侯艷華，張 凱，王 磊，孫 靜，王旭榮，張 康，王學(xué)智，李建喜，張景艷

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅省中獸藥工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730050)

樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)是目前所知的功能最強(qiáng)的專職抗原提呈細(xì)胞，能夠高效地?cái)z取、加工處理和提呈抗原，在通過天然免疫與獲得性免疫調(diào)節(jié)而維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)方面起著重要作用。未成熟的DC具有較強(qiáng)的遷移能力，可以作為檢測器監(jiān)測感染；成熟的DC可以刺激幼稚T細(xì)胞和B細(xì)胞的分化[1]。自加拿大學(xué)者Steinman和Cohn于1973年發(fā)現(xiàn)樹突狀細(xì)胞以來，它的生物學(xué)活性作用一直是人們研究的熱點(diǎn)[2]。目前研究中用到的DC主要靠自主分離培養(yǎng)為主，故穩(wěn)定的分離培養(yǎng)方法顯得尤其重要。CD103+DC是髓樣樹突狀細(xì)胞(myeloid dendritic cells，MDCs)的一員[3]，能夠表達(dá)整合素分子αEβ7的α鏈CD103蛋白，廣泛分布于淋巴組織(脾臟、淋巴結(jié))和非淋巴組織(腸道、肺、肝臟、腎臟、皮膚等)中，影響調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory cells，Tregs)和效應(yīng)T細(xì)胞的平衡，從而調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答[4-6]。Tregs是T淋巴細(xì)胞的一個(gè)特殊亞群，其主要功能是抑制免疫應(yīng)答，包括免疫耐受、抑制自身免疫病、腫瘤抑制等。研究發(fā)現(xiàn)，腸道CD103+DC可以在視黃酸(RA)和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)的作用下誘導(dǎo)CD4+Foxp3+Treg的產(chǎn)生，同時(shí)還可以指導(dǎo)T細(xì)胞表面歸巢分子CCR9和α4β7的表達(dá)，從而啟動免疫耐受[7-9]；體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，加入TGF-β后，CD103+DCs誘導(dǎo)的Foxp3+Tregs 水平顯著增高，加入抗TGF-β單克隆抗體，則CD103+DCs誘導(dǎo)的Foxp3+Tregs水平顯著降低[10-11]。當(dāng)機(jī)體處于病理狀態(tài)時(shí)，CD103+DC能夠伸長樹突，捕獲抗原并將抗原遞呈給T細(xì)胞，從而活化T細(xì)胞。腸上皮會發(fā)生炎性浸潤，腸腔捕獲抗原，攜帶抗原的CD103+DC在CCR7介導(dǎo)下進(jìn)入腸系膜淋巴結(jié)，在TLR配體的刺激下CD103+DC能分泌IL-6，進(jìn)而誘導(dǎo)Th17的分化，參與固有免疫反應(yīng)和某些炎性反應(yīng)[12-14]；King等[15]將皮膚淋巴結(jié)CD103+DCs與初始T細(xì)胞共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，CD103+DCs能誘導(dǎo)Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化；另外還有一些研究表明，CD103+DC是誘導(dǎo)Th0細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化的關(guān)鍵物質(zhì)[16]。由此可見，CD103+DC在維持機(jī)體免疫與免疫耐受平衡中起著重要作用，建立一種穩(wěn)定的CD103+DC體外培養(yǎng)方法，對研究CD103+DC起源、生物學(xué)特征、治療應(yīng)用具有重要意義。本研究旨在建立小鼠骨髓源CD103+DC的培養(yǎng)和鑒定方法，并闡述LPS對其形態(tài)與功能特征的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級4～8周齡的C57BL/6雌性小鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司[SCXX(京)2016-0011]。

1.2 主要試劑

Recombinant Mouse GM-CSF購自R&D Systems公司；Mouse FLT3L Recom-binant Protein Carrier-Free、Anti-Mouse CD103-PE、Anti-Mouse MHC-Ⅱ-FITC、Anti-Mouse CD83-FITC購自eBioscience公司；RPMI-1640、胎牛血清(FBS)、磷酸鹽緩沖液(DPBS)購自Gibco公司；紅細(xì)胞裂解液、MTT試劑盒、4%多聚甲醛、25%戊二醛、熒光淬滅劑均購自索萊寶公司；青-鏈霉素(雙抗)、VOA-FITC、LPS、多聚L賴氨酸包被的蓋玻片購自Sigma公司；Anti-Mouse CD103免疫磁珠購自MiltenyiBiotec公司；尼龍毛柱購自Polysciences公司；Anti-Mouse CD103、Antibody To Rabbit IgG(H+L)購自KPL公司；細(xì)胞培養(yǎng)板和細(xì)胞篩購自Corning公司。

