章曉云 夏天 陳躍平 廖小林 袁振中 卓映宏 馮洋 藍(lán)佼 趙斌

1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院創(chuàng)傷骨科與手外科，廣西 南寧 530001

2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001

必需微量元素鋅是機(jī)體多種酶的必需組分或激活因子，與機(jī)體發(fā)育、骨骼生長(zhǎng)、免疫功能、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)和核酸代謝等一系列生理活動(dòng)密切相關(guān)[1-2]。正常的鋅營(yíng)養(yǎng)可以促進(jìn)骨骼的健康發(fā)育，而鋅缺乏時(shí)，骨骼的生長(zhǎng)會(huì)受到抑制，骨密度會(huì)降低。補(bǔ)充鋅能夠抑制或減輕一些神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[3]。相反，鋅缺乏能夠加重凋亡[4]。鋅離子代謝的穩(wěn)態(tài)平衡對(duì)維持機(jī)體正常生理功能至關(guān)重要。鋅離子不能自由通過(guò)細(xì)胞內(nèi)的膜結(jié)構(gòu)，必須通過(guò)特定的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和膜通道才可以在細(xì)胞內(nèi)正常代謝。近年來(lái)的研究表明[5-6]，哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)有一類蛋白質(zhì)—-鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，可轉(zhuǎn)運(yùn)鋅離子，并調(diào)節(jié)質(zhì)膜內(nèi)鋅離子濃度。鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體主要包括兩大類，即Slc30 a/ZnT家族和Slc39 a/ZIP家族，它們?cè)阡\離子轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用。其中ZIP蛋白家族能夠促進(jìn)鋅離子從細(xì)胞外或細(xì)胞器的內(nèi)室涌入到細(xì)胞質(zhì)中[7-8]。ZIP1作為ZIP蛋白家族的成員，其與骨代謝和成骨分化有密切的關(guān)系[9]。過(guò)表達(dá)ZIP1的BMSCs可以促進(jìn)其向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化[10-11]。因此，本研究以酒精性股骨頭壞死為模型，研究ZIP1轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)Wnt1/β-catenin信號(hào)成骨通路相關(guān)因子——堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase ALP)、骨鈣素(Osteocalcin OCN)、核心結(jié)合因子α1(Runt-related transcription factor 2， Runx2)以及I型膠原表達(dá)水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

隨機(jī)選擇10只成年健康雄性新西蘭兔，體質(zhì)量2.8～3.4 kg，購(gòu)自廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)主要儀器及器材

紫外分光光度儀(Thermo scientific公司 美國(guó))，高速冷凍離心機(jī)(珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司)，倒置光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)(上海培清科技有限公司)，電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)。ALP抗體與OCN 抗體(武漢BOSTER公司)，I型膠原抗體與Rux2抗體(英國(guó)abcam有限公司)，RIPA裂解液(北京天恩澤生物技術(shù)有限公司)，PBS緩沖液及DMEM-F12培養(yǎng)基(廣州賽業(yè)生物科技有限公司)，胰蛋白酶(上海博尚生物工程公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1兔原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的提取、培養(yǎng)及傳代：將成年新西蘭兔全麻處理后，局部消毒后使用18號(hào)硬膜外穿刺針插入股骨髓腔，然后用5 mL注射器抽取含3000U/mL的肝素0.1 mL并將其注射進(jìn)入髓腔，然后抽取2 mL左右骨髓血。用平衡液將骨髓血洗滌2次，然后用FBS培養(yǎng)液離心沉淀重新打勻。按1∶5的體積比將0.17 mol/L飽和NH4Cl溶液加入已重新打勻的懸液中，然后將其以800 r/min的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心5 min；將上清液舍棄后，加入Ham f-12培養(yǎng)液調(diào)配后進(jìn)行原代培養(yǎng)接種。將貼壁細(xì)胞用0.25%胰酶-1 mmol/L EDTA液進(jìn)行消化分離后，按照1∶3比例進(jìn)行骨髓間質(zhì)干細(xì)胞傳代培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)液，待貼壁細(xì)胞融合在一起直到培養(yǎng)孔的底面被完全覆蓋鋪滿。

