王 華，汪王微，王冬良，張石虎，胡新芳，盧詩(shī)雨，龔雪梅

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院 觀賞園藝系，安徽 合肥 230036； 2.阜陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生化工程系，安徽 阜陽(yáng) 236031)

杜鵑屬 (Rhododendron) 植物大多花美色艷，是中國(guó)乃至世界著名的觀賞植物。但是，時(shí)至今日，杜鵑花在中國(guó)園林中的應(yīng)用依然相對(duì)較少，其主要原因在于野生杜鵑引種栽培后生長(zhǎng)或開花不良，景觀效果不理想。為此，國(guó)內(nèi)外學(xué)者開展了杜鵑對(duì)環(huán)境需求的研究，如光照[1-2]、溫度[3-5]、水分[6]、土壤[7]等，這些研究為制定杜鵑花合理引種栽培策略提供了理論依據(jù)，但都僅從形態(tài)學(xué)、生理生化或葉片超微結(jié)構(gòu)方面進(jìn)行探討，而對(duì)逆境條件下杜鵑花代謝相關(guān)基因及其功能研究鮮有報(bào)道。利用Illumina sequencing進(jìn)行第二代高通量測(cè)序可在較短的時(shí)間內(nèi)獲取海量數(shù)據(jù)，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。近年來，利用這一技術(shù)已成功地對(duì)多種植物的逆境脅迫進(jìn)行了研究。楊偉等[8]以枇杷幼果為試材，研究低溫脅迫下幼果轉(zhuǎn)錄組Denovo組裝和功能注釋，應(yīng)用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)得到64 814條Unigenes，注釋到了4 017個(gè)差異表達(dá)基因，為枇杷的抗旱基因挖掘提供了資料。韓超等[9]以高溫和適溫下的梭枝條為實(shí)驗(yàn)材料，利用Solexa測(cè)序技術(shù)，獲得了162 504個(gè)差異表達(dá)基因，為研究高溫脅迫下梭梭的分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。黃玉蘭等[10]以薏苡苗期葉片為實(shí)驗(yàn)材料，通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得了92 865條Unigenes，通過與基因本體(gene ontology，GO)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)可能有1 053條Unigenes參與干旱脅迫。彭振等[11]以棉花幼苗真葉為材料，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-Seq)技術(shù)分析其在鹽脅迫下轉(zhuǎn)錄因子家族及轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了大量的鹽脅迫響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子，且隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，棉花對(duì)鹽響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子急劇增加。

本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)杜鵑花白鳳4號(hào)中部功能葉進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行注釋和分析，可以有效地發(fā)掘和鑒定杜鵑花抗逆代謝相關(guān)調(diào)控基因，為克隆開發(fā)杜鵑花重要抗逆功能基因提供有力的研究基礎(chǔ)，為杜鵑花選育、擴(kuò)大園林應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

于2016年7月，以安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)基地所栽種的長(zhǎng)勢(shì)良好的2年生杜鵑花白鳳4號(hào)為材料，取從上往下第2-4片成熟功能葉用于總RNA的提取。

1.2 樣品處理及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)分析流程

采用 TIANGEN 公司生產(chǎn)的多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(RNAprep Pure Plant Kit Polysaccharides﹠Polyphenolics-rich) 進(jìn)行杜鵑花葉片的總RNA提取。取葉片100 mg加入液氮研磨至粉末狀，總RNA的提取流程參照RNAprep Pure Plant Kit說明書(離心柱型)(天根生化科技(北京)有限公司)方案進(jìn)行。杜鵑花轉(zhuǎn)錄組序列的測(cè)定和組裝分析委托廣州基地奧公司進(jìn)行。利用Oligo(dT)磁珠從總RNA中純化mRNA，將mRNA打斷為片段，構(gòu)建杜鵑花葉片轉(zhuǎn)錄組的cDNA文庫(kù)，將通過質(zhì)量檢測(cè)后所構(gòu)建的文庫(kù)用第二代測(cè)序儀IlluminaHi Seq TM 2000進(jìn)行測(cè)序，并對(duì)所獲得的序列運(yùn)用Trinity軟件進(jìn)行Denovo拼接組裝。隨后，將組裝得到的杜鵑花轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)與公共數(shù)據(jù)庫(kù)(NR、Swiss-Prot、KOG、KEGG和GO)進(jìn)行比對(duì)，對(duì)基因注釋、基因功能分類及轉(zhuǎn)錄因子等進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 杜鵑花白鳳4號(hào)轉(zhuǎn)錄組組裝質(zhì)量分析