1.3 主要儀器及設(shè)備

低溫冰箱(MDF-382，SYNYO，日本)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(1209，Thermo Scientific，美國)；倒置顯微鏡(22EB，LEICA，德國)；酶標(biāo)儀(SpectraMax?M2e，Molecular，美國)；生物安全柜(HF Safe-1500，力康生物醫(yī)療科技有限公司，中國)；離心機(jī)(3K15，Sigma，德國)；免疫熒光顯微鏡(IX71，OLYMPUS，日本)；掃描電鏡(JEOL，JSM-6510，日本)；流式細(xì)胞儀(CYTOMICS FC 500，Beckman，美國)。

1.4 完全培養(yǎng)基配制

取100 μL 200 μg·mL-1的FLT3L、100 μL 10 μg·mL-1的GM-CSF、5 mL的FBS和1 mL雙抗溶于94 mL的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，使FLT3L和GM-CSF的工作濃度分別為200和10 ng·mL-1。

1.5 小鼠骨髓源細(xì)胞的培養(yǎng)

取6～8周齡的C57BL/6小鼠，脫頸處死，置于75%乙醇中浸泡30 min；用DPBS沖洗小鼠的脛骨、腓骨腔以獲得骨髓源細(xì)胞，300g離心5 min，棄上清；以比例為1∶3的DPBS和紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞，靜置2 min，300g離心5 min，棄上清；再加入DPBS重懸細(xì)胞，用細(xì)胞篩過濾，濾液300g離心5 min，棄上清；加入完全培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，使細(xì)胞濃度約為1.5×107mL-1，將其移至6孔細(xì)胞板中培養(yǎng)；分別在培養(yǎng)第3天和第5天時(shí)，每孔加2 mL的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；于第9天收集細(xì)胞，300g離心5 min，加入完全培養(yǎng)基重懸，繼續(xù)培養(yǎng)至第15天，收獲細(xì)胞。

1.6 CD103+DC的鑒定

1.6.1 掃描電鏡觀察CD103+DC形態(tài)

培養(yǎng)至第15天的骨髓源細(xì)胞，加LPS(工作濃度100 ng·mL-1)處理24 h，收集細(xì)胞至15 mL離心管，300g離心 5 min；將細(xì)胞用完全培養(yǎng)基重懸，轉(zhuǎn)入放置多聚賴氨酸包被無菌蓋玻片的48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后可見部分細(xì)胞貼壁，棄去細(xì)胞懸液；用DPBS清洗3次，每次5 min；2.5%的戊二醛4 ℃固定1 h；棄去戊二醛，DPBS清洗3次；依次用30%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%、100%的乙醇逐級脫水，自然干燥；取出蓋玻片，噴晶觀察。

1.6.2 CD103+DC的熒光顯微鏡觀察

培養(yǎng)至第15天的骨髓源細(xì)胞，加LPS(工作濃度為100 ng·mL-1)處理24 h；收集細(xì)胞至15 mL離心管，300g離心 5 min，將細(xì)胞用完全培養(yǎng)基重懸，轉(zhuǎn)入放置多聚賴氨酸包被無菌蓋玻片的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后可見部分細(xì)胞貼壁，棄去細(xì)胞懸液；用DPBS清洗3次，每次5 min；4%多聚甲醛室溫下固定20 min，DPBS清洗3次；0.2% Triton-100通透15 min，DPBS清洗3次；5%BSA于4 ℃下包被30 min，DPBS清洗3次；按1∶100比例加入一抗(Anti-Mouse CD103)，37 ℃溫箱孵育2 h，DPBS清洗3次；按1∶100比例加入二抗(Antibody To Rabbit IgG(H+L))，37 ℃溫箱避光孵育1 h，DPBS清洗3次；加入10 μL DAPI，室溫下孵育10 min，DPBS清洗3次；取出蓋玻片，用熒光淬滅劑封片；熒光顯微鏡觀察。