1.3.2ZIP1 siRNA轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞：將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞以5×104個(gè)/孔的密度接種在六孔板上,充分搖勻，用含有青鏈霉素、PBS磷酸鉀緩沖液的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。培養(yǎng)3天后細(xì)胞融合度為40%，隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染具體步驟如下：吸棄完全培養(yǎng)基，用PBS磷酸鉀緩沖液洗滌細(xì)胞2次，每孔加入1 mL 含20%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基；用RNAase-free的去離子水溶解siRNA至終濃度為20 nmol/L，再將溶解后的siRNA溶于500 μL opti-MEM中，充分混勻，室溫下靜置5 min，標(biāo)注為A管；另外將5 μL LipofectamineTMRNAiMAX 加入500 μL opti-MEM(堿血清培養(yǎng)基)中，輕輕混勻、靜置5 min，標(biāo)注為B管；然后將A管稀釋好的siRNA和B管LipofectamineTMRNAiMAX輕輕混勻、靜置20 min，以便形成siRNA/LipofectamineTMRNAiMAX復(fù)合物；再將siRNA/LipofectamineTMRNAiMAX復(fù)合物分別加入到含有細(xì)胞和培養(yǎng)基的培養(yǎng)板各孔中，來(lái)回輕柔搖晃細(xì)胞培養(yǎng)板，最后將細(xì)胞放置在CO2培養(yǎng)箱中37 ℃溫育，孵育4 h～6 h后，吸棄轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，用PBS洗兩遍，每孔加入2 mL完全培養(yǎng)基；轉(zhuǎn)染后24 h，吸棄完全培養(yǎng)基，每孔加入1 mL Trizol。

1.3.3ZIP1表達(dá)載體轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞： 轉(zhuǎn)染前一天對(duì)細(xì)胞株進(jìn)行傳代培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合度為70%～80%時(shí)再進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染時(shí)使用Opti-MEM；使用24孔板，每孔加入1 μL ZIP1表達(dá)重組質(zhì)粒，稀釋到100 μL Opti-MEM培養(yǎng)基標(biāo)注為A液，取1 μL Lipofectamine 2000溶解于Opti-MEM培養(yǎng)基為標(biāo)注為B液，B液充分混合5 min后，再將A液和B液充分混合，常溫下放置20 min后平鋪到細(xì)胞培養(yǎng)板中，以上是每孔需要添加的量，孵育4 h～6 h后換為細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基，36 h～48 h后進(jìn)行收樣檢測(cè)。

1.3.4實(shí)驗(yàn)分組及相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)：將兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)及傳代后，取第3代細(xì)胞，計(jì)數(shù)完畢后以1×104個(gè)/mL細(xì)胞濃度分別接種于6孔培養(yǎng)板中。將兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分為3組，即空白對(duì)照組，模型組和轉(zhuǎn)染組。空白對(duì)照組未做任何處理；模型組使用酒精濃度分別為0.03 mol/L，0.09 mol/L，0.15 mol/L，0.21 mol/L進(jìn)行培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染組使用ZIP1 siRNA轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后再用不同濃度乙醇進(jìn)行培養(yǎng)，將各組均放在CO2培養(yǎng)箱中(37 ℃)中進(jìn)行培養(yǎng)6 h，每組重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。收集培養(yǎng)板各孔細(xì)胞，進(jìn)行裂解，提取細(xì)胞蛋白，采用Western-Blotting法測(cè)定各組細(xì)胞中ALP、OCN、Runx2以及I型膠原的相對(duì)含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行描述，使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)組間數(shù)據(jù)兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)差異進(jìn)行單因素方差分析檢測(cè)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)

兔原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞提取常規(guī)培養(yǎng)1、2、3天細(xì)胞生長(zhǎng)情況，可見細(xì)胞逐漸增多，形態(tài)變?yōu)榧?xì)長(zhǎng)梭形。詳見圖1,2,3。

圖1 第1天，細(xì)胞較少，形態(tài)為梭形100xFig.1 On the first day, the cells were less and shuttle shaped

圖2 第2天，細(xì)胞逐漸增多，形態(tài)為長(zhǎng)梭形100xFig.2 On the second day, the cells were gradually increasing and long shuttle shaped