在對(duì)杜鵑花的葉片樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后，通過嚴(yán)格質(zhì)量控制和數(shù)據(jù)過濾，共檢測(cè)得到213 723 424個(gè)高質(zhì)量Clean reads，占總數(shù)的95.05%，過濾后質(zhì)量閾值≥20。采用Trinity軟件，對(duì)這些高質(zhì)量數(shù)據(jù)進(jìn)行Denovo組裝，得到N50為1 600 nt，平均長(zhǎng)度為930 nt，GC核苷酸的含量(GC%)為48.05%的杜鵑花Unigene 53 568 條(不含N的組裝片段)，其最大長(zhǎng)度為13 121 nt，最小長(zhǎng)度為201 nt(表1)。對(duì)組裝出來的Unigene做長(zhǎng)度分布統(tǒng)計(jì)(圖1)，在組裝得到的Unigene中，片段長(zhǎng)度大于3 000 nt的共有2 331個(gè)。

2.2 杜鵑花白鳳4號(hào)基因注釋信息

將所得到的Unigene序列利用BLAST工具分別與NR、Swiss-Prot、KOG和KEGG進(jìn)行比對(duì)，共有28 877條Unigenes (閾值e-value<1E-5)得到注釋，占基因總數(shù)的53.90%，其中比對(duì)到Nr庫(kù)的有28 626個(gè)Unigenes，占比對(duì)上基因的99.13%，且有14 465個(gè)Unigenes的長(zhǎng)度≥1 000 nt。在Swiss-Prot、KOG和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中共有21 548，18 283和11 409條Unigenes獲得注釋信息(表2)，而且在四大庫(kù)中都比對(duì)上的基因有9 162個(gè)，而在四大庫(kù)中沒有任何比對(duì)信息的Unigenes有24 691條(占基因總數(shù)的46.09%)。

2.2.1 杜鵑花白鳳4號(hào)轉(zhuǎn)錄組Unigenes在Nr數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)結(jié)果分析

進(jìn)一步對(duì)在Nr中比對(duì)上的基因進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2。從圖2-A可以看出，有59.65%的轉(zhuǎn)錄物序列具有極強(qiáng)的同源比對(duì)信息(e-value<1E-50)，而且有40.34%的轉(zhuǎn)錄物序列相似性E值在1.0E-5～1.0E-50，說明同源性比對(duì)效果較好。

圖1 杜鵑花白鳳4號(hào)轉(zhuǎn)錄組Unigenes長(zhǎng)度分布Fig.1 Assembled Unigenes length distribution of Rhododendron pulchurum cv. Baifeng 4 transcriptome

對(duì)杜鵑花轉(zhuǎn)錄組所有Unigene的CDS進(jìn)行預(yù)測(cè)，共通過BLAST比對(duì)獲得CDS序列28 455個(gè)，利用ESTscan數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行分析，可獲得CDS序列1 897個(gè)。

收集有Nr注釋的28 626條Unigene并與其他物種進(jìn)行比對(duì)，統(tǒng)計(jì)其物種信息如圖2-B。杜鵑花在葡萄(Vitisvinifera)、可可(Theobromacacao)、芝麻(Sesamumindicum)、蓮(Nelumbonucifera)、麻風(fēng)樹(Jatrophacurcas)、梅(Prunusmume)、絨毛狀煙草(Nicotianatomentosiformis)、林煙草(Nicotianasylvestris)、亞洲棉(Gossypiumarboreum)和甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)中都有同源序列分布，與葡萄有較高的同源性，有16.94%的同源序列。除此以外，與其他9個(gè)植物種類的同源性均相對(duì)較低，同源序列都不足10%，還有45.18%的Unigenes屬于其他序列。