1.6.3 CD103+DC流式細(xì)胞術(shù)鑒定

收集培養(yǎng)至16 d的骨髓源細(xì)胞，300g離心5 min，棄上清，經(jīng)過Anti-CD103磁珠分選得到純化的CD103+DC，具體方法參照美天旎Anti-CD103免疫磁珠陽性分選試劑盒說明書。

收集純化的骨髓源細(xì)胞，用DPBS將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×106mL-1；分別取1 mL細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入1.5 mL的EP管中，分別加入5 μL的Anti-Mouse CD103-PE與其同型對照倉鼠IgG-PE，37 ℃避光孵育30 min；300g離心5 min，棄上清，DPBS清洗2次；分別加入500 μL DPBS重懸細(xì)胞，過膜并轉(zhuǎn)移至專用檢測管，流式細(xì)胞儀檢測。

首先，能推進(jìn)財(cái)務(wù)人員加強(qiáng)崗位工作再認(rèn)識，做到依法理財(cái)；可以促進(jìn)財(cái)務(wù)人員深入思考本職崗位工作職責(zé)，自覺提高依法理財(cái)意識；促進(jìn)財(cái)務(wù)人員自覺地調(diào)節(jié)自己的行為，形成正確的財(cái)務(wù)道德觀，確保國有資產(chǎn)安全，防范經(jīng)營風(fēng)險(xiǎn)。

1.7 CD103+DC細(xì)胞功能鑒定

1.7.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的吞噬功能

培養(yǎng)至第15天的骨髓源細(xì)胞，設(shè)LPS和RPMI-1640組，前者LPS(工作濃度為100 ng·mL-1)處理24 h。分別收集細(xì)胞至15 mL離心管，300g離心 5 min，棄上清，DPBS清洗2次，再用DPBS將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×106mL-1；分別取1 mL細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入1.5 mL的EP管中，各加入10 μL的VOA-FITC，37 ℃避光孵育4 h為實(shí)驗(yàn)組，4 ℃避光孵育4 h為同型對照組；300g離心5 min，棄上清，DPBS清洗2次；加入500 μL DPBS重懸細(xì)胞，過膜并轉(zhuǎn)移至專用檢測管中，流式細(xì)胞儀檢測。

1.7.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的抗原提呈功能相關(guān)分子

培養(yǎng)至第15天的骨髓源細(xì)胞，設(shè)LPS和RPMI-1640組，前者LPS(工作濃度為100 ng·mL-1)處理24 h。分別收集細(xì)胞至15 mL離心管，300g離心 5 min，棄上清，DPBS清洗2次；用DPBS將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×106mL-1；分別取1 mL細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入不同的1.5 mL EP管中，分別加入小鼠MHC-Ⅱ-PE單抗、小鼠CD83-FITC及對應(yīng)的同型對照；37 ℃避光孵育30 min，300g離心5 min，棄上清，DPBS清洗2次；然后加入500 μL DPBS重懸細(xì)胞，過膜并轉(zhuǎn)移至專用檢測管中，流式細(xì)胞儀檢測。

1.7.3 混合T淋巴細(xì)胞體外增殖檢測

采用MTT法。取6～8周齡的C57BL/6小鼠，脫頸處死，75%乙醇浸泡30 min，無菌條件下分離脾臟，制備組織勻漿，300g離心5 min，棄上清；加入3倍體積的紅細(xì)胞裂解液作用2 min，300g離心 5 min，棄上清；加入DPBS懸浮細(xì)胞，用細(xì)胞篩過濾，濾液300g離心 5 min，棄上清；加PMI-1640完全培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，注入尼龍毛柱，置于CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)1 h，得純化T淋巴細(xì)胞；調(diào)整T淋巴細(xì)胞濃度為1×106mL-1，然后取100 μL加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。共分為6組，每組設(shè)5個(gè)重復(fù)。

