謝昀燁，曾思錦，袁 月，王連平，方 麗，王漢榮，*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)與微生物研究所，浙江 杭州 310021；2.長(zhǎng)江大學(xué) 園藝園林學(xué)院，湖北 荊州 434000；3.新昌縣清河茶葉專(zhuān)業(yè)合作社，浙江 新昌 312500)

茶葉(Camelliasinensis)作為我國(guó)的一種傳統(tǒng)保健飲品，廣為人們所喜愛(ài)，也是重要的具有中國(guó)特色的出口商品之一。而茶葉炭疽病是茶樹(shù)葉部的主要病害之一，在浙江、福建、貴州等主要產(chǎn)茶省份均有發(fā)生[1-3]。該病害主要侵染成葉，在嫩葉和老葉上也有發(fā)生，發(fā)病后葉部出現(xiàn)病斑，影響光合作用，造成早期落葉，植株生長(zhǎng)勢(shì)變?nèi)?，影響茶的產(chǎn)量與質(zhì)量[4]。據(jù)報(bào)道，我國(guó)能侵染茶樹(shù)引起炭疽病的病原菌有9種，分別是山茶刺盤(pán)孢菌(Colletotrichumcamelliae)[5-7]、 雕刻刺盤(pán)孢菌(C.carveri)[8]、殼皮炭疽菌(C.crassipes)、果生刺盤(pán)孢菌(C.fructicola)[8，10]、膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)[5，9-10]、河南刺盤(pán)孢菌(C.henanense)[8，10-11]、馬尤斯刺盤(pán)孢菌(C.majus)[9-10]、暹羅刺盤(pán)孢菌(C.siamense)[6，11]和江西刺盤(pán)孢菌(C.jiangxiense)[10-11]。

2016年7月，浙江省新昌縣東茗村茶葉基地大面積發(fā)生茶葉炭疽病，田間濕度大時(shí)發(fā)病面積高達(dá)70%左右，嚴(yán)重影響了茶葉的產(chǎn)量及質(zhì)量。茶農(nóng)由于缺乏對(duì)該病的了解，盲目用藥，導(dǎo)致農(nóng)藥殘留超標(biāo)等茶葉質(zhì)量安全隱患，嚴(yán)重影響了浙江省茶農(nóng)增收。為此，我們對(duì)該基地的茶葉炭疽病進(jìn)行了調(diào)查和病原菌分離鑒定，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)篩選出對(duì)該病原菌有一定抑制作用的殺菌劑，以期為浙江省新昌縣茶葉炭疽病的防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病樣采集

從浙江省新昌縣茶葉基地采集具有典型炭疽病癥狀的樣本，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離鑒定。

1.2 病原菌分離及純化

采用組織分離法對(duì)病原菌進(jìn)行分離，將葉片浸泡在70%乙醇中1 min進(jìn)行表面消毒，無(wú)菌水浸洗3次后晾干，在茶葉病斑的病健交界處用滅過(guò)菌的剪刀剪取5 mm2大小的組織塊，用滅菌的鑷子夾至PDA平板，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待菌絲長(zhǎng)出之后挑取生長(zhǎng)外緣的菌絲塊轉(zhuǎn)至新的PDA平板中進(jìn)行菌株純化，標(biāo)記為CHY1、CHY2、CHY3、CHY4、CHY5和CHY6。

1.3 病原菌形態(tài)觀察

經(jīng)顯微觀察后6個(gè)菌株均為同一菌種，并選取代表性菌株CHY4作為供試菌株。將純化好的CHY4菌株轉(zhuǎn)至PDA平板中，25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后，對(duì)病原的菌落形態(tài)、孢子形態(tài)大小及顏色進(jìn)行觀察描述并拍照。

1.4 病原菌致病性測(cè)定

采用傷口接種法對(duì)健康的茶樹(shù)植株葉片進(jìn)行接種試驗(yàn)。刮取培養(yǎng)2周的CHY4菌株的菌落表面孢子，用無(wú)菌水配置成107mL-1的孢子懸浮液噴在葉片上，置于光照培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)5 d后觀察記錄葉片發(fā)病狀況。