A，Nr庫(kù)注釋結(jié)果E值分布圖；B，Nr庫(kù)注釋結(jié)果(E值最低)物種分布統(tǒng)計(jì)圖。A， E value distribution map of Unigenes annotation in Nr database; B， Statistics of species distribution of Unigenes annotation in Nr database( The E values were minimum).圖2 杜鵑花白鳳4號(hào)Nr庫(kù)比對(duì)Unigenes分析Fig.2 Analysis of Unigenes annotation of Rhododendron pulchurum cv. Baifeng 4 in Nr database

2.2.2 杜鵑花白鳳4號(hào)轉(zhuǎn)錄組Unigenes KOG功能分類

通過將轉(zhuǎn)錄組的Unigenes與KOG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，可注釋得到30 508個(gè)有功能信息的Unigenes。依照其注釋功能可劃分為25類(圖3-A，W，Y，Z)，通過對(duì)每一類KOG注釋的基因功能進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)，可獲得杜鵑花轉(zhuǎn)錄組中各類功能基因的數(shù)量分布信息(圖3)。其中，一般功能預(yù)測(cè)所擁有的Unigenes最多，有6 692條，所占比例最大，達(dá)到21.94%。其他所占比例達(dá)到5%以上的基因分類還有蛋白質(zhì)翻譯后修飾與轉(zhuǎn)運(yùn)、分子伴侶(3 433，11.25%)，信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制(3 257，10.68%)，翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與生物合成(1 803，5.91%)，RNA加工與修飾(1 774，5.81%)和轉(zhuǎn)錄(1 601，5.24%)，而核苷酸運(yùn)輸與代謝(251，0.82%)、輔酶運(yùn)輸與代謝(227，0.74%)、防御機(jī)制(171，0.56%)、胞外結(jié)構(gòu)(90，0.30%)、核酸結(jié)構(gòu)(83，0.27%)和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)(10，0.03%)所占比例都不足1%。其他包括脂類轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝(963，3.16%)、無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝(578，1.89%)和胞壁/細(xì)胞膜/細(xì)胞被膜再生(325，1.07%)在內(nèi)的13個(gè)基因分類所占比例均在1%～5%(圖3)。

2.2.3 杜鵑花白鳳4號(hào)轉(zhuǎn)錄組Unigenes的GO功能分類分析

通過GO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行杜鵑花轉(zhuǎn)錄組功能分析，共有17 218個(gè)Unigenes注釋到生物過程、細(xì)胞組分類和分子功能類三個(gè)方面的功能，共計(jì)55個(gè)不同的功能分支(表3)。其中有38 434個(gè)Unigenes注釋到生物過程，其中代謝過程、細(xì)胞過程占絕大多數(shù)，其次是單一的生物過程和刺激反應(yīng)；在細(xì)胞組分功能中注釋到33 059個(gè)Unigenes，其中占比例最高的是細(xì)胞和細(xì)胞部分，其次是細(xì)胞器和細(xì)胞膜；與分子功能相關(guān)的Unigenes有19 752個(gè)，其中具有催化活性和綁定的Unigenes最多，其次是輸送分子和結(jié)構(gòu)分子。

進(jìn)一步對(duì)GO注釋中與抗逆相關(guān)的注釋進(jìn)行梳理，共發(fā)現(xiàn)11 928條注釋(表4)，其中注釋最多的為參與各類環(huán)境應(yīng)激響應(yīng)的注釋(6 896條)，其他依次為蛋白激酶(1 454條)、激素代謝(59條)相關(guān)、滲透調(diào)節(jié)(460條)、氧化還原反應(yīng)(2 004條)、受體(469條)有關(guān)，以及離子轉(zhuǎn)運(yùn)(586條)相關(guān)。

