陳鑒

（紹興第二醫(yī)院，浙江 紹興 312000）

肝硬化門脈高壓患者腸道淤血缺氧，導(dǎo)致腸道微生態(tài)失衡。本實驗采用大鼠肝硬化門脈高壓模型觀察大鼠腸道四種微生物（乳酸桿菌、雙歧桿菌、大腸桿菌、真菌）的變化，以初步評價微生態(tài)制劑對肝硬化門脈高壓大鼠腸道微生態(tài)的作用，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實驗動物：健康SD大鼠80只，SPF級，雌性和雄性各 40 只，體質(zhì)量（238.7±11.9）g。 大鼠和飼料均購自上海寶特生命科學(xué)發(fā)展有限公司。（2）微生態(tài)制劑選用整腸生膠囊（地衣芽孢桿菌活菌膠囊，東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司），為活菌制劑，每片含地衣芽孢桿菌數(shù)不低于2.5億個，輔料為：乳糖、淀粉。

1.2 方法

1.2.1 肝硬化門脈高壓大鼠模型的建立 將SD大鼠80只在自由進(jìn)食、飲水的基礎(chǔ)上腹腔注射N-亞硝基二甲胺（DMNA）12μg/kg，每周 3 次，5 周后隨機(jī)選擇其中6只，對大鼠肝臟進(jìn)行病理切片檢查，評定肝硬化程度。再隨機(jī)抽取正常大鼠和造模組大鼠各4只，用戊巴比妥鈉1mg/kg靜脈麻醉后打開大鼠腹腔，游離門靜脈主干，插管測定門靜脈壓力，以正常大鼠平均壓力作為基礎(chǔ)值，評定造模組是否門脈高壓。如同時符合以上兩點(diǎn)，即大鼠肝硬化門脈高壓造模成功。

1.2.2 大鼠分組 選擇造模成功的SD大鼠32只，隨機(jī)分為模型對照組和微生態(tài)組，每組各16只，并取正常大鼠16只作為正常組。三組均給予相同飼料自由喂食，微生態(tài)組在此基礎(chǔ)上加以整腸生活菌制劑灌胃，5mg/kg，1 次/d（人體劑量 300mg/d），連續(xù)飼喂8周。

1.2.3 指標(biāo)檢測與細(xì)菌培養(yǎng) （1）指標(biāo)檢測：連續(xù)喂飼8周后，清晨空腹抽取大鼠靜脈血，檢驗血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶 （ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽固醇及甘油三酯。（2）連續(xù)喂飼8周后以脫頸法處死大鼠，無菌操作采集大鼠結(jié)腸內(nèi)容物，放入無菌勻漿機(jī)內(nèi)碾碎，溶于糞便稀釋液中10倍稀釋，并置于振蕩器上劇烈震蕩后取稀釋后標(biāo)本100μL接種到各種培養(yǎng)基（表1），每一個稀釋度重復(fù)3遍，采用平板菌落計數(shù)法，求平均值后計算每克腸道內(nèi)容物所含的菌落數(shù)。

表1 各菌群培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)采用（±s）表示，并進(jìn)行t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 四種腸道微生物的變化 與正常組相比，模型對照組腸道乳酸桿菌、雙歧桿菌均減少，大腸桿菌、真菌數(shù)量增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 （均P<0.05）；微生態(tài)組與模型對照組比較，乳酸桿菌、雙歧桿菌增加，大腸桿菌、真菌數(shù)量減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。詳見表2。

表2 微生態(tài)制劑對大鼠腸道四種微生物數(shù)量的影響（×104CFU/g）

2.2 對大鼠血脂及肝功能的影響 與正常組相比，模型對照組血清總膽固醇、甘油三酯、ALT及AST均升高（P<0.05），而微生態(tài)組較模型對照組總膽固醇、甘油三酯、ALT及AST均降低（P<0.05）。詳表3。