1.5 病原菌rDNA ITS序列的測(cè)定

采用CTAB法對(duì)菌株CHY4進(jìn)行DNA提取，并針對(duì)其核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)間(rDNA-ITS)片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物為ITS1/ITS4(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′/5′-TCCTCCGCTATTGATATGC-3′)。將PCR產(chǎn)物送至上海生物有限公司進(jìn)行純化并測(cè)序，并通過(guò)GenBank基因序列庫(kù)內(nèi)序列信息進(jìn)行比對(duì)，獲得基因序列號(hào)。

1.6 病原菌藥劑敏感性測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率法[12]對(duì)病原菌進(jìn)行15種殺菌劑的篩選，供試藥劑有：250 g·L-1吡唑醚菌酯乳油(巴斯夫植物保護(hù)(江蘇)有限公司)、65%代森鋅可濕性粉劑(山東利邦農(nóng)化有限公司)、45%咪鮮胺微乳劑(北京中農(nóng)研制高科技有限公司)、250 g·L-1丙環(huán)唑乳油(青島金爾農(nóng)化研制開(kāi)發(fā)有限公司)、70%甲基硫菌靈可濕性粉劑(江蘇龍燈化學(xué)有限公司)、325 g·L-1苯甲·嘧菌酯懸浮劑(瑞士先正達(dá)作物保護(hù)有限公司)、10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑(山東榮邦化工有限公司)、430 g·L-1戊唑醇懸浮劑(青島金爾農(nóng)化研制開(kāi)發(fā)有限公司)、38%唑醚·啶酰菌水分散粒劑(巴斯夫歐洲公司)、10%己唑醇懸浮劑(江西海闊利斯生物科技有限公司)、12.5%烯唑醇可濕性粉劑(江蘇輝豐農(nóng)化股份有限公司)、25 g·L-1咯菌腈懸浮種衣劑(先正達(dá)南通作物保護(hù)有限公司)、42.8%氟菌·肟菌酯懸浮劑(德國(guó)拜耳作物科學(xué)公司)、50%多菌靈可濕性粉劑(蘇州遍凈植?？萍加邢薰?、50%啶酰菌胺水分散粒劑(巴斯夫歐洲公司)。CHY4為供試菌株，將供試藥劑配制成質(zhì)量濃度分別為1×103、1×102、10、1、1×10-1、1×10-2mg·L-1的含毒平板。將活化好的菌株用打孔器打取直徑為5 mm的菌餅，然后用無(wú)菌的鑷子夾至含毒平板中央，菌絲面朝下，72 h后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。以加等量無(wú)菌水的PDA平板為對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)。根據(jù)藥劑對(duì)病原菌的生長(zhǎng)抑制率查得幾率值，并建立毒力回歸方程，計(jì)算出其有效中濃度(EC50)和抑菌率為90%所對(duì)應(yīng)的濃度(EC90)，比較各殺菌劑對(duì)該病原菌的敏感性程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀描述

2016年5—11月對(duì)浙江省新昌縣東茗鄉(xiāng)茶葉基地種植的品種為龍井43號(hào)的茶樹(shù)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)該病主要發(fā)生在葉部，多發(fā)在老葉上，嫩葉上發(fā)病率較少；8—11月為該病的高發(fā)期，發(fā)病面積高達(dá)70%左右，茶園內(nèi)茶樹(shù)下部葉片呈火燒狀，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)連成一片。茶園內(nèi)發(fā)病而引起的落葉不及時(shí)清理可加重茶樹(shù)的發(fā)病率。該病原菌多由葉尖或葉緣開(kāi)始侵染，病斑形狀不規(guī)則，初為水漬狀暗綠色小點(diǎn)，后擴(kuò)大變?yōu)榧t褐色，病斑大小不一，發(fā)病后期病斑轉(zhuǎn)為灰白色，且可清晰觀察到深褐色小粒點(diǎn)，即分生孢子盤(pán)(圖1)。