培養(yǎng)至第15天的骨髓源細(xì)胞，加LPS(工作濃度100 ng·mL-1)處理24 h；收集細(xì)胞至15 mL離心管，300g離心 5 min，棄上清；加PMI-1640完全培養(yǎng)基，調(diào)整CD103+DC細(xì)胞濃度至1 ×106mL-1；分別以100∶0、100∶1、50∶1、25∶1、12.5∶1、6.25∶1的比例混合T淋巴細(xì)胞和CD103+DC細(xì)胞，其中100∶0為空白對照；用PMI-1640完全培養(yǎng)基補(bǔ)充每孔體積至200 μL，置于CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)4 d；取出后每孔加入20 μL的MTT(濃度為5 mg·mL-1)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；每孔再加入150 μL的DMSO，振蕩10 min；酶標(biāo)儀上570 nm處檢測D值，計(jì)算細(xì)胞刺激指數(shù)(SI)。細(xì)胞刺激指數(shù)(SI)=實(shí)驗(yàn)孔D值/對照孔D值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 骨髓源樹突狀細(xì)胞形態(tài)變化

將分離得到的骨髓單個(gè)核細(xì)胞，用細(xì)胞因子GM-CSF和FLT3L聯(lián)合處理，CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)第1天，細(xì)胞呈圓形，表面光滑，有少量細(xì)胞聚集(圖1-A)；培養(yǎng)至第3天，細(xì)胞集落開始形成(圖1-B)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞集落增多、增大，細(xì)胞形態(tài)有明顯變化，呈圓形、橢圓形或不規(guī)則性形，細(xì)胞表面開始出現(xiàn)樹突，樹突隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而增多、增長；培養(yǎng)至第13天，集落最多、最大(圖1-D)，第14天后細(xì)胞開始懸浮，呈單個(gè)生長，且細(xì)胞樹突增多(圖1-E)。圖1-F為培養(yǎng)至第15天時(shí)，用100 ng·mL-1的LPS處理24 h的細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞體積變大，細(xì)胞樹突變多、變長。掃描電鏡下細(xì)胞輪廓清晰，形態(tài)大小不一，表面粗糙不平，結(jié)構(gòu)保持完整，有明顯樹突狀結(jié)構(gòu)，微絨毛和突起清晰可見，RPMI-1640組BMCs樹突較少、較短；LPS處理24 h后，細(xì)胞樹突明顯變多、變長(圖2)。

2.2 CD103+DC表面特征分子CD103表達(dá)情況

LPS處理的骨髓源細(xì)胞，經(jīng)CD103單抗(FITC標(biāo)記的兔IgG)和二抗DAPI染色處理后，熒光顯微鏡下細(xì)胞膜呈綠色(圖3-D)、細(xì)胞核呈藍(lán)色(圖3-E)，細(xì)胞膜位置與細(xì)胞核染色位置基本重合(圖3-F)，部分細(xì)胞有集落現(xiàn)象，有明顯的樹突狀結(jié)構(gòu)。RPMI-1640組的骨髓源細(xì)胞膜和細(xì)胞核在熒光顯微鏡下，呈現(xiàn)與LPS處理組相同的顏色變化，但細(xì)胞多呈散在性分布，樹突狀結(jié)構(gòu)不明顯(圖3-A、B、C)。

分別用流式細(xì)胞術(shù)分析了未經(jīng)CD103免疫磁珠純化和經(jīng)CD103免疫磁珠純化的骨髓源細(xì)胞表面分子，結(jié)果如圖4所示。未經(jīng)免疫磁珠純化的CD103+DC比率為(90.27±2.03)%，而經(jīng)免疫磁珠純化的CD103+DC比率為(93.35±1.74)%，二者間無明顯差異(P>0.05)。該結(jié)果提示，本實(shí)驗(yàn)條件下可以從C57BL/6小鼠的骨髓細(xì)胞中誘導(dǎo)獲得陽性率較高的CD103+DC。

A， 第1天；B， 第3天；C， 第9天；D， 第13天；E， 第16天；F， LPS刺激24 h。1、2和3為細(xì)胞集落；4、5為DC. 400×。A， 1st day；B， 3rd day；C， 9th day；D， 11th day；E， 13th day；F， The cell treated by LPS for 24 h; 1， 2 and 3 are cell colonies; 4 and 5 are DCs. The magnification is 400 times.圖1 培養(yǎng)過程中BMCs的形態(tài)變化Fig.1 The morphological change of BMCs

