李 洋，劉 凱，魏吉鵬，張 蘭，李 鑫，*，韓文炎，*，李青云，*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，河北 保定 071000；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，浙江 杭州310008)

黃瓜(CucumissativusL.)是設(shè)施栽培的重要蔬菜之一，在我國(guó)各地廣泛種植且栽培面積不斷擴(kuò)大。設(shè)施內(nèi)部封閉的種植環(huán)境及獨(dú)特的栽培管理方式，使得設(shè)施土壤內(nèi)鹽分逐年積累，土壤次生鹽漬化現(xiàn)象越來(lái)越嚴(yán)重[1-2]，嚴(yán)重影響設(shè)施作物的生長(zhǎng)發(fā)育及產(chǎn)量品質(zhì)[3]。

類(lèi)黃酮是植物次生代謝產(chǎn)物，在植物種子萌發(fā)、根毛形成、花粉發(fā)育等生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中扮演著重要的角色[4]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，類(lèi)黃酮作為一種重要的抗氧化劑，在生物和非生物脅迫下可以清除活性氧，增強(qiáng)植物的抗蟲(chóng)、抗寒及抗病性[5]。兒茶素是茶葉中黃酮類(lèi)化合物的主體成分，占茶葉干質(zhì)量的12%～24%。兒茶素主要分為表兒茶素(epicatechin，EC)、表沒(méi)食子兒茶素(epigallocatechin，EGC)、表兒茶素沒(méi)食子酸酯(epicatechin gallate，ECG)及表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)4種主要類(lèi)型[6]。其中以EGCG的含量最為豐富，占兒茶素總量的50%～75%[7]。研究表明，EGCG具有抗菌、抗氧化等生物活性，是兒茶素中抗氧化作用最強(qiáng)的一種成分。

目前有研究報(bào)道，不同濃度EGCG能夠促進(jìn)或抑制植物種子萌發(fā)，并且對(duì)植株生長(zhǎng)的影響存在明顯的濃度效應(yīng)[8-9]。為了明確EGCG對(duì)NaCl脅迫下黃瓜種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響，本實(shí)驗(yàn)以黃瓜為材料，研究了不同濃度EGCG對(duì)NaCl脅迫下黃瓜種子萌發(fā)、MDA含量及胚根抗氧化酶活性的影響，探討外源EGCG與黃瓜耐鹽性之間的關(guān)系，為研究EGCG緩解植物鹽脅迫傷害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

供試黃瓜品種為津研四號(hào)，實(shí)驗(yàn)于2016年5—8月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所連棟玻璃溫室內(nèi)進(jìn)行。

實(shí)驗(yàn)共設(shè)8個(gè)處理，各處理具體溶液如下：處理Ⅰ(對(duì)照)，ddH2O；處理Ⅱ，10 μmol·L-1EGCG；處理Ⅲ，100 μmol·L-1EGCG；處理Ⅳ，1 000 μmol·L-1EGCG；處理Ⅴ，200 mmol·L-1NaCl；處理Ⅵ，10 μmol·L-1EGCG+200 mmol·L-1NaCl；處理Ⅶ，100 μmol·L-1EGCG+200 mmol·L-1NaCl；處理Ⅷ，1 000 μmol·L-1EGCG+200 mmol·L-1NaCl。

采用培養(yǎng)皿濾紙法進(jìn)行種子萌發(fā)試驗(yàn)。選取健康飽滿、形態(tài)一致的黃瓜種子，于55 ℃溫水中浸泡20 min。將2層無(wú)菌濾紙置于直徑9 cm的培養(yǎng)皿中，向培養(yǎng)皿中添加10 mL處理溶液，將種子均勻地?cái)[放在濾紙上。每個(gè)處理100粒種子，3次重復(fù)。將培養(yǎng)皿置于恒溫培養(yǎng)箱(25±1) ℃進(jìn)行催芽，光強(qiáng)為100 μmol·m-2·s-1，相對(duì)濕度控制在75%～85%，光周期12 h/12 h(光/暗)。發(fā)芽期間每天對(duì)培養(yǎng)皿內(nèi)的溶液進(jìn)行更換，直至該試驗(yàn)結(jié)束。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.2.1 種子萌發(fā)相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定