表3 微生態(tài)制劑對大鼠血脂及肝功能的影響

3 討論

3.1 肝硬化門脈高壓大鼠腸道微生物改變 正常情況下，腸道中微生物的數(shù)量和種類相對穩(wěn)定，以維持腸道微生態(tài)的動態(tài)平衡。同時，腸道具有一系列特有的屏障，阻止細(xì)菌易位。肝硬化門脈高壓者腸道的屏障功能受損，細(xì)菌易位，引起腸道菌群的種類和/或數(shù)量的改變；同時，肝硬化者腸內(nèi)神經(jīng)體液調(diào)節(jié)功能異常，減少分泌腸黏膜上皮細(xì)胞間緊密連接的蛋白，使得腸道通透性增加，進(jìn)一步破壞腸道屏障，加重腸道細(xì)菌易位，引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答，進(jìn)一步加重肝硬化的發(fā)生與發(fā)展[4]，嚴(yán)重者甚至刺激炎癥因子誘發(fā)腸道感染、自發(fā)性腹膜炎、敗血癥等感染性并發(fā)癥。本研究結(jié)果同樣顯示，與正常組相比，模型對照組腸道乳酸桿菌、雙歧桿菌均減少，大腸桿菌、真菌數(shù)量均增加（均P<0.05），表明肝硬化門脈高壓大鼠存在腸道微生物群紊亂。而微生態(tài)組與模型對照組比較，乳酸桿菌、雙歧桿菌增加，大腸桿菌、真菌數(shù)量減少（均P<0.05），表明微生態(tài)制劑能增加肝硬化門靜脈高壓大鼠的腸道乳酸桿菌和雙歧桿菌等有益菌，抑制其大腸桿菌和真菌等致病菌或條件致病菌的生長，使其腸道微生態(tài)重新回歸平衡。

3.2 微生態(tài)制劑與血脂、肝功能 肝臟病變與血脂代謝紊亂密切相關(guān)。研究已經(jīng)證實乳酸桿菌和雙歧桿菌有降脂的作用[5]。本研究結(jié)果提示肝硬化門脈高壓大鼠存在血脂代謝紊亂的現(xiàn)象，模型對照組的總膽固醇和甘油三酯水平均高于正常組，而微生態(tài)組這兩個指標(biāo)卻低于模型對照組，說明微生態(tài)制劑有調(diào)脂的功效?？赡軝C(jī)制為：（1）乳酸桿菌在腸道內(nèi)定植生長過程中建立的酸性環(huán)境有利于膽固醇與膽鹽發(fā)生共沉淀作用。（2）乳酸桿菌具有膽鹽水解酶，可以使結(jié)合狀態(tài)的膽鹽水解成去結(jié)合的膽鹽，與膽固醇共沉淀。（3）微生態(tài)制劑改善腸道功能后促進(jìn)膽汁酸的肝腸循環(huán)，繼而降低體內(nèi)膽固醇的水平。（4）微生態(tài)制劑改善腸道功能后使患者排便規(guī)律，促進(jìn)膽固醇隨糞便排出，減少對膽固醇的重吸收。本研究結(jié)果同樣提示肝硬化門脈高壓大鼠存在肝功能受損，模型對照組的 ALT 及 AST 水平均高于正常組（P＜0．05），而微生態(tài)組這兩個指標(biāo)卻低于模型對照組（P＜0．05），說明微生態(tài)制劑有改善肝功能的作用。肝臟作為清除內(nèi)毒素的重要場所，細(xì)菌和內(nèi)毒素移位到肝臟，會直接導(dǎo)致肝臟受損，并通過誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)間接使肝臟進(jìn)一步受損，而微生態(tài)制劑通過修復(fù)腸道屏障，能夠恢復(fù)腸道微生態(tài)平衡，減少細(xì)菌和內(nèi)毒素的移位，在一定程度上阻斷了肝臟受損的路徑，達(dá)到護(hù)肝作用。

3.3 創(chuàng)新與不足 本研究從動物實驗層面研究了微生態(tài)制劑對肝硬化門脈高壓的微生物、血脂和肝功能的影響，但未研究微生態(tài)制劑對大鼠腸道黏膜屏障的影響，有待于后續(xù)跟蹤報道。