毒滴度為 3×106TU/μL。

2.2 慢病毒感染H460/ER細胞 H460/ER細胞感染重組慢病毒IGF1R-siRNA及其空白對照慢病毒IGF1R-siControl的效率均達到90%以上，如圖1。

圖1 H460/ER細胞感染IGF1R-siControl、IGF1R-siRNA慢病毒效果 （×100）。1A：細胞感染IGF1R-siControl慢病毒后的明場照片；1B：細胞感染IGF1R-siRNA慢病毒后的熒光照片；1C：細胞感染IGF1R-siControl慢病毒后的明場照片；1D：細胞感染IGF1R-siRNA慢病毒后的熒光照片。

2.3 目的基因IGF-1R抑制效率 qRT-PCR和Western Blot檢測結果顯示，IGF1R-siRNA慢病毒對H460/ER細胞IGF-1R的mRNA和蛋白抑制率分別達（67.7±2.6）%和（86.6±1.6）%（P＜0.05）。 說明構建的IGF1R-siRNA慢病毒能高效抑制H460/ER細胞IGF-1R的表達。詳見圖2-3。

圖2 qRT-PCR法檢測各組細胞IGF-1R的mRNA表達差異

圖3 Western Blot法檢測各組細胞IGF-1R的蛋白表達差異

2.4 抑制IGF-1R表達對H460/ER細胞EGFRTKIs敏感性的影響 MTT法檢測結果顯示，siControl H460/ER和siIGF-1R H460/ER細胞均呈無限繁殖，它們對厄洛替尼的增殖作用表現為濃度依賴性 （圖4）；siIGF-1R H460/ER細胞對厄洛替尼的敏感性較siControl H460/ER細胞明顯升高，IC50 值分別為（6.29±1.56）μmol/L 和（65.34±3.30）μmol/L （P＜0.05）， 說明抑制 IGF-1R 表達后，H460/ER細胞對 EGFR-TKIs的耐藥性顯著降低。

圖4 MTT法檢測不同濃度厄洛替尼分別作用72小時后對siControl H460/ER和siIGF-1R H460/ER細胞生長的抑制作用

2.5 抑制IGF-1R 表達對H460/ER細胞IGF-1R信號轉導通路相關蛋白表達的影響 靶向抑制IGF-1R后，H460/ER細胞中EGFR蛋白及其磷酸化表達未見明顯變化 （灰度未見明顯變化，P＞0.05），而IGF-1R蛋白及其磷酸化表達顯著降低（灰度明顯降低，P＜0.05），p-AKT 和 p-ERK 表達亦下降（灰度較對照組下降，P＜0.05）。詳見圖5。

圖5 Western Blot法檢測各組細胞IGF-1R、EGFR、AKT和ERK及其磷酸化水平的表達

2.6 細胞轉移和侵襲能力的變化 劃痕實驗結果顯示，siControl H460/ER和siIGF-1R H460/ER細胞劃痕的兩邊緣距離分別為（5.5±0.5）mm 和（8.9±0.7）mm。相比對照組 siControl H460/ER，siIGF-1R H460/ER細胞兩邊緣距離延長 61%（P＜0.05）（圖6）。Transwell實驗結果顯示，siControl H460/ER和siIGF-1R H460/ER細胞穿過Matrigel膠的細胞數分別為（574±33）個和（179±13）個，siIGF-1R H460/ER細胞穿過Matrigel膠的細胞數為siControl H460/ER 的 69%（P＜0.05）（圖 7）。 上述結果說明，抑制IGF-1R后，非小細胞肺癌H460/ER細胞的侵襲轉移能力明顯減弱。

圖6 抑制IGF-1R后H460/ER細胞的轉移侵襲能力變化。6A：劃痕實驗（×40）；6B：Transwell侵襲實驗（×200）。

圖7 siIGF-1RH460/ER細胞較siControlH460/ER細胞侵襲能力明顯減弱。7A：siControlH460/ER細胞穿過Matrigel膠的細胞數；7B：siIGF-1R H460/ER細胞穿過Matrigel膠的細胞數。

3 討論

非小細胞肺癌對EGFR-TKIs獲得性耐藥的主要機制為T790M突變和c-MET基因擴增，兩者占所有非小細胞肺癌對EGFR-TKIs獲得性耐藥機制的60%左右[5]，但目前仍有約40%的NSCLC的EGFRTKIs獲得性耐藥機制尚未明確。既往研究發(fā)現，IGF-1R信號轉導通路在NSCLC對EGFR-TKIs獲得性耐藥過程中起重要作用[3-4]。IGF-1R是一種跨膜酪氨酸蛋白激酶受體，表達于多種類型細胞的表面，對細胞的增殖、分化、抗凋亡起著調控作用。它與配體結合后激活2條主要的信號轉導通路：PI3K-AKT信號通路和ERK/MAPK信號通路，促進細胞的有絲分裂和生長[3]。IGF-1R在多種腫瘤中表達，它在肺癌等惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用[6]。

本研究利用RNAi技術[7]成功構建穩(wěn)定抑制IGF-1R表達的H460/ER細胞株。研究發(fā)現，靶向抑制IGF-1R后，H460/ER細胞對EGFR-TKIs敏感性顯著升高，siIGF-1R H460/ER細胞對厄洛替尼的IC50僅為對照組siControl H460/ER細胞的1/10。說明靶向抑制IGF-1R逆轉了H460/ER細胞對EGFR-TKIs的獲得性耐藥。對IGF-1R信號通路相關蛋白表達變化的研究顯示，與siControl H460/ER細胞相比，siIGF-1R H460/ER細胞的IGF-1R蛋白及其磷酸化表達明顯降低，p-AKT和p-ERK水平下降，而EGFR蛋白及其磷酸化未出現明顯變化。表明靶向抑制IGF-1R后，其下游PI3K/AKT和MAPK/ERK信號轉導通路受到抑制。此外，劃痕實驗和Transwell實驗結果顯示，與siControl H460/ER細胞相比，siIGF-1R H460/ER的轉移侵襲能力大幅減弱，說明靶向抑制IGF-1R可減弱H460/ER細胞的侵襲轉移能力。已有研究證實，腫瘤細胞的侵襲轉移能力與上皮間質轉化有關[8]，而上皮間質轉化在IGF-1R介導的NSCLC對EGFR-TKIs獲得性耐藥機制中起著重要作用[9]。因此，腫瘤細胞侵襲轉移能力的減弱很可能也參與了逆轉非小細胞肺癌對EGFR-TKIs的耐藥。鑒于IGF-1R通過與配體結合激活2條主要的信號通路 （PI3K/AKT和MAPK/ERK）而發(fā)揮細胞效應[10]，本研究結果也已證實抑制IGF-1R表達能逆轉H460/ER細胞對EGFR-TKIs的獲得性耐藥及減弱細胞侵襲轉移能力，說明靶向抑制IGF-1R表達很可能通過阻斷其下游PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路的傳導，從而逆轉H460/ER細胞對EGFR-TKIs的獲得性耐藥。

本研究僅對一種非小細胞肺癌細胞作了研究，有待在多株非小細胞肺癌細胞中加以證實，且IGF-1R信號通路交錯復雜，它參與介導的非小細胞肺癌EGFR-TKIs獲得性耐藥機制亦尚未完全闡明，有待進一步研究。