吳 訥，陳 炫，姜瑤瑤，張?zhí)鞜睿?健，朱統(tǒng)泉，張恒木，*，陳劍平，*

(1.浙江農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 311300； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 病毒學(xué)與生物技術(shù)研究所，浙江 杭州310021； 3.浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 311300； 4.駐馬店農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南 駐馬店 463000)

定量PCR(qRT-PCR)是現(xiàn)代分子生物學(xué)中研究基因表達的重要手段之一。與傳統(tǒng)的半定量方法和Northern雜交相比，qRT-PCR具有簡便而靈敏的特點[1]。在相對定量實驗的過程中，起始RNA純度與濃度、cDNA合成和擴增效率、樣品間的差異、不同的內(nèi)參基因等因素均有可能影響實驗的準(zhǔn)確性[2]。為了獲得更加精確的數(shù)據(jù)，研究者通常會選擇一個或者多個內(nèi)參基因?qū)嶒灁?shù)據(jù)作均一化處理[3]。一般而言，通常穩(wěn)定表達的持家基因(house-keeping genes)或核糖體RNA(rRNA)常被選作內(nèi)參基因，如18S核糖體RNA(18S rRNA)、肌動蛋白基因(ACTIN)、微管蛋白基因(TUBULIN)、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(GAPDH)等。然而，研究顯示并不存在任意條件下均普遍適用的內(nèi)參，即使是上述持家基因也僅在一定條件范圍內(nèi)才穩(wěn)定表達[4]。因此，在具體的實驗條件下篩選合適的內(nèi)參基因是精確定量分析的前提條件之一。

對于動植物內(nèi)參基因的篩選已有諸多報道，如水稻[5]、擬南芥[6, 7]、草莓[8]、番茄[9]、楊樹[10]、大豆[11]、馬鈴薯[12]、大白菜[13]和人[14]等。對小麥基因表達分析也表明一些持家基因也一定程度上受到時空發(fā)育特性和不同脅迫條件的影響，因此，針對不同的脅迫條件，篩選合適的小麥內(nèi)參基因也尤為重要[15]。中國小麥花葉病毒(Chinesewheatmosaicvirus， CWMV)是引起小麥花葉病的重要病原之一[16]，常年威脅著我國黃淮海冬小麥的安全生產(chǎn)。病毒侵染常影響宿主植物基因的異常表達，從而引發(fā)癥狀[27]。為了分析小麥重要功能基因在CWMV侵染條件下的表達模式并探索CWMV的致病機制，本研究以現(xiàn)存的小麥內(nèi)參基因[15]為基礎(chǔ)，通過qRT-PCR和軟件分析篩選出了在CWMV侵染條件下合適的小麥內(nèi)參基因，這也是有關(guān)CWMV侵染條件下小麥內(nèi)參基因篩選的首次報道，所確定的小麥內(nèi)參基因可為CWMV致病機理、小麥抗病機制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

CWMV全長侵染性cDNA克隆載體質(zhì)粒pCBT7-R1和pCBT7-R2由本實驗室構(gòu)建和保存[17]。煙農(nóng)22品種小麥種子由煙臺市農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所提供。

1.2 體外轉(zhuǎn)錄CWMV RNA1和RNA2

具體方法和步驟參考文獻[17]，首先用SpeⅠ限制性內(nèi)切酶分別線性化pCBT7-R1和pCBT7-R2，純化回收后，各取0.1 μg純化產(chǎn)物為模板，按照Ambion mMessage mMachine試劑盒說明書在37 ℃條件下體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)1 h即獲得CWMV RNA1和RNA2體外轉(zhuǎn)錄物。

1.3 小麥摩擦接種及其室內(nèi)培養(yǎng)