以胚根突破種皮作為種子萌發(fā)的指標(biāo)，以后每天記錄發(fā)芽數(shù)，以發(fā)芽數(shù)量不再改變作為發(fā)芽結(jié)束的標(biāo)志。按照文獻(xiàn)[10]中的公式計(jì)算種子的發(fā)芽率(GR)、發(fā)芽勢(shì)(GE)、發(fā)芽指數(shù)(GI)，種子發(fā)芽結(jié)束后5 d進(jìn)行主根長(zhǎng)及側(cè)根數(shù)量的測(cè)量統(tǒng)計(jì)。

1.2.2 丙二醛含量和抗氧化酶活性測(cè)定

主根長(zhǎng)及側(cè)根數(shù)量的測(cè)量統(tǒng)計(jì)結(jié)束后，取根系鮮樣進(jìn)行MDA(丙二醛)含量及抗氧化酶活性的測(cè)定。

粗酶液的提取參考Wang等[11]的方法，并加以改進(jìn)。取0.3 g黃瓜胚根樣品，在冰浴中用研缽進(jìn)行研磨，研磨過(guò)程中分3次加入3 mL 50 mmol·L-1磷酸緩沖液，含0.2 mmol·L-1EDTA和2%(m/V)PVP；12 000g低溫離心20 min，該上清液即為酶液，用于各種抗氧化酶活性及MDA含量的測(cè)定。

MDA含量的測(cè)定采用硫代巴比妥酸法[12]，葉片提取物加入10%三氯乙酸(TCA)和0.65%硫代巴比妥酸(TBA)在95 ℃加熱25 min，測(cè)定D532和D600，兩者差值用于計(jì)算MDA含量。

抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)活性的測(cè)定采用Nakano等[13]的方法，并有所改進(jìn)。取100 mL酶液，加入1 700 mL 25 mmol·L-1PBS(pH 7.0，含0.1 mmol·L-1EDTA)、100 mL 5 mmol·L-1AsA 和100 mL 20 mmol·L-1H2O2，振蕩混勻，用紫外分光光度儀立即測(cè)定D290的動(dòng)力學(xué)變化，測(cè)定時(shí)長(zhǎng)為 40 s。

過(guò)氧化氫酶(CAT)活力測(cè)定參照Patra等[14]的方法，并有所改進(jìn)。取100 mL 酶液，加入1 700 mL 25 mmol·L-1PBS(pH 7.0，含0.1 mmol·L-1EDTA)和200 mL 100 mmol·L-1H2O2，振蕩混勻，在25 ℃下反應(yīng)，用紫外分光光度儀立即測(cè)定D470的動(dòng)力學(xué)變化，測(cè)定時(shí)長(zhǎng)為40 s。

超氧化物歧化酶(SOD)活力測(cè)定采用Steward等[15]的方法，并有所改進(jìn)。取50 mL酶液，加入3 mL NBT 反應(yīng)液(含50 mmol·L-1PBS，pH 7.8，0.1 mmol·L-1EDTA，13 mmol·L-1甲硫氨酸，63 μmol·L-1NBT，1.3 μmol·L-1核黃素)。在25 ℃、光強(qiáng)100 mmol·m-2·s-1下照光，直至顏色發(fā)生變化，然后將反應(yīng)液置于黑暗環(huán)境中終止反應(yīng)，測(cè)定D560的吸光值。