2.2 病原菌分離及純化

對(duì)采集得到的具有明顯病害癥狀的病斑進(jìn)行分離，所有樣本均分離純化得到相似菌株，抽取6個(gè)菌株并編號(hào)為CHY1-6，保存于浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所。

圖1 新昌茶葉炭疽病田間病害癥狀Fig.1 Field symptoms of tea anthracnose in Xinchang

2.3 病原菌致病性測(cè)定

將配置好的分離物孢子懸浮液(107mL-1)接種在健康的茶樹(shù)葉片上，5 d后發(fā)現(xiàn)接種的葉片出現(xiàn)水漬狀小點(diǎn)，2周后沿葉尖或葉緣逐漸擴(kuò)大，濕度大時(shí)病斑為棕褐色，病健交界處明顯，與田間發(fā)病癥狀一致，重新分離后的分離物與接種病原菌一致(圖2)。清水對(duì)照接種的葉片均未發(fā)病。

2.4 病原菌形態(tài)學(xué)特征

CHY4菌株在PDA培養(yǎng)基上菌落為灰綠色，菌絲呈放射狀，菌絲茂盛，3 d后呈毛絨狀。2周后可在菌落中央產(chǎn)生大量散生的橘紅色分生孢子堆；分生孢子無(wú)色單孢，表面光滑、圓柱形、兩端鈍圓，(8.7～17.8)μm×(3.5～6.1)μm；分生孢子盤(pán)珊狀，長(zhǎng)90～180 μm，著生于茶葉表皮，未見(jiàn)剛毛(圖3)。

2.5 病原菌rDNA ITS序列的測(cè)定與比較

CHY4菌株的ITS序列PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)長(zhǎng)度約為500 bp(圖4)，將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物送至上海生工生物公司進(jìn)行序列測(cè)序。測(cè)序所得550 bp序列(GenBank登錄號(hào)為MF918484)結(jié)果與GenBank基因庫(kù)內(nèi)信息進(jìn)行Blast比對(duì)，與Colletotrichumgloeosporioides(HM013821)相似度達(dá)100%，進(jìn)一步確定引起的茶葉炭疽病的致病菌為膠孢炭疽菌。

2.6 病原菌藥劑敏感性測(cè)定

15種藥劑對(duì)茶葉炭疽病病原菌的敏感性結(jié)果見(jiàn)表1。代森鋅(藍(lán)鉆)、咪鮮胺(中研)、丙環(huán)唑(金阿泰)和甲基硫菌靈(日曹)對(duì)茶葉炭疽病菌絲生長(zhǎng)的抑制效果很好，其EC50值均小于1 mg·L-1；苯甲·嘧菌酯(阿米妙收)、苯醚甲環(huán)唑(凱高)、戊唑醇(青島金爾)、唑醚·啶酰菌(凱津)和己唑醇(治杰)對(duì)茶葉炭疽病菌絲生長(zhǎng)的抑制效果較好，其EC50值均大于1 mg·L-1且小于10 mg·L-1；烯唑醇(禾果利)、咯菌腈(適樂(lè)時(shí))和氟菌·肟菌脂(露娜森)的效果相對(duì)較差，EC50值分別為13.910 3、163.464 5和202.907 8 mg·L-1；多菌靈(吳農(nóng))和啶酰菌胺(凱澤)對(duì)茶葉炭疽病菌絲生長(zhǎng)基本沒(méi)效果，EC50值分別為1 821.687 1和994 444.789 3 mg·L-1。

A， 對(duì)照；B和C，接種葉片。A， CK; B & C， Inoculated leaves.圖2 茶葉炭疽病葉部接種發(fā)病癥狀(CHY4)Fig.2 Symptom on Camellia sinensis leaves after inoculation (CHY4)

A，菌落形態(tài)；B，分生孢子盤(pán)；C，分生孢子。A， Colony on PDA; B， Acervulus on Camellia sinensis; C， Conidia.圖3 新昌茶葉炭疽病病原菌菌落、分生孢子盤(pán)、分生孢子形態(tài)及顯微結(jié)構(gòu)特征Fig.3 Morphological characteristics of the pathogen Colletotrichum gloeosporioides

