魯花 于露 甄歡歡 劉汝銀 岳宗進(jìn)

河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院(河南省中醫(yī)院)，河南 鄭州 450002

腰椎間盤突出是腰腿痛最常見的原因之一，椎間盤退行性病變是基本致病因素，髓核細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的細(xì)胞數(shù)量減少是椎間盤退變的主要形態(tài)學(xué)改變之一[1]，但目前引起其凋亡的機(jī)制尚未完全明確。JAK2/STAT3信號(hào)通路存在于大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)，其對(duì)細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡有著至關(guān)重要的作用[2, 3]，可被炎性應(yīng)激激活，主要功能為介導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)中的細(xì)胞凋亡[4]。而退變椎間盤組織可以分泌眾多炎性因子，如白介素(IL-1β 和IL-6)、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、一氧化氮和前列腺素E2等[5]。

紅景天苷(salidroside)是我國傳統(tǒng)中藥紅景天最重要的有效成分之一，具有多種藥理活性，有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、肝保護(hù)、神經(jīng)保護(hù)等作用[6, 7]。但是關(guān)于紅景天苷在腰椎間盤突出方面的研究卻鮮有報(bào)道。本研究通過氧糖剝奪培養(yǎng)正常人髓核細(xì)胞構(gòu)建退變髓核細(xì)胞模型，觀察紅景天苷對(duì)退變髓核細(xì)胞的影響并探討其可能的機(jī)制，為治療椎間盤髓核細(xì)胞退變引起的腰椎間盤突出提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

人髓核細(xì)胞(human nucleus pulposus cells, HNPCs) 購自上海中喬新舟生物科技有限公司，進(jìn)口于美國ScienCell研究實(shí)驗(yàn)室；紅景天苷(純度>98%)購自南京朗朗科技銷售有限公司，10 mg 紅景天苷溶于1 mL 無菌PBS 配制紅景天苷工作液，即紅景天苷工作液濃度為10μg/μL；JAK2/STAT3 特異性抑制劑(AG490) 購自北京啟維益成科技有限公司；DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液購自美國HyClone 公司；胎牛血清和胰蛋白酶購自美國Gibco公司；β-actin、p-JAK2 和p-STAT3抗體及對(duì)應(yīng)熒光二抗購自美國Invitrogen 公司；流式細(xì)胞術(shù)凋亡檢測試劑盒購自美國BD Biosciences 公司；TNF-α、IL-1β 和IL-6 ELISA 試劑盒購自上海巧伊生物科技有限公司；總RNA 抽提試劑盒、M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶和SYBR Premix Ex Taq Ⅱ購自大連寶生物工程有限公司；引物合成由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.2 HNPCs細(xì)胞退變模型和分組

HNPCs 細(xì)胞復(fù)蘇后，用10% 胎牛血清(FBS)的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液(pH7.2)，置于37 ℃含有5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 根據(jù)細(xì)胞生長情況，2～3 天換液1次，待生長到80%～90% 融合時(shí)用胰蛋白酶消化傳代。將生長良好的髓核細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，接種于25 mL培養(yǎng)瓶中(5 mL/瓶)，分為正常培養(yǎng)組和氧糖剝奪(oxygen glucose deprivation，OGD) 培養(yǎng)組。OGD組細(xì)胞換無血清DMEM培養(yǎng)液，在1% O2/94% N2/5% CO2氣體組分中培養(yǎng)，模擬體內(nèi)椎間盤退變微環(huán)境。12 h后收集細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)分為2部分：第一部分： Control 組：正常培養(yǎng)HNPCs，1 mL 培養(yǎng)液中加入5 μL 不含紅景天苷的無菌PBS；OGD 組：氧糖剝奪培養(yǎng)HNPCs，1 mL 培養(yǎng)液中加入5 μL 不含紅景天苷的無菌PBS；低濃度(10μg/mL)紅景天苷組：氧糖剝奪培養(yǎng)HNPCs，1 mL 培養(yǎng)液中加入1 μL 紅景天苷工作液；中濃度(30μg/mL)紅景天苷組：氧糖剝奪培養(yǎng)HNPCs，1 mL 培養(yǎng)液中加入3 μL 紅景天苷工作液；高濃度(50μg/mL)紅景天苷組：氧糖剝奪培養(yǎng)HNPCs，1 mL 培養(yǎng)液中加入5 μL 紅景天苷工作液。第二部分：Control 組；OGD 組；紅景天苷組：采中濃度(30μg/mL)紅景天苷作用于退變HNPCs；AG490 組：30 μmol /L AG490作用于退變HNPCs。紅景天苷+ AG490 組：30μg/mL紅景天苷+30 μmol /L AG490 共同作用于退變HNPCs。