2.2.4 杜鵑花白鳳4號(hào)Unigenes的KEGG代謝途徑分類分析

在杜鵑花的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中共有6 475個(gè)基因可以通過Blast比對(duì)注釋到132類KEGG的代謝通路中，屬于基因信息處理的有21條代謝通路，且Unigenes超過200個(gè)的有核糖體(775)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工(354)，剪接體(348)和RNA轉(zhuǎn)運(yùn)(287)屬于新陳代謝的有99條代謝途徑，含有200個(gè)以上Unigenes的有碳代謝(389)，氨基酸生物合成(311)，氧化磷酸化(235)，淀粉與蔗糖代謝(221)，糖酵解途徑(213)和嘌呤代謝(202)；屬于細(xì)胞過程的有4個(gè)代謝通路，其中(細(xì)胞)內(nèi)噬作用的Unigenes為265，其他的Unigenes都不足200個(gè)；屬于環(huán)境信息處理的有3個(gè)代謝通路，分別是植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(220)，磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)(77)和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(51)；屬于其他的代謝途徑有5個(gè)，其中植物-病原菌的交互含有297個(gè)Unigenes，其余的Uningenes都不足100個(gè)(表5)。除此以外，在杜鵑花的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中也注釋到了植物內(nèi)源激素代謝的相關(guān)途徑，分別是與乙烯(ethylene，ETH)相關(guān)的半胱氨酸和蛋氨酸代謝(cysteine and methionine metabolism，121)，與生長(zhǎng)素(auxin，IAA)相關(guān)的色氨酸代謝途徑(tryptophan metabolism，62)，與水楊酸(salicylic acid，SA)相關(guān)的苯丙氨酸代謝途徑(phenylalanine metabolism，55)，與茉莉酸類物質(zhì)(jasmonic acid，JAs)相關(guān)的α-亞麻酸的代謝途徑(alpha-linolenic acid metabolism，47)，與脫落酸(abscisic acid，ABA)相關(guān)的類胡蘿卜素生物合成途徑(carotenoid biosynthesis，40)，與赤霉素(Gibberellin，GAs)相關(guān)的二萜類化合物的生物合成途徑(diterpenoid biosynthesis，21)，與細(xì)胞分裂素(cytokinine，CTKs)相關(guān)的玉米素合成途徑(zeatin biosynthesis，19)，以及與新型植物激素油菜素內(nèi)酯(brassinolide，BR)相關(guān)的油菜素內(nèi)酯的生物合成途徑(brassinosteroid biosynthesis，19)(表5)。

X軸上的字母代表不同的功能類別: A，RNA加工與修飾；B，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與動(dòng)力；C，能量生產(chǎn)與轉(zhuǎn)化；D，細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞分裂、染色體分裂；E，氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝；F，核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝；G，糖轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝；H，輔酶轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝；I，脂類轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝；J，翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成；K，轉(zhuǎn)錄；L，復(fù)制、重組和修復(fù)；M，細(xì)胞壁、膜、包體生物合成；N，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性；O，蛋白質(zhì)翻譯后修飾與周轉(zhuǎn)；P，無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝；Q，次生代謝產(chǎn)物的生物合成；R，一般功能預(yù)測(cè)；S，未知功能；T，信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制；U，胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌和囊泡運(yùn)輸；V，防御機(jī)制；W，胞外結(jié)構(gòu)；Y，核酸結(jié)構(gòu)；Z，細(xì)胞骨架。The capital letters in X-axis indicate the KOG categories， and the Y-axis means the number of Unigenes. A， RNA processing and modification；B， Chromatin structure and dynamics；C， Energy production and conversion；D， Cell cycle control， cell division， chromosome partitioning；E， Amino acid transport and metabolism；F. Nucleotide transport and metabolism；G， Carbohydrate transport and metabolism；H， Coenzyme transport and metabolism；I， Lipid transport and metabolism；J， Translation， ribosomal structure and biogenesis；K， Transcription；L， Replication， recombination and repair；M， Cell wall/membrane/envelope biogenesis；N， Cell motility；O， Posttranslational modification， protein turnover， chaperones；P， Inorganic ion transport and metabolism； Q， Secondary metabolites biosynthesis， transport and catabolism；R， General function prediction only；S， Function unknown；T， Signal transduction mechanisms；U， Intracellular trafficking， secretion， and vesicular transport；V， Defense mechanisms；W， Extracellular structures；Y， Nuclear structure；Z， Cytoskeleton.圖3 杜鵑花白鳳4號(hào)Unigenes 在KOG 功能分類Fig.3 Clusters of orthologous group (COG) classification of Unigenes of Rhododendron pulchurum cv.Baifeng 4