A， RPMI-1640組；B， LPS組。2 500×。A， The group of RPMI-1640；B， BMCs treated by LPS. The magnification is 2 500 times.圖2 掃描電鏡下BMCs形態(tài)Fig.2 BMCs shape under the scanning electronmicroscope

2.3 CD103+DC吞噬能力與抗原提呈相關(guān)分子表達(dá)的評價(jià)

2.3.1 LPS對CD103+DC細(xì)胞吞噬能力的影響

采用流式細(xì)胞術(shù)對不同處理組CD103+DC吞噬能力進(jìn)行了分析。結(jié)果如圖5和表1所示，RPMI-1640組中VOA+的細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例為25.70%，而經(jīng)LPS處理組中VOA+的細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例僅為10.33%，差異極顯著(P<0.01)。由此可以看出，實(shí)驗(yàn)中得到的小鼠骨髓源CD103+DC具有一定的抗原吞噬功能；同時(shí)100 ng·mL-1LPS處理24 h后，VOA+CD103+DC的數(shù)量明顯降低，表明該細(xì)胞經(jīng)LPS誘導(dǎo)后抗原吞噬能力下降趨勢。

A，RPMI-1640組，細(xì)胞膜CD103-FITC熒光標(biāo)記；B，RPMI-1640組，BMCs細(xì)胞核DAPI染色；C，A圖和B圖的合并圖；D，LPS處理組，BMCs細(xì)胞膜CD103-FITC熒光標(biāo)記；E，LPS處理組，BMCs細(xì)胞核DAPI染色；F，D圖和E圖的合并圖。200×。A， BMCs membrane labeled with CD103-FITC in the group of RPMI-1640；B， BMCs nucleus labeled with DAPI in the group of RPMI-1640；C， Merged figure of A and B；D， MBCs membrane labeled with green fluorescence in the group of LPS；E， BMCs nucleus labeled with DAPI in the group of LPS；F， Merged figure of D and E. Magnification， 200×.圖3 BMCs表面分子CD103免疫熒光鑒定Fig.3 Immunofluorescence assay of the surface molecules CD103 on BMCs

A，同型對照；B，未經(jīng)免疫磁珠純化的CD103+DC陽性率為90.27%； C，經(jīng)免疫磁珠純化的CD103+DC陽性率為93.35%。A， Isotype control; B， Positive ratio of CD103+DC untreated with immunomagnetic beads was 90.27%; C， Positive ratio of CD103+DC treated with immunomagnetic beads was 93.35%.圖4 BMCs表面分子CD103流式細(xì)胞術(shù)鑒定Fig.4 FACS assay of the surface molecules CD103 on BMCs

A，同型對照； B，RPMI-1640組 CD103+DC的吞噬率為25.79%； C，LPS處理組CD103+DC的吞噬率為10.33%。A， Isotype control; B， The phagocytosis rate of CD103+DC in the group of RPMI-1640 is 25.79%； C， The phagocytosis rate of CD103+DC was 10.33% in the group of LPS.圖5 CD103+DC的細(xì)胞吞噬能力流式細(xì)胞術(shù)檢測Fig.5 FAC assay of the phagocytosis of CD103+DC

2.3.2 LPS對CD103+DC表面功能分子表達(dá)的影響

采用流式細(xì)胞術(shù)對不同處理組CD103+DC的抗原提呈相關(guān)分子MHC-Ⅱ、CD83的表達(dá)進(jìn)行了分析。結(jié)果如圖6和表1所示，RPMI-1640組MHC-Ⅱ+CD103+DC、CD83+CD103+DC的細(xì)胞比例分別為41.31%、13.79%；而經(jīng)LPS處理組中MHC-Ⅱ+CD103+DC、CD83+CD103+DC的細(xì)胞比例分別為68.10%、24.71%，即LPS處理后CD103+DC的MHC-Ⅱ、CD83表達(dá)率顯著增高(P<0.01)。由此可以看出，實(shí)驗(yàn)中得到的小鼠骨髓源CD103+DC表面有MHC-Ⅱ、CD83表達(dá)；同時(shí)100 ng·mL-1LPS處理24 h后，MHC-Ⅱ+CD103+DC、CD83+CD103+DC的數(shù)量明顯增加，表明一定量LPS可以促進(jìn)小鼠CD103+DC表面分子MHC-Ⅱ、CD83的表達(dá)。