圖3 第3天，細(xì)胞逐漸增多，較密集，形態(tài)為長(zhǎng)梭形100xFig.3 On the third day, the cells were gradually increasing and denser, and were long spindle shaped

2.2 不同酒精濃度下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中ALP、I型膠原、OCN及Runx2的表達(dá)

與空白對(duì)照組相比，不同酒精組的ALP、I型膠原、OCN及Runx2蛋白表達(dá)量均有所下降，隨著濃度升高，其表達(dá)量逐漸下降，但0.03 mol/L組中ALP及OCN下降不明顯，統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)明顯意義(P>0.05)，其他各組均有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，不同酒精組中的I型膠原及Runx2與正常組之間差異均有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1及圖4。

表1 各組ALP、I型膠原、OCN及Runx2相對(duì)表達(dá)量的比較

注：與1組比較△P<0.05，▲P>0.05；與2組比較□P<0.05，■P>0.05；與3組比較☆P<0.05，★P>0.05；與4組比較◇P<0.05，◆P>0.05

Note: Compared with group 1,△P<0.05,▲P>0.05; Compared with group 2,□P<0.05,■P>0.05; Compared with group 3,☆P<0.05,★P>0.05; Compared with group 4,◇P<0.05，◆P>0.05

表2 各組中ALP、I型膠原及OCN相對(duì)表達(dá)量的比較

注：與對(duì)照組比較，**P<0.05；與過(guò)表達(dá)組比較，□P<0.05

Note: Compared with the control group,**P<0.05; Compared with ZiP1 group,□P<0.05

圖4 各組ALP、I型膠原、OCN及Runx2相對(duì)表達(dá)量柱狀圖(**:P<0.01;*:P<0.05. 與空白對(duì)照組相比)Fig.4 Relative expression of ALP, collagen type I, OCN, and Runx2 of each group in a bar graph (compared with the blank control group,**P<0.01;*P<0.05)

2.3 ZIPsiRNA和ZIP1轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)ALP、I型膠原及OCN的相對(duì)表達(dá)量的影響

與空白對(duì)照組對(duì)比，ZIP1表達(dá)組ALP、I型膠原及OCN表達(dá)量明顯升高，差異具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，ZIP1siRNA組ALP、OCN表達(dá)量明顯降低，差異具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而I型膠原表達(dá)量下降不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與ZIP1siRNA組相比，ZIP1表達(dá)組ALP、I型膠原及OCN表達(dá)量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2及圖5。

圖5 各組蛋白相對(duì)表達(dá)量統(tǒng)計(jì)學(xué)比較柱狀圖(**P<0.05, 與對(duì)照組比較)Fig.5 Relative expression of ALP, collagen type I and OCN protein in each group in a bar graph (compared with the blank control group,** P<0.05)

3 討論

骨代謝是人體正常生理代謝過(guò)程中的重要組成部分，通過(guò)不斷進(jìn)行骨組織的吸收與重建進(jìn)行復(fù)雜的代謝過(guò)程，分為骨形成和骨吸收兩個(gè)方面。參與骨代謝的細(xì)胞主要有破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞，它們主要由骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化，而且骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以調(diào)節(jié)代謝過(guò)程中兩者之間的比例，從而維持骨吸收與重建之間的動(dòng)態(tài)平衡。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為一種多能間充質(zhì)干細(xì)胞被大家共識(shí)，它具有多向分化能力，根據(jù)條件的改變向成骨細(xì)胞，脂肪細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，軟骨細(xì)胞等分化，被廣泛應(yīng)用于組織工程和再生醫(yī)學(xué)中[12，13]。