表3 杜鵑白鳳4號(hào)GO注釋結(jié)果

表4 杜鵑白鳳4號(hào)轉(zhuǎn)錄組中與逆境脅迫相關(guān)的基因

表5 杜鵑花白鳳4號(hào)轉(zhuǎn)錄組序列的KEGG通路分析

2.3 杜鵑花轉(zhuǎn)錄組轉(zhuǎn)錄因子注釋

杜鵑花轉(zhuǎn)錄組中1 062個(gè)Unigenes被注釋為轉(zhuǎn)錄因子，這些轉(zhuǎn)錄因子分布在55個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族中：富集到20個(gè)以上Unigenes的家族共有18個(gè)，其中富集基因數(shù)量在50個(gè)以上的有bHLH、MYB-related、FAR1、ERF、WRKY、NAC和C2H2家族，富集基因數(shù)量在20～49個(gè)的有MYB、bZIP、Nin-like、C3H、GRAS、HD-ZIP、B3、Trihelix、G2-like、Dof及GATA家族(圖4)；其他37個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族共注釋到Unigenes 239個(gè)，但每個(gè)家族富集的基因最多17個(gè)，最少只有1個(gè)。

2.4 杜鵑花白鳳4號(hào)轉(zhuǎn)錄組SSR分析

利用MISA 軟件分析篩選得到的所有53 568個(gè)Unigenes中的SSR，發(fā)現(xiàn)包含 SSR 的序列數(shù)目為8 738個(gè)條，識(shí)別的SSR總數(shù)為11 108條。其中雙堿基重復(fù)SSR 7 805條，占70.26%；三堿基重復(fù)SSR 2 469條，占22.23%；四堿基重復(fù)SSR 385條，占3.47%；五堿基和六堿基重復(fù)SSR分別有240條(2.16%)和209條(1.88%)(表6)。雙堿基SSR中，發(fā)生頻率最高的是AG，其次是AC和AT。三堿基重復(fù)中共有10個(gè)類別的SSR，其中發(fā)生頻率較高的是AAG，AGG和ACC，發(fā)生頻率最低的是AAT；四堿基重復(fù)中AAAT是發(fā)生頻率最高的，其次是AAAG。

圖4 杜鵑花白鳳4號(hào)轉(zhuǎn)錄組中轉(zhuǎn)錄因子分類Fig.4 Classification of transcription factors of the assembled of Rhododendron pulchurum cv. Baifeng 4

表6 杜鵑花白鳳4號(hào)SSR分析結(jié)果統(tǒng)計(jì)

3 討論

本研究在沒有參考基因組基因組測(cè)序情況下，以杜鵑花白鳳4號(hào)葉片為實(shí)驗(yàn)材料，通過Denovo組裝獲得53 568條Unigenes。把這些基因在Nr庫(kù)中注釋到28 626條Unigenes，且通過與其他物種進(jìn)行同源序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，這些基因與葡萄的同源性最高。通過Blast對(duì)所有Unigenes CDS進(jìn)行預(yù)測(cè)，獲得了28 455個(gè)CDS序列，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。在GO庫(kù)注釋到的17 218個(gè)Unigenes中，我們挖掘到了11 928個(gè)與植物抗逆有關(guān)的Unigenes，分別隸屬于GO注釋分類的環(huán)境應(yīng)激響應(yīng)、蛋白激酶、植物內(nèi)源激素、滲透調(diào)節(jié)、氧化還原、受體、離子轉(zhuǎn)運(yùn)等[10]。