愈創(chuàng)木酚過(guò)氧化物酶(G-POD)活力測(cè)定參照Cakmak等[16]的方法，并有所改進(jìn)。取100 mL酶液，加入1 700 mL 25 mmol·L-1PBS(pH 7.0，含0.1 mmol·L-1EDTA)、100 mL 1%愈創(chuàng)木酚和100 mL 20 mmol·L-1H2O2，振蕩混勻，用紫外分光光度儀立即測(cè)定D470的動(dòng)力學(xué)變化，測(cè)定時(shí)長(zhǎng)為40 s。

可溶性蛋白含量測(cè)定根據(jù)Bradford[17]使用牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)，采用考馬斯亮藍(lán)G250法進(jìn)行測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel及stst方差分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用OriginPro 8作圖，以P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度EGCG對(duì)NaCl脅迫下黃瓜種子萌發(fā)的影響

由圖1可以看出，在非鹽脅迫條件下，10、100、1 000 μmol·L-1EGCG對(duì)黃瓜種子的發(fā)芽率沒(méi)有顯著影響，但對(duì)黃瓜種子發(fā)芽勢(shì)具有顯著促進(jìn)作用，分別提高了2.5百分點(diǎn)、10.0百分點(diǎn)與5.0百分點(diǎn)；10、100 μmol·L-1EGCG處理后，黃瓜種子發(fā)芽指數(shù)分別提高了1.2、1.8，但是1 000 μmol·L-1EGCG處理顯著降低了種子的發(fā)芽指數(shù)。200 mmol·L-1NaCl溶液處理黃瓜種子后，與對(duì)照相比，其發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)及發(fā)芽指數(shù)顯著下降了5百分點(diǎn)、70百分點(diǎn)和9.2。添加不同濃度EGCG后發(fā)現(xiàn)，10、100及1 000 μmol·L-1EGCG處理的種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)顯著高于對(duì)照，發(fā)芽率分別提高了2.5百分點(diǎn)、3.0百分點(diǎn)、3.0百分點(diǎn)，發(fā)芽勢(shì)分別提高了10.0百分點(diǎn)、22.5百分點(diǎn)、12.5百分點(diǎn)，發(fā)芽指數(shù)分別提高了2.0、2.7、1.8，其中，100 μmol·L-1EGCG對(duì)NaCl脅迫條件下黃瓜種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)及發(fā)芽指數(shù)的提高效果最佳。綜合以上結(jié)果說(shuō)明，100 μmol·L-1EGCG能夠有效緩解鹽脅迫對(duì)種子萌發(fā)產(chǎn)生的抑制作用。

沒(méi)有相同小寫(xiě)字母表示不同濃度處理下差異顯著(P<0.05)。下同。Different lowercase letters mean significant differences at 0.05 level. The same as below.圖1 不同濃度EGCG對(duì)NaCl脅迫下黃瓜種子萌發(fā)的影響Fig.1 Effects of different concentrations of EGCG on seed germination of cucumber under NaCl stress

2.2 不同濃度EGCG對(duì)NaCl脅迫下黃瓜種子主根長(zhǎng)、側(cè)根數(shù)量的影響

由圖2可以看出，在正常條件下，10 μmol·L-1EGCG能夠顯著促進(jìn)黃瓜主根的伸長(zhǎng)及側(cè)根數(shù)量的發(fā)生。但是200 mmol·L-1NaCl能夠顯著抑制黃瓜種子根系發(fā)育，其主根伸長(zhǎng)及側(cè)根均僅為非鹽脅迫條件下的2/3左右。在鹽脅迫條件下的黃瓜種子經(jīng)不同濃度EGCG處理之后，其主根長(zhǎng)與未經(jīng)EGCG處理相比均有不同程度的增長(zhǎng)，分別增長(zhǎng)了6.4%、15.3%和12.1%；但是，通過(guò)對(duì)側(cè)根數(shù)量的分析發(fā)現(xiàn)，僅100 μmol·L-1EGCG處理能提高側(cè)根數(shù)量。綜合以上結(jié)果表明，100 μmol·L-1EGCG能夠有效緩解NaCl脅迫對(duì)種子胚根生長(zhǎng)的抑制作用。