2.4 CD103+DC刺激T細(xì)胞增殖的能力

成熟的CD103+DC能夠刺激T細(xì)胞活化、增殖，一般用刺激指數(shù)計(jì)算。本實(shí)驗(yàn)將經(jīng)LPS組和RPMI-1640組CD103+DC分別按1∶100、1∶50、1∶25、1∶12.5、1∶6.25的比例與T細(xì)胞混合培養(yǎng)4 d后，刺激指數(shù)如表2所示。當(dāng)CD103+DC與T細(xì)胞比例為1∶100時(shí)，LPS組和RPMI-1640組刺激指數(shù)差異不顯著(P>0.05)；當(dāng)CD103+DC與T細(xì)胞比例為1∶50時(shí)，LPS組和RPMI-1640組刺激指數(shù)差異顯著(P<0.01)；而當(dāng)CD103+DC與T*表示LPS組與RPMI-1640組相比差異顯著(P<0.05)；** 表示LPS組與RPMI-1640組相比差異極顯著(P<0.01)。下同。

A，IgG-PE；B，RPMI-1640組， 41.31%的CD103+DC表達(dá)MHC-Ⅱ；C，LPS組，68.10%的CD103+DC表達(dá)MHC-Ⅱ；D，CD83-FITC同型對照；E，RPMI-1640組，13.79%的CD103+DC表達(dá)CD83；F，LPS組，24.71%的CD103+DC表達(dá)CD83。A， IgG-PE；B， 41.31% CD103+DC expressed MHC-II in the group of RPMI-1640; C， 68.10% CD103+DC expressed MHC-II in the group of LPS; D， IgG-FITC; E， 13.79% CD103+DC expressed CD83 in the group of RPMI-1640；F， 24.71% CD103+DC expressed CD83 in the group of LPS.圖6 CD103+DC的抗原提呈相關(guān)分子流式細(xì)胞術(shù)檢測Fig.6 FAC assay of the molecules related antigen presentation of CD103+DC

* indicates the significant difference between LPS group and RPMI-1640 group (P<0.05)； ** indicates the extremely significant difference between LPS group and RPMI-1640 group (P<0.01). The same as below.

細(xì)胞比例為1∶25、1∶12.5、1∶6.25時(shí)，LPS組和RPMI-1640組刺激指數(shù)差異均極顯著(P<0.01)。

結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)條件下分離獲得的CD103+DC具有刺激T細(xì)胞增殖的能力，LPS處理有增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞刺激T細(xì)胞增殖的作用。

3 討論

樹突狀細(xì)胞是目前已知的功能最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞，其在體內(nèi)廣泛分布，尤其是與外界接觸的組織，如皮下、黏膜組織。DC具有長長的樹突，能夠捕獲抗原并將其遞呈給T細(xì)胞，啟動免疫應(yīng)答。DC具有多種亞群，可根據(jù)其對轉(zhuǎn)錄因子的依賴性、表型、定位和功能等的差異進(jìn)行區(qū)分[17]。其中，CD103+DC被認(rèn)為是一種與黏膜免疫密切相關(guān)的樹突狀細(xì)胞，它可以通過促進(jìn)炎性通路的發(fā)生和維持免疫耐受來調(diào)節(jié)腸道免疫反應(yīng)。CD103+DC和其他樹突狀細(xì)胞一樣，可以由骨髓源前體細(xì)胞中分化而來，這為體外分離和培養(yǎng)CD103+DC提供了一種可能。研究表明，用粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)處理骨髓源單核細(xì)胞，可誘導(dǎo)獲得單核源樹突狀細(xì)胞(moDC)；用FMS樣絲氨酸激酶3配體(FIT3L)處理骨髓源常規(guī)樣樹突狀前體細(xì)胞(pre-cDC)，可以獲得漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(pDC)、CD11b+cDC和CD24+cDC；如果用GM-CSF和FIT3L共同處理骨髓源pre-cDC，可以獲得CD103+cDC[18-19]。雖然有從骨髓中誘導(dǎo)分化和培養(yǎng)CD103+DC的成功案例，但要在體外獲得數(shù)量足夠多的高純度CD103+DC，難度較大。