本研究中杜鵑花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)注釋到KEGG的有分布在132個(gè)代謝途徑中的6 475個(gè)Unigenes，其中注釋到應(yīng)激激素ABA[12]等植物激素代謝途徑中的Unigenes有384個(gè)，涉及ABA生物合成和代謝的有40個(gè)，占10.42%。其中，注釋為ABA合成路徑中玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶(zeaxanthin epoxidase，ZEP)[13]和ABA合成限速酶9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid di-oxygenase activity，NCED)[14]的各有3個(gè)Unigenes，注釋為ABA降解關(guān)鍵酶脫落酸8'羥化酶(abscisic acid 8′-hydroxylase，ABA 8′OH)[14]的有9個(gè)Unigenes。同時(shí)，植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)代謝途徑在KEGG中注釋到220個(gè)Unigenes，其中與ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的有38個(gè)，分別是7個(gè)ABA受體PYR/PYLs[15]、8個(gè)蛋白磷酸酶(type 2C proteinphosphatase，PP2C)[16]、9個(gè)SNF1相關(guān)激酶2[17](SNF1-related protein kinase 2，SnRK2)以及14個(gè)ABFs(ABA response element binding factor)轉(zhuǎn)錄因子[18]。植物各生理過程中特定的ABA含量受其合成、代謝及轉(zhuǎn)運(yùn)等精細(xì)調(diào)控，以上這些基因的注釋表明，當(dāng)杜鵑花遭受逆境脅迫時(shí)會(huì)通過調(diào)動(dòng)包括以上基因在內(nèi)的基因表達(dá)來調(diào)控ABA在體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化，從而對(duì)逆境做出響應(yīng)。

轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor，TF)又稱反式作用因子，在植物應(yīng)對(duì)外界環(huán)境變化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或者基因轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控過程中起著重要的作用，并且往往是以基因家族的形式出現(xiàn)[19]。本研究中注釋到的轉(zhuǎn)錄因子家族有bHLH、MYB-related、ERF和WRKY等，其中WRKY家族基因是近幾年研究比較熱的與植物脅迫應(yīng)答相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子由WRKY蛋白N端高度保守的WRKYGQK氨基酸序列及其C端特殊的鋅指結(jié)構(gòu)而命名，在植物體內(nèi)當(dāng)受外界因子誘導(dǎo)后特異性識(shí)別W-box([(T) (T) TGAC(C/T)]序列)而調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)，從而在多種生物和非生物脅迫及諸如水楊酸[20]、赤霉素[21]等植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用，目前，也有越來越多的證據(jù)表明WRKYs是ABA應(yīng)答信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)[22]。本研究中注釋到52個(gè)WRKYs，其中4個(gè)WRKY4轉(zhuǎn)錄因子值得關(guān)注。Ren等[23]研究發(fā)現(xiàn)煙草WRKY4在葉片生長(zhǎng)和生物脅迫方面都具有重要作用，這在WRKYs轉(zhuǎn)錄因子中是比較少見的；Zheng等[24]研究發(fā)現(xiàn)，剛毛檉柳中WRKY4能被ABA、鹽和干旱誘導(dǎo)，同時(shí)被ABF和DOF(DNA binding with one finger)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，同時(shí)WRKY4也能與其他WRKYs交叉調(diào)控，過表達(dá)WRKY4擬南芥植株能提高其抗鹽、抗氧化和抗ABA誘導(dǎo)的能力；徐麗等[25]從核桃中克隆了WRKY4基因，還發(fā)現(xiàn)其受低溫的誘導(dǎo)。由此可見，WRKY4轉(zhuǎn)錄因子在植物體內(nèi)的作用比較復(fù)雜，會(huì)參與杜鵑花所的逆境響應(yīng)，值得深入研究。

簡(jiǎn)單序列重復(fù)SSR(simple sequence repeats)標(biāo)記是目前最理想的分子標(biāo)記，廣泛用于遺傳多樣性和進(jìn)化論研究[26]。但引物開發(fā)要建立在已知的DNA序列上，由于之前杜鵑植物DNA序列信息相對(duì)缺乏，使得杜鵑SSR標(biāo)記引物的開發(fā)相對(duì)較少，本研究在杜鵑花轉(zhuǎn)錄組測(cè)定的基礎(chǔ)上篩選了8 738 SSRs序列，有望會(huì)同前人開發(fā)的SSR標(biāo)記[27-30]為杜鵑種質(zhì)資源的有效分類與鑒定研究奠定基礎(chǔ)。