2.3 不同濃度EGCG對(duì)NaCl脅迫下黃瓜胚根中MDA含量的影響

由圖3可以看出，與處理Ⅰ(對(duì)照)相比，200 mmol·L-1NaCl脅迫條件下黃瓜胚根中MDA含量均顯著上升，說(shuō)明鹽脅迫使黃瓜種子胚根發(fā)生嚴(yán)重的膜質(zhì)過(guò)氧化，從而抑制了種子萌發(fā)。但是與未經(jīng)EGCG處理的黃瓜種子相比，經(jīng)10、100及1 000 μmol·L-1EGCG處理的黃瓜種子胚根中MDA含量均有所下降，分別僅為原來(lái)的85.3%、68.5% 和80.2%，可以看出100 μmol·L-1EGCG處理胚根中MDA含量最少。因此，我們可以得出結(jié)論，100 μmol·L-1EGCG處理能有效緩解鹽脅迫下黃瓜胚根的膜脂過(guò)氧化現(xiàn)象，從而緩解鹽脅迫對(duì)黃瓜種子萌發(fā)產(chǎn)生的抑制作用。

2.4 不同濃度EGCG對(duì)NaCl脅迫下黃瓜胚根抗氧化酶活性的影響

2.4.1 對(duì)APX活性的影響

在非鹽脅迫條件下，10與1 000 μmol·L-1EGCG 處理后黃瓜種子胚根中的APX活性與處理Ⅰ(對(duì)照)相比無(wú)明顯差異，而100 μmol·L-1EGCG 處理后黃瓜胚根中的APX活性比處理Ⅰ(對(duì)照)明顯降低。在200 mmol·L-1NaCl脅迫條件下，不同濃度 EGCG 處理的APX活性均比非鹽脅迫條件下的顯著增強(qiáng)。與未經(jīng)EGCG處理的相比，不同濃度 EGCG 處理后黃瓜胚根APX活性均不同程度地增強(qiáng)，其中以100和1 000 μmol·L-1EGCG處理的增強(qiáng)效果最為明顯，分別升高了27.5% 和38.3%(圖4-A)。

2.4.2 對(duì)CAT活性的影響

圖4-B所示，在非鹽脅迫條件下，10和1 000 μmol·L-1EGCG 處理后黃瓜種子胚根中的CAT活性與處理Ⅰ(對(duì)照)相比無(wú)明顯差異，而100 μmol·L-1EGCG 處理后根系中APX活性則明顯降低。在200 mmol·L-1NaCl脅迫條件下，不同濃度EGCG處理后CAT活性均比非鹽脅迫條件下的顯著增強(qiáng)。與未經(jīng)EGCG處理的相比，不同濃度EGCG處理后胚根CAT活性均不同程度地增強(qiáng)，其中以10、100 μmol·L-1EGCG處理后增強(qiáng)效果最為明顯，分別升高了21.5%和16.0%。

圖2 不同濃度EGCG對(duì)NaCl脅迫下黃瓜種子主根長(zhǎng)、側(cè)根數(shù)量的影響Fig.2 Effects of different concentration of EGCG on radicle length and root branch number of cucumber seeds under NaCl stress

圖3 不同濃度EGCG對(duì)NaCl脅迫下黃瓜胚根MDA含量的影響Fig.3 Effect of different concentrations of EGCG on MDA content in cucumber radicle under NaCl stress

2.4.3 對(duì)SOD活性的影響

圖4-C結(jié)果表明，在非鹽脅迫條件下，不同濃度EGCG處理后黃瓜種子胚根中的SOD活性與處理Ⅰ(對(duì)照)相比均不同程度地增強(qiáng)，以100、1 000 μmol·L-1EGCG處理后增強(qiáng)效果最明顯。在200 mmol·L-1NaCl脅迫條件下，不同濃度EGCG處理后SOD活性與非鹽脅迫條件下的相比均表現(xiàn)出不同程度的增強(qiáng)。與未經(jīng)EGCG處理的相比，不同濃度EGCG處理后黃瓜根系中SOD活性均不同程度地增強(qiáng)，其中100 μmol·L-1EGCG處理后胚根SOD活性增強(qiáng)效果最明顯，提高了36.3%。