骨髓間質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行成骨分化的過(guò)程中需要多種特異性轉(zhuǎn)錄因子，而且可以合成與分泌多種特異性蛋白以及細(xì)胞外基質(zhì)，如Runx-2、Osterix，ALP，OCN及I型膠原蛋白等[14，15]。其中Runx2因子是成骨分化過(guò)程中最重要的，它與成骨細(xì)胞特異性激活部分相結(jié)合，直接促使特異性基因(如ALP,OCN及I型膠原蛋白等)的表達(dá)，在骨代謝過(guò)程中起到調(diào)控作用[16]。ALP與OCN是骨再生早期及晚期的代表性因子，而I型膠原是骨代謝整個(gè)過(guò)程中的標(biāo)志性因子，這三種因子的表達(dá)直接影響著骨代謝的整個(gè)過(guò)程[17，18]。骨髓間質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)成骨分化的能力直接影響骨折愈合，骨修復(fù)過(guò)程，促使其最大程度向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化對(duì)于臨床上骨不連，酒精性股骨頭壞死的治療具有非常重要的作用。臨床大量研究表明[19-21]酒精在骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的定向分化過(guò)程中，通過(guò)降低ALP、OCN、Runx2，I型膠原含量抑制Wnt1/β-catenin信號(hào)成骨通路，而且隨著酒精濃度的提高而逐漸降低。大量實(shí)驗(yàn)研究表明[22，23]在誘導(dǎo)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過(guò)程中，增加Wnt1/β-catenin信號(hào)通路表達(dá)活躍，同時(shí)ALP、OCN、Runx2，I型膠原等相關(guān)成骨基因的表達(dá)量也逐漸升高。本研究結(jié)果同樣也證明了隨著酒精濃度的升高，ALP、I型膠原、OCN及Runx2蛋白表達(dá)量均有所下降，從而影響股骨頭壞死的修復(fù)及治療效果。

隨著組織工程學(xué)及分子生物學(xué)飛速發(fā)展，越來(lái)越多的細(xì)胞因子被發(fā)現(xiàn)可以促使骨髓間質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化。雖然這些生長(zhǎng)因子與蛋白能促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化，但它們發(fā)生作用的過(guò)程中或多或少地受到人體微量元素的影響。同時(shí)ALP中有個(gè)重要的輔基是鋅離子，其活性受到鋅離子水平的影響，作為成骨分化過(guò)程中一個(gè)重要的蛋白酶，可見鋅可以通過(guò)調(diào)控基因表達(dá)從而促進(jìn)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。雖然鋅離子已經(jīng)被證實(shí)對(duì)成骨作用有很好的促進(jìn)作用，但是其仍然受到自身無(wú)法自由進(jìn)出細(xì)胞內(nèi)外的局限，它必須依靠特定轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白才能通過(guò)細(xì)胞膜通道從而完成其在細(xì)胞內(nèi)的正常代謝。目前研究已證實(shí)ZIP蛋白家族具有調(diào)控和轉(zhuǎn)運(yùn)鋅離子的功能[24，25]，ZIP1和鋅離子共同作用能抑制成骨細(xì)胞凋亡，促進(jìn)成骨分化，ZIP1與骨代謝和成骨分化之間具有密切的關(guān)系[26，27]。本研究結(jié)果表明ZIP1過(guò)表達(dá)組ALP、I型膠原及OCN表達(dá)量顯著高于正常對(duì)照組及ZIP1干擾組，而ZIP1表達(dá)下降時(shí)，ALP及OCN表達(dá)量也明顯下降。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)ZIP1將細(xì)胞外的鋅離子通過(guò)細(xì)胞膜通道不斷的轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的鋅離子激活A(yù)LP、膠原酶、RNA聚合酶、DNA聚合酶等與骨分化密切相關(guān)的鋅依賴性酶的活性，同時(shí)鋅離子的進(jìn)入直接激活了鋅指蛋白的高表達(dá)，從而進(jìn)一步促進(jìn)成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Osterix的表達(dá)，最終使ALP、I型膠原及OCN合成顯著增加。本研究證實(shí)了ZIP1能促使骨髓間質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化，從而促進(jìn)骨修復(fù)及骨代謝。沉默ZIP1表達(dá)能抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的Wnt1/β-catenin信號(hào)成骨通路的表達(dá)，從而抑制促進(jìn)細(xì)胞的成骨分化能力。其具體機(jī)制可能是ZIP1通過(guò)鋅離子的轉(zhuǎn)運(yùn)從而激活骨代謝相關(guān)的蛋白酶及轉(zhuǎn)錄因子，從而增加成骨相關(guān)因子ALP、I型膠原及OCN的合成與表達(dá)，最后促使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化，促進(jìn)骨修復(fù)及骨代謝。