接種CWMV方法主要參考文獻[18]并略加修改。即取上述體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物各100 μL，混勻；用摩擦接種緩沖液(50 mmol·L-1甘氨酸，50 mmol·L-1K2HPO4，pH 9.2)稀釋至1 mL，摩擦接種至生長2周的小麥苗上，同時以僅摩擦接種緩沖液的小麥苗為對照。接種后，將小麥轉(zhuǎn)移至人工氣候培養(yǎng)箱(Percival E-30)，設(shè)定培養(yǎng)條件為：溫度(17±1)℃，光周期16 h/8 h(L/D)，相對濕度60%～80%、光照強度8 000～10 000 lx。

1.4 總RNA提取、純化及cDNA合成

采用RNeasy?Plant Mini Kit (Qiagen)提取小麥葉片總RNA，應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(NanoDrop RND-2000，US)對RNA的完整性、濃度、純度進行檢測，結(jié)果顯示凝膠條帶清晰且不降解，D260/D280讀數(shù)在1.8～2.1則表明RNA符合要求。按照試劑盒說明應(yīng)用First Strand cDNA Synthesis Kit(TOYOBO)試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.5 PCR引物設(shè)計和實時定量PCR

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫核苷酸序列信息，利用Primer 5.0軟件， 分別設(shè)計各小麥基因的qRT-PCR引物(表1)，引物由杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。應(yīng)用SYBR premix ExTaqⅡ試劑盒(TaKaRa)在熒光定量PCR-7900(ABI)上進行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40次循環(huán)。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及基因擴增效率

利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對各引物的擴增效率進行檢測。將各基因PCR產(chǎn)物分別按照10-4，10-5，10-6，10-7，10-8進行稀釋，設(shè)置5個梯度，每個梯度分別設(shè)置3個重復(fù)。以稀釋后的產(chǎn)物為標(biāo)準(zhǔn)品，進行熒光定量PCR擴增。引物擴增效率(E)與標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率(slope)相關(guān)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，由方程式E=(10-1/slope-1)×100，計算得出引物的擴增效率。擴增效率在95%～110%的引物符合要求。

1.7 基因表達水平測定

以各樣品cDNA的5倍稀釋液作為實時熒光定量PCR的反應(yīng)模板，利用候選基因引物對其進行擴增。采用Ct值比較法，計算不同基因在所有樣品中的表達量。對于每個基因，將其在所有樣品中最低表達量定義為1。

1.8 數(shù)據(jù)處理和分析

數(shù)據(jù)處理和分析采用常用的內(nèi)參分析軟件geNorm(http://medgen.ugent.be /genorm/)和Norm-Finder。首先，根據(jù)qRT-PCR結(jié)果計算出每個樣品的Ct平均值；然后，利用公式Q=E-ΔCt(E為基因擴增效率，一般默認(rèn)為E=2；ΔCt=每個樣品Ct-所有樣品中最低的Ctmin)，計算出各基因的相對表達量Q；最后，利用geNorm軟件對各候選內(nèi)參基因的相對表達量Q進行表達穩(wěn)定性統(tǒng)計學(xué)分析，以表達穩(wěn)定性M(軟件默認(rèn)M=0.5為閾值)來確定最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，M值越大，穩(wěn)定性越差，當(dāng)M<0.5時，被認(rèn)為可以考慮作為內(nèi)參基因。另外，geNorm軟件還引入標(biāo)準(zhǔn)化因子的配對差異分析V(程序默認(rèn)V=0.15)，從而確定合適的內(nèi)參基因數(shù)目。若Vn/(n+1)<0.15，則沒必要引入第n+1個內(nèi)參基因[2]。Norm-Finder軟件與geNorm類似，首先，將原始數(shù)據(jù)先經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線或ΔCt法轉(zhuǎn)換成相對表達量Q；然后，通過方差分析得出基因的表達穩(wěn)定值M；最后，直接評價基因的穩(wěn)定性[4]。