2.4.4 對(duì)POD活性的影響

圖4-D結(jié)果顯示，在非鹽脅迫條件下，不同濃度EGCG處理的黃瓜種子胚根中的POD活性與處理Ⅰ(對(duì)照)相比均不同程度地增強(qiáng)，以100和1 000 μmol·L-1EGCG處理后的增強(qiáng)最明顯。200 mmol·L-1NaCl脅迫條件下，不同濃度EGCG處理后的POD活性與非鹽脅迫條件下無(wú)顯著差異。與未經(jīng)EGCG處理的相比，不同濃度EGCG處理后的POD活性均不同程度地增強(qiáng)，其中100 μmol·L-1EGCG處理的胚根POD活性增強(qiáng)最明顯，升高了25.1%。

3 討論

圖4 不同濃度EGCG對(duì)NaCl脅迫下黃瓜種子胚根抗氧化酶活性的影響Fig.4 Effect of different concentrations of EGCG on the activities of antioxidant enzymes in cucumber radicle under NaCl stress

種子萌發(fā)是一個(gè)復(fù)雜的生理過(guò)程，同時(shí)也是植物發(fā)育的重要階段。黃瓜耐鹽堿能力較差，一般喜歡中性偏酸的土壤，以pH 6.0～6.8最好。侯梁宇等[18]研究表明，不同濃度的NaCl脅迫對(duì)黃瓜種子的萌發(fā)具有不同的效果。在本研究中，我們首先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)篩選出合適的NaCl濃度為200 mmol·L-1，用于后續(xù)試驗(yàn)。

大量研究表明，某些化感物質(zhì)能夠刺激種子萌發(fā)或者抑制種子萌發(fā)。Kanmaz等[19]研究表明，在亞麻籽萌發(fā)后和萌發(fā)期間黃酮類(lèi)化合物含量都增加，并且隨萌發(fā)率的增加而增加。侯建霞[20]對(duì)苦蕎麥萌發(fā)過(guò)程中活性成分進(jìn)行測(cè)定后發(fā)現(xiàn)，蕎麥黃酮的含量隨著種子萌發(fā)過(guò)程的推進(jìn)而不斷增加。郭亞姣等[21]通過(guò)研究黃頂菊葉片中的黃酮類(lèi)化合物對(duì)白菜種子萌發(fā)的影響發(fā)現(xiàn)，隨著黃酮類(lèi)化合物濃度的不斷增加，白菜種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均呈逐漸下降趨勢(shì)。以上研究均表明，黃酮類(lèi)化合物對(duì)種子萌發(fā)能產(chǎn)生一定的影響。