1.3 Real-Time PCR (RT-PCR)

采用總RNA 抽提試劑盒提取各組細(xì)胞的總RNA，隨后用M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。實(shí)時(shí)定量液12 μL，cDNA 模板2 μL，上下游引物各1 μL，滅菌蒸餾水4 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)熱10 min；40 個(gè)循環(huán) (95 ℃ 30 s；60 ℃ 35 s；72 ℃ 50 s); 72 ℃ 延伸10 min。采用2-ΔΔCt進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。 RT-PCR引物序列如下表：

表1 RT-PCR引物序列Table 1 The primer sequences of RT-PCR

1.4 Western blot

以 β-actin 作為內(nèi)參蛋白，測定Aggrecan 和 Col2a1 的表達(dá)，以JAK2/STAT3為內(nèi)參，測定JAK2、STAT3活化形式p-JAK2、p-STAT3的表達(dá)。RIPA裂解法處理細(xì)胞提取蛋白，考馬斯亮藍(lán)法測定總蛋白濃度。樣品經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。然后加入封閉液室溫下?lián)u床上孵育60 min，一抗分別采用1∶200稀釋的小鼠抗人Aggrecan抗體、1∶500稀釋的小鼠抗人Col2a1抗體、1∶1 000稀釋的小鼠抗人p-JAK2 和p-STAT3的單克隆抗體，再分別用1∶1 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG室溫?cái)[搖床上孵育60 min，ECL法顯影，膠片拍照，計(jì)算蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 ELISA

收集細(xì)胞培養(yǎng)液，離心后收取上清液，按1∶100 稀釋后加入酶標(biāo)反應(yīng)孔中，在37 ℃條件下孵育1 h，隨后用洗滌液洗滌3 遍，每次3 min。每孔加入100 μL 酶標(biāo)抗體，再次在37 ℃條件下孵育1 h，每孔加入100 μLTMB-過氧化氫尿素溶液， 37 ℃下避光放置5 min，加入50 μL 終止液終止反應(yīng)，測定各孔在波長450 nm 處的光密值[OD(450) ]，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算為濃度。

1.6 流式細(xì)胞凋亡法檢測髓核細(xì)胞凋亡

各組細(xì)胞經(jīng)過處理達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求后，用不含EDTA的胰蛋白酶消化后，經(jīng)2 000 r /min，離心5 min。用PBS 重懸洗滌2 次，加入500 μL 緩沖液懸浮細(xì)胞。隨后每管加入5 μL Annexin V-EGFP 和5 μL 碘化丙啶(PI) 混勻后避光反應(yīng)15 min，用FACSCalibur cytometer 流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)方差表示，利用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析(one-way ANOVA) 比較組間的差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 氧糖剝奪后HNPCs Aggrecan 和Col2a1 表達(dá)水平顯著降低

正常髓核細(xì)胞可分泌蛋白聚糖(Aggrecan) 和Ⅱ型膠原(Col2a1) 合成細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)而維持髓核的穩(wěn)態(tài)。退變髓核細(xì)胞的變化表現(xiàn)為蛋白聚糖解聚增多，Ⅱ型膠原變性[8]。通過檢測氧糖剝奪培養(yǎng)的HNPCs中Aggrecan 和Col2a1 表達(dá)的變化，驗(yàn)證體外退變髓核細(xì)胞模型的建立是否成功。HNPCs 經(jīng)12 h 無血清無糖低氧處理后，采用RT-PCR檢測細(xì)胞質(zhì)中Aggrecan 和Col2a1 的mRNA表達(dá)水平，如圖1 A所示；采用Western blot檢測細(xì)胞質(zhì)中Aggrecan 和Col2a1 蛋白表達(dá)水平，如圖1B所示。與Control 組相比，OGD 組細(xì)胞質(zhì)中Aggrecan和Col2a1 的mRNA表達(dá)水平顯著降低，證明HNPCs 合成Aggrecan 和Col2a1 的能力被無血清無糖低氧處理顯著抑制，HNPCs 退變模型建立成功。