2 結(jié)果與分析

2.1 候選內(nèi)參基因的選擇及引物特異性

參考相關(guān)文獻[7, 15, 19]，篩選出10個持家基因，包括依賴ATP 26S蛋白酶體調(diào)節(jié)亞基(ATP-dependent 26S proteasome regulatory subunit，26S)、細胞分裂控制蛋白(cell division control protein，CDC)、類RNA酶抑制蛋白(RNase L inhibitor-like protein，RLI)、泛素連接酶E2基因(E2 ubiquitin-conjugating enzyme，UBCE2)、核糖體蛋白S5(ribosomal protein S5，RPS5)、肌動蛋白1(ACTIN1，Actin1)、肌動蛋白2(ACTIN2，Actin2)、α微管蛋白基因(alpha tubulin，ATUB)、β微管蛋白基因(beta tubulin 5，BTUB)和延伸因子1基因(elongation factor-1-alpha-subunit，EF1A1)，這些基因涉及小麥生長發(fā)育過程中的多個生物學(xué)過程，包括基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成、泛素化過程、細胞的結(jié)構(gòu)與分化等。

利用10對針對上述持家基因的特異性引物，可分別從小麥cDNA 中擴增出大小依次為220、247、252、200、256、185、218、198、258和190 bp的預(yù)期條帶(圖1)。對這些擴增產(chǎn)物分別進行熔解曲線分析，結(jié)果顯示UBCE2、BTUB擴增產(chǎn)物的熔解曲線含有雜峰，表明二者中可能存在少量的非特異性擴增；其余8個擴增產(chǎn)物的熔解曲線未發(fā)現(xiàn)雜峰，因此，這8個基因被選用于進一步分析。擴增效率檢測結(jié)果顯示，這8個基因的擴增效率均在95%～110%之間，線性相關(guān)系數(shù)范圍為0.983～0.993，表明初始cDNA模板量與Ct值之間呈線性相關(guān)，符合內(nèi)參基因的初步要求(表1)。

2.2 候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性

Ct值是qRT-PCR定量分析中反映基因表達豐度的重要參數(shù)[20]，在不同處理條件下內(nèi)參基因的Ct值存在差異，Ct值之間的差異值(ΔCt)反映了內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。一般來說，ΔCt值越大，表明基因表達水平越不穩(wěn)定。因此，我們首先通過Ct值比較法分析了上述8個候選基因在小麥根、莖、葉等組織中的表達穩(wěn)定性。結(jié)果如圖2所示，在8個候選基因中CDC、26S和RLI在CWMV侵染前后的小麥各組織部位表達穩(wěn)定，而EF1A1和ATUB表達最不穩(wěn)定。

2.3 應(yīng)用geNorm和NormFinder程序分析基因表達穩(wěn)定性

為了進一步明確8個候選基因的表達穩(wěn)定性，我們采用了2個程序分別對各基因的相對表達量進行統(tǒng)計學(xué)分析。應(yīng)用geNorm程序分析的結(jié)果如圖3-A所示，26S、CDC、RLI、RPS5、ACTIN1、ACTIN2的M值都小于0.5，其中穩(wěn)定性最高的兩個內(nèi)參基因分別為26S和CDC，而ATUB及EF1A1的M值均大于0.5，穩(wěn)定性較差。與應(yīng)用geNorm程序分析結(jié)果相似，NormFinder程序分析也顯示，小麥26S和CDC基因表達最為穩(wěn)定(圖3-B)，表明在CWMV侵染條件下，小麥26S和CDC基因是合適的內(nèi)參基因。

M， 8 000 bp DNA ladder; Lane 1-10， 26S， CDC， RL1， UBCE2， RPS5， ACTIN1， ACTIN2， ATUB， BTUB， and EF1A1， respectively圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測10個持家基因擴增產(chǎn)物Fig.1 Amplified products of 10 house-keeping genes detected by agarose gel