A，10 000 bp 基因標(biāo)尺；B，目標(biāo)病原菌電泳圖(泳道1為基因標(biāo)尺；泳道2為菌株CHY4 ITS擴(kuò)增條帶)。A， 10 000 bp DNA marker; B， Agarose gel electrophoresis picture(Lane 1， DNA marker; Lane 2， Gene band of CHY4 strain).圖4 炭疽病病原菌CHY4 菌株ITS序列擴(kuò)增電泳圖Fig.4 Agarose gel electrophoresis of ITS sequence of the pathogen Colletotrichum gloeosporioides (CHY4)

3 討論

從浙江省新昌縣茶葉基地發(fā)病的茶葉葉片中分離得到致病性菌株。根據(jù)該病原菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征、培養(yǎng)性狀、分子鑒定結(jié)果表明：分離得到的病原菌為膠孢炭疽菌。目前，已有9種炭疽菌屬真菌可引起茶樹(shù)的炭疽病，引起浙江省茶樹(shù)炭疽的有C.camelliae、C.fructicola和C.karstii，而C.gloeosporioides僅在福建、安徽和江西的茶樹(shù)上發(fā)現(xiàn)。C.gloeosporioides的寄主非常廣，可侵染樹(shù)木和花卉等植物，而膠孢炭疽菌引起的油茶炭疽病也是油茶的主要病害[13-14]。本研究中新昌縣龍井43號(hào)為茶園的主要品種，2015年凌光漢等[15]對(duì)該地區(qū)的茶樹(shù)炭疽病的發(fā)生與防治進(jìn)行了報(bào)道，但是并沒(méi)有確定病原菌種類(lèi)。

表1 15種殺菌劑對(duì)茶葉炭疽病的毒力回歸方程及EC50、EC90值

本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了15種殺菌劑對(duì)新昌茶樹(shù)炭疽病病原菌的敏感性，其中250 g·L-1吡唑醚菌酯、65%代森鋅、45%咪鮮胺、250 g·L-1丙環(huán)唑和70%甲基硫菌靈對(duì)茶葉炭疽病菌絲生長(zhǎng)的抑制效果非常好，EC50值均在1 mg·L-1以下；劉偉[16]在對(duì)湖北省油茶炭疽病的藥劑防治試驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，10%苯醚甲環(huán)唑、25%丙環(huán)唑乳油和12.5%戊唑醇可濕性粉劑對(duì)膠孢炭疽菌都有良好的防治效果，這與本實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果相一致，雖然寄主上有差別，但是對(duì)膠孢炭疽菌的抑制效果相差不大；曹志華等[17]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣認(rèn)為，10%苯醚甲環(huán)唑?qū)δz孢炭疽菌的效果較好，但是25%的咪鮮胺和80%多菌靈的效果并不明顯，而本實(shí)驗(yàn)中選用的45%咪鮮胺對(duì)膠孢炭疽菌的效果較好，說(shuō)明高濃度的咪鮮胺對(duì)該病原菌的效果較好，但是增加藥劑的濃度有可能會(huì)增加茶葉的農(nóng)藥殘留量。然而室內(nèi)藥劑篩選試驗(yàn)具有可控性，而田間病害的發(fā)生環(huán)境難以控制，因此室內(nèi)藥劑篩選的結(jié)果還需要田間藥效試驗(yàn)的驗(yàn)證。2015年唐美君等[18]對(duì)茶樹(shù)炭疽病進(jìn)行了田間藥效試驗(yàn)，結(jié)果表明，250 g·L-1吡唑醚菌酯對(duì)炭疽病的田間防效可達(dá)到89.2%～98.2%，說(shuō)明吡唑醚菌酯不僅在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)對(duì)病原菌生長(zhǎng)有抑制作用，在田間對(duì)病害的發(fā)生也有較好的控制作用。因此，我們建議使用250 g·L-1吡唑醚菌酯對(duì)田間茶炭疽病進(jìn)行防控。