本實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[20-22]，以C57BL/6雌性小鼠的脛骨和腓骨骨髓為分離源，獲得了骨髓細(xì)胞；用含有10%FBS、10 ng·mL-1GM-CSF和200 ng·mL-1FLT3L的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)分離的骨髓細(xì)胞。培養(yǎng)到第3天，顯微鏡下可觀察到零星的小集落開始形成；在第3天和第5天分別補(bǔ)充1/2體積的完全培養(yǎng)基并繼續(xù)培養(yǎng)，至第9天可觀察到較大的細(xì)胞集落，此時(shí)離心收集懸浮細(xì)胞用完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至第15天，可觀察到分散生長、輪廓清晰、有樹突樣結(jié)構(gòu)的單個(gè)懸浮細(xì)胞；在第15天加入LPS(工作濃度100 ng·mL-1)作用24 h后，具有樹突狀結(jié)構(gòu)的細(xì)胞數(shù)量增多，且細(xì)胞的樹突明顯增多、變長(圖1、2)。表明C57BL/6雌性小鼠的脛骨和腓骨骨髓中可分離培養(yǎng)出樹突狀細(xì)胞，培養(yǎng)至第3天和5天時(shí)分別補(bǔ)充一次培養(yǎng)基更有利于樹突狀細(xì)胞的生長，第15天用一定量的LPS處理24 h，可獲得樹突結(jié)構(gòu)更明顯的細(xì)胞。

CD103+DC表面表達(dá)的CD103分子是鑒定該類細(xì)胞的標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)利用FITC標(biāo)記的兔抗鼠CD103單抗和DAPI對小鼠骨髓源樹突狀細(xì)胞進(jìn)行雙染處理，結(jié)果可見細(xì)胞膜在熒光顯微鏡下呈綠色、細(xì)胞核呈藍(lán)色，表明分離于C57BL/6雌性小鼠的脛骨和腓骨骨髓的樹突狀細(xì)胞中具有CD103+DC，LPS具有誘導(dǎo)該類細(xì)胞數(shù)量增加的可能(圖3)。免疫磁珠法是分選陽性細(xì)胞常用的技術(shù)之一[23]，本實(shí)驗(yàn)用該方法對經(jīng)LPS誘導(dǎo)處理的CD103+DC進(jìn)行了純化，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，免疫磁珠純化前后的樹突狀細(xì)胞中CD103+DC陽性率均達(dá)90%以上(圖4)，說明本實(shí)驗(yàn)條件下可分離培養(yǎng)出陽性率較高的CD103+DC，免疫磁珠分選步驟可以省略。

吞噬功能是樹突狀細(xì)胞抗原提呈生理機(jī)能得以啟動的重要機(jī)制之一，未成熟的樹突狀細(xì)胞抗原吞噬作用強(qiáng)，抗原提呈功能弱；一旦樹突狀細(xì)胞成熟后，其吞噬作用減弱，抗原提呈作用增強(qiáng)，并高表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體(MHC)Ⅱ類分子、共刺激分子CD80與CD86、細(xì)胞間黏附分子CD40和ICAM-1(CD54)等[24-26]。研究發(fā)現(xiàn)，CD83是表達(dá)成熟樹突狀細(xì)胞和活化T、B淋巴細(xì)胞的重要功能分子[27-28]。本研究中，經(jīng)LPS處理后CD103+DC抗原吞噬能力減弱，說明LPS刺激有利于CD103+DC的成熟；經(jīng)LPS處理后CD103+DC的MHCⅡ和CD83的表達(dá)量明顯增加，說明LPS刺激有利于增強(qiáng)CD103+DC抗原提呈能力。成熟的CD103+DC主要是通過其刺激T細(xì)胞活化和增殖的途徑而實(shí)現(xiàn)其重要的免疫學(xué)功能[29-30]。本實(shí)驗(yàn)將LPS處理和未處理的CD103+DC，分別按不同比例與小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)4 d，MTT法檢測結(jié)果顯示，LPS處理后CD103+DC刺激T細(xì)胞增殖的能力有顯著提升(表2)。這說明用GM-CSF、FLT3L聯(lián)合處理獲得的小鼠骨髓源CD103+DC，再用LPS刺激后可促進(jìn)CD103+DC的成熟。