2.2 紅景天苷抑制髓核細(xì)胞退變造成的細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞的凋亡情況。如圖2結(jié)果顯示：OGD組細(xì)胞凋亡率顯著高于Control組，三種不同濃度的紅景天苷作用于氧糖剝奪培養(yǎng)的髓核細(xì)胞，與OGD組相比較，三組紅景天苷組細(xì)胞凋亡率均有所下降，其中30μg/μL紅景天苷組細(xì)胞凋亡率最少，證明30μg/μL紅景天苷組抵抗OGD造成的細(xì)胞凋亡效果最好，選擇30μg/μL濃度紅景天苷進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 細(xì)胞質(zhì)中Aggrecan 和Col2a1的表達(dá)水平下降 與Control組相比，*P<0.05Fig.1 The expression of Aggrecan and Col2a1 decreased in cytoplasm. Compared with control group,*P<0.05

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測人髓核細(xì)胞凋亡情況 與Control組相比，*P<0.05；與OGD組相比，#P<0.05Fig.2 Apoptosis rate of nucleus pulposus cells was assayed with flow cytometry. Compared with control group,*P<0.05; Compared with OGD group,# P<0.05

2.3 紅景天苷抑制髓核細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)

ELISA結(jié)果顯示，與Control組相比較，OGD組TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與OGD組相比較，紅景天苷組TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)降低(P<0.05)，圖3。說明紅景天苷能夠抑制退變髓核細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

圖3 ELISA檢測TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)水平 紅景天苷：30 μg/mL；*P<0.05，與Control組比較；#：P<0.05，與OGD組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義Fig.3 Levels of TNF-α, IL-1β, and IL-6 were measured with ELISA. Salidroside: 30 μg/mL; Compared with control group,* P <0.05; Compared with OGD group,# P <0.05.

2.4 紅景天苷抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路

為了探索紅景天苷調(diào)控髓核細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的機(jī)制，通過Western blotting 分析JAK2/STAT3信號(hào)通路的活化情況。 用30μg/mL 紅景天苷刺激髓核細(xì)胞，觀察發(fā)現(xiàn)JAK2和STAT3磷酸化水平降低。使用JAK2/STAT3 信號(hào)通路抑制劑AG490 30 μmol/L，當(dāng)信號(hào)通路抑制劑與紅景天苷共同作用于退變髓核細(xì)胞時(shí)，JAK2和STAT3磷酸化水平更低，圖4。

2.5 AG490對(duì)髓核細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)的影響

為了進(jìn)一步分析紅景天苷參與退變髓核細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的信號(hào)通路，紅景天苷或紅景天苷與信號(hào)通路抑制劑AG490共同作用于退變髓核細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)檢測髓核細(xì)胞的凋亡，與紅景天苷組相比，AG490組降低細(xì)胞凋亡的效果更顯著(圖5 A，P<0.05)。ELISA檢測細(xì)胞炎癥因子分泌情況，與紅景天苷組相比，AG490組TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)更低(圖5B，P<0.05)。

圖4 紅景天苷對(duì)退變髓核細(xì)胞JAK2/STAT3信號(hào)通路的影響*：P<0.05，與Control組比較，#：P<0.05，與OGD組比較；&： P<0.05，與紅景天苷組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義Fig.4 The effect of salidroside on JAK2/STAT3 signal pathway. Compared with control group,* P<0.05; Compared with OGD group,# P <0.05; Compared with salidroside group,& P <0.05

3 討論

髓核占椎間盤50%～60%的橫斷面積，主要由Aggrecan、水和Col2al 構(gòu)成，具有良好的彈性和膨脹性[9]。退變髓核細(xì)胞中，Aggrecan濃度降低、Ⅰ型膠原取代Col2al，椎間盤開始塌陷，纖維環(huán)和周圍韌帶撕裂[10]，加速了椎間盤的退變。本實(shí)驗(yàn)通過氧糖剝奪模擬退變髓核細(xì)胞在人體內(nèi)所處的微環(huán)境，結(jié)果顯示，氧糖剝奪培養(yǎng)組Aggrecan 和Col2a1 的表達(dá)顯著減少，說明我們成功的構(gòu)建了體外培養(yǎng)的退變髓核細(xì)胞模型。