前人研究認(rèn)為，NaCl可能通過(guò)影響水勢(shì)、改變代謝過(guò)程、破壞細(xì)胞膜、降低細(xì)胞的擴(kuò)增和分裂等途徑影響種子萌發(fā)[22]。另外，NaCl處理能夠引起細(xì)胞的氧化應(yīng)激現(xiàn)象，這種現(xiàn)象也與種子的萌發(fā)有密切的聯(lián)系[23]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，200 mmol·L-1NaCl脅迫下黃瓜種子的發(fā)芽率顯著降低。在200 mmol·L-1NaCl脅迫條件下的黃瓜種子再經(jīng)不同濃度的EGCG處理之后，其萌發(fā)受到了不同程度的促進(jìn)，說(shuō)明不同濃度的EGCG均能提高種子的耐鹽能力。其中以100 mmol·L-1EGCG處理促進(jìn)作用最明顯，表現(xiàn)為萌發(fā)速度更快、發(fā)芽率更高、萌發(fā)更整齊。同時(shí)，在鹽脅迫條件下，經(jīng)不同濃度EGCG處理的黃瓜種子主根長(zhǎng)及側(cè)根數(shù)目均有不同程度的增長(zhǎng)，以100 μmol·L-1EGCG的促進(jìn)效果最為顯著。有研究猜測(cè)，兒茶素調(diào)控?cái)M南芥的生長(zhǎng)發(fā)育可能是通過(guò)改變植株的根冠形態(tài)、葉片的氣孔交換、IAA含量和分布來(lái)實(shí)現(xiàn)的[24]。然而，關(guān)于兒茶素能夠促進(jìn)植株根系生長(zhǎng)的機(jī)理尚不明確，這種促進(jìn)作用可能涉及分生組織細(xì)胞的化學(xué)反應(yīng)，比如由擴(kuò)張蛋白、纖維素內(nèi)切酶或者木葡聚糖內(nèi)切酶的反應(yīng)以及由ROS誘導(dǎo)的非酶促過(guò)程[9]。

MDA含量表征著細(xì)胞膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的受害程度[25]，一定程度上反映細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度。植物體在遭遇脅迫時(shí)，活性氧積累能夠啟動(dòng)膜脂的過(guò)氧化作用，引起膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的增加[26]。在鹽脅迫條件下，與未經(jīng)EGCG處理相比，不同濃度EGCG處理后根系中MDA含量均表現(xiàn)出不同程度的下降(圖3)，其中，以100 μmol·L-1EGCG處理的MDA含量最低，說(shuō)明100 μmol·L-1EGCG處理后黃瓜根系膜系統(tǒng)受損程度最低。

逆境脅迫往往會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞內(nèi)活性氧的動(dòng)態(tài)平衡破壞，而超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)、過(guò)氧化物酶(POD)等能夠有效清除植物細(xì)胞內(nèi)的自由基，是反映植物抗逆性的重要生理指標(biāo)[27-28]。大量研究表明，在植株遭受環(huán)境脅迫時(shí)，外源黃酮類(lèi)物質(zhì)能夠緩解植株的受損傷程度，從而維持植株生命活動(dòng)的正常運(yùn)行[29-30]。在鹽脅迫條件下，與未經(jīng)EGCG處理相比，不同濃度EGCG處理后APX、CAT、SOD、POD活性均表現(xiàn)出不同程度的增強(qiáng)(圖4)，說(shuō)明EGCG能提高NaCl脅迫下種子的抗氧化能力。其中APX活性呈逐漸上升趨勢(shì)，CAT、SOD、POD活性呈先上升后下降的趨勢(shì)。但是各種酶活性的變化趨勢(shì)具有一定差異，可能與植物種類(lèi)、脅迫時(shí)間及脅迫程度以及外源物質(zhì)作用時(shí)間長(zhǎng)短不同有關(guān)[31]。

綜上所述，在200 mmol·L-1NaCl脅迫下，外源添加不同濃度EGCG能夠促進(jìn)黃瓜種子的萌發(fā)，其中100 μmol·L-1EGCG對(duì)NaCl脅迫的緩解作用最明顯，這可能是由于該濃度下EGCG處理能夠提高NaCl脅迫下黃瓜體內(nèi)的抗氧化酶活性，從而促進(jìn)植株對(duì)活性氧的清除，以此來(lái)維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性，從而保護(hù)植株不受傷害，這也與Yiu等[32]在番茄澇害上的研究是一致的。因此，可以將合適濃度的EGCG用于種子萌發(fā)，以緩解環(huán)境脅迫對(duì)種子萌發(fā)造成的抑制。但是EGCG的作用效果可能會(huì)由于種子品種、EGCG處理的濃度的不同和時(shí)間長(zhǎng)短而出現(xiàn)差異[24，33]。因此關(guān)于EGCG對(duì)脅迫條件下種子萌發(fā)的影響還需做進(jìn)一步的研究。