表1 引物序列及擴增產(chǎn)物長度

1-6分別為健康小麥的根、莖、葉和CWMV侵染7、14、21 d后的小麥樣品。1-6， Samples from roots， stems， and leaves of health wheat and CWMV-infected wheat plants on 7、17、21 days after infection.圖2 8個候選基因在不同樣品中的表達穩(wěn)定性分析Fig.2 Relative expression of 8 candidate reference genes in different tissues

圖3 應(yīng)用geNorm(A)和NormFinder(B)程序分析候選基因表達穩(wěn)定性Fig.3 Expression stability of candidate genes analyzed by geNorm (A) and NormFinder (B) programs

為了獲得更可靠的qRT-PCR數(shù)據(jù)，一般要求推薦使用2個或以上的內(nèi)參基因。為了確定合適的內(nèi)參基因數(shù)目，我們又進一步通過geNorm程序分析了標(biāo)準(zhǔn)化因子的配對差異(V)。結(jié)果如圖4所示，V2/3<0.15，表明第3個內(nèi)參基因未能顯著表示出標(biāo)準(zhǔn)化因子差異。因此，選用內(nèi)參基因26S與CDC組合能滿足精確標(biāo)準(zhǔn)化的要求。

圖4 內(nèi)參基因最適數(shù)目的確定Fig.4 Determination of the optimal number of reference genes for normalization

3 討論

隨著qRT-PCR技術(shù)和方法的逐步完善，作為qRT-PCR數(shù)據(jù)分析的前提條件，內(nèi)參基因的篩選已受到較多的關(guān)注，理想的內(nèi)參基因是在物種不同的發(fā)育階段和組織器官中表達高度穩(wěn)定，且在受外源生物或非生物脅迫也能保持其穩(wěn)定的表達水平[21]?；谇捌诟鞣N植物內(nèi)參基因的研究結(jié)果[6, 8, 15, 22]，本研究從10個持家基因篩選出2個在CWMV侵染條件下表達穩(wěn)定性比較理想的基因，其中，26S是表達最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，前期的研究也證明26S在小麥種子發(fā)育過程以及干旱、低溫、高鹽等非生物脅迫條件下表達量穩(wěn)定[23]，支持26S可作為小麥基因定量內(nèi)參的結(jié)論，與本研究結(jié)果一致。另外，有研究顯示EF1A1表達不穩(wěn)定且與蕪青花葉病毒(Turnipmosaicvirus，TuMV)的侵染存在相關(guān)性[24]；在本研究中，EF1A1的表達不及26S穩(wěn)定，尤其是在CWMV侵染后表達量變化較大，預(yù)示EF1A1可能與CWMV侵染也存在一定的相關(guān)性，值得進一步分析。ACTIN是一類常用的內(nèi)參，但有報道顯示此類基因在一定非生物脅迫條件下表達并不穩(wěn)定[25]；本研究中，ACTIN1和ACTIN2的表達都不太穩(wěn)定，表明二者不是CWMV侵染條件下的最佳選擇。這也從另一個角度表明針對不同的脅迫條件下選擇合適的內(nèi)參是十分必要的。

為了提高qRT-PCR數(shù)據(jù)分析的精度，有時在實驗過程中選擇2個或者多個內(nèi)參，利用其幾何平均值校正待測基因表達結(jié)果[26]。本研究中，應(yīng)用geNorm和NormFinder程序分析也表明，在所檢測的基因中26S和CDC表達最為穩(wěn)定；通過geNorm程序計算n個基因標(biāo)準(zhǔn)化因子與n+1個基因標(biāo)準(zhǔn)化因子的配對變異值Vn/(n+1)，我們也明確了26S和CDC組合是在CWMV脅迫條件下研究基因表達的最適內(nèi)參組合。這為準(zhǔn)確繪制CWMV侵染條件下的小麥基因表達圖譜奠定了基礎(chǔ)，也有助于深入研究CWMV和宿主小麥基因之間的相互作用。