髓核細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的細(xì)胞減少是椎間盤退變的主要形態(tài)學(xué)改變之一[11]。炎癥因子的分泌是誘發(fā)髓核細(xì)胞凋亡的重要因素[12]。退變椎間盤中的髓核細(xì)胞可以分泌TNF-α、IL-1β和IL-6 等多種炎癥因子[13, 14]。TNF-α 則是人體主要促炎因子，對(duì)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞有趨化作用，并使之活化和脫顆粒，釋放炎性介質(zhì)，誘導(dǎo)髓核細(xì)胞凋亡，同時(shí)還可抑制髓核細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)，從而參與椎間盤退變的病理過程[13]，在椎問盤退變過程中，IL-1β扮演了極為重要的角色[15]。IL-1β-能刺激髓核細(xì)胞產(chǎn)生其他細(xì)胞因子，如IL-6、前列腺素E2等[16]，上調(diào)基質(zhì)降解酶的表達(dá)和活性，加速細(xì)胞外基質(zhì)的降解[16, 17]。除此之外，IL-1β還能抑制蛋白多糖和Ⅱ型膠原的合成，加重椎間盤退變[18]。IL-6 在生物力學(xué)不穩(wěn)的脊柱節(jié)段的椎間盤及退變椎間盤中的含量明顯高于正常[19, 20]，被認(rèn)為是椎間盤退變的關(guān)鍵因子之一[21]。

圖5 JAK2/STAT3信號(hào)通路抑制劑AG490抑制退變髓核細(xì)胞的凋亡及其炎癥因子的分泌 *：P<0.05，與OGD組比較；#：P<0.05，與紅景天苷組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義Fig.5 The inhibitor of JAK2/STAT3 signal pathway AG490 inhibits apoptosis and inflammatory cytokine secretion in degenerated nucleus pulposus cells Compared with OGD group,* P<0.05; Compared with salidroside group,# P<0.05

JAK2/STAT3信號(hào)通路是多種細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的共同通路之一，可轉(zhuǎn)導(dǎo)多種細(xì)胞因子細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)，將細(xì)胞膜感受到的信號(hào)直接傳遞至核內(nèi)，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄[22]。JAK2和STAT3作為該家族中的重要成員，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮著重要作用[23]。研究表明，多種細(xì)胞因子可誘導(dǎo)JAK2活化，進(jìn)而激活下游STAT3表達(dá)，最終導(dǎo)致細(xì)胞行為和功能的改變[24]。目前已發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞因子，包括TNF-α、IL-1β和IL-6 等，它們通過激活JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮作用[25]。同時(shí)，已有研究發(fā)現(xiàn)JAK2/STAT3信號(hào)通路調(diào)控退變椎間盤髓核細(xì)胞相關(guān)基因的分解代謝[26]。因此，髓核細(xì)胞的退變與JAK2/STAT3信號(hào)通路密切相關(guān)。紅景天苷是中藥紅景天的主要活性成分，具有較好的抗炎、抗氧化作用[27]。目前尚未報(bào)道紅景天苷在椎間盤突出中對(duì)JAK2/STAT3信號(hào)通路的影響。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，退變髓核細(xì)胞模型中髓核細(xì)胞的凋亡率增加，TNF-α、IL-1β和IL-6的濃度顯著增加，與OGD組相比，紅景天苷能夠顯著降低退變髓核細(xì)胞的凋亡和炎癥因子分泌。本研究進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，退變髓核細(xì)胞中p-JAK2和p-STAT3蛋白水平增加。考慮可能在髓核細(xì)胞退變過程中，炎癥因子的過度表達(dá)導(dǎo)致JAK2和STAT3的活化，使其與相應(yīng)位點(diǎn)結(jié)合，進(jìn)而誘導(dǎo)了JAK2/STAT3通路進(jìn)一步活化，促進(jìn)炎癥的發(fā)生以及椎間盤損傷。退變髓核細(xì)胞模型給予紅景天苷或者AG490處理后， p-JAK2和p-STAT3的蛋白水平也顯著受到抑制。AG490是JAK2選擇性抑制劑，可通過阻斷JAK特異位點(diǎn)上的酪氨酸或絲氨酸磷酸化而阻斷下游激酶STAT的活化。

在本實(shí)驗(yàn)中紅景天苷顯著降低退變髓核細(xì)胞模型中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量，具有改善退變髓核細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用，同時(shí)抑制JAK2/STAT3蛋白的磷酸化，這同AG490對(duì)退變髓核細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的作用相一致。因此，我們推斷紅景天苷可能通過調(diào)控JAK2/STAT3信號(hào)通路減輕髓核細(xì)胞退變導(dǎo)致的椎間盤突出癥。本研究闡述了紅景天苷對(duì)退變髓核細(xì)胞損傷的作用機(jī)理，同時(shí)為臨床椎間盤突出癥的治療提供理論支持。