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12周是使用卵巢切除法建立雌性C57/BL6J成年小鼠絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型的合適時機

2018-08-02 01:33傅光濤劉生李長川伍俊妍李仕勛秦嶺劉偉邱俊雄彭芃丁悅
中國骨質(zhì)疏松雜志 2018年5期
關(guān)鍵詞:去勢微結(jié)構(gòu)雌性

傅光濤 劉生 李長川 伍俊妍 李仕勛 秦嶺 劉偉 邱俊雄 彭芃 丁悅,5*

1. 中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院骨外科,廣東 廣州 510120

2. 中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院核醫(yī)學科,廣東 廣州 510120

3. 中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院藥學部,廣東,廣州 510120

4. 香港中文大學醫(yī)學院骨科&肌肉骨骼研究實驗室 香港

5. 中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院廣東省惡性腫瘤表觀遺傳學與基因調(diào)控重點實驗室,廣東 廣州 510120

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量降低、骨脆性增加、骨強度下降、骨折風險性增大為特征的全身性、代謝性骨病。骨質(zhì)疏松癥是中國60歲以上人口面臨的主要健康殺手之一,預(yù)計到2020年,將有超過2億中國人受骨質(zhì)疏松癥和骨量減少的影響[1]。骨質(zhì)疏松癥及其并發(fā)癥顯著增加了患者的致殘率及死亡率,嚴重影響患者的生活質(zhì)量[2]。因此,明確骨質(zhì)疏松癥的確切發(fā)病機制,研制有效的預(yù)防及治療骨質(zhì)疏松癥的方法具有重要的臨床意義。骨質(zhì)疏松癥動物模型作為基礎(chǔ)研究的重要媒介,在上述研究過程中起著十分重要的作用。卵巢切除法由于其建模因素單一,建模成功率高,可重復(fù)性好,可信度大,且能夠很好地體現(xiàn)雌激素水平下降等優(yōu)點,已成為應(yīng)用最廣泛的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥動物模型的建模方法[3]。目前,卵巢切除術(shù)誘導(dǎo)的雌性SD大鼠骨質(zhì)疏松模型的技術(shù)已非常成熟,并在骨質(zhì)疏松領(lǐng)域的研究中得到廣泛應(yīng)用[4]。美國食品藥物管理局也建議選擇切除6~9個月齡的雌性SD大鼠的雙側(cè)卵巢來構(gòu)建絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥動物模型[5]。但是大鼠作為整體模型具有成本高、周期長、用藥量大等缺點,并不能完全滿足研究者對建模動物的要求。C57/BL6J小鼠因其遺傳背景清晰,易于繁殖且耐受性強,是目前基礎(chǔ)研究中應(yīng)用最為廣泛的小鼠種屬之一[6]。由于其生理周期及卵巢切除后的骨量變化趨勢與大鼠相似,骨丟失同樣可被雌激素替代療法所預(yù)防,C57/BL6J小鼠目前也越來越多地應(yīng)用于骨質(zhì)疏松及骨量基因控制領(lǐng)域的研究中[4,7,8]。但與建模技術(shù)成熟、應(yīng)用最為廣泛的大鼠相比,卵巢切除術(shù)誘導(dǎo)的小鼠絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型的建模周齡及建模所需時間目前尚無統(tǒng)一的標準。研究者采用的雌性小鼠建模周齡的跨度較大(6~24周),造模時間更是參差不齊(1~12周)[7-14]。

本研究使用雙能X線骨密度儀(dual energy X-ray absorptiometry, DEXA)及micro-CT測量不同周齡的C57/BL6J雌性小鼠在卵巢切除術(shù)后不同時間點的全身、脊柱及下肢骨密度(bone mineral density, BMD),脛骨近端骨微結(jié)構(gòu)及相關(guān)參數(shù)變化,探討卵巢切除術(shù)誘導(dǎo)的C57/BL6J雌性小鼠絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型的合適建模周齡及建模所需的時間。

1 資料與方法

1.1 實驗動物

本研究使用的60只SPF級成年C57/BL6J雌性小鼠均于中山大學東校區(qū)實驗動物中心購置。本研究已取得中山大學動物實驗倫理批件(倫理審批號:IACUC-DB-16-0308),所有實驗流程均嚴格遵守實驗室動物護理和使用指南。實驗前,所有小鼠均于中山大學北校區(qū)實驗動物中心內(nèi)飼養(yǎng)1周以上以適應(yīng)環(huán)境。每個籠子飼養(yǎng)6只小鼠,不限水的攝入量,并給與標準飲食。室溫維持于22°C,濕度為60%~75%,每日光照時間為12 h。

1.2 實驗分組

60只C57/BL6J雌性小鼠隨機平均分為8周去勢組(n=30)及12周去勢組(n=30)。8周去勢組小鼠于8周,12周去勢組小鼠于12周分別進行雙側(cè)卵巢切除術(shù),兩組小鼠均于手術(shù)當天,術(shù)后6周、8周、10周及12周各隨機抽取6只小鼠進行全身、脊柱及下肢的BMD測量及脛骨近端的micro-CT測量。

1.3 雙側(cè)卵巢切除術(shù)

使用戊巴比妥鈉(1%,50 mg/kg,腹腔注射)麻醉成功后,俯臥位固定小鼠。背部備皮,切口區(qū)域使用75%酒精擦拭消毒3次。于肋下1 cm水平作一長約1 cm的縱行切口,切開筋膜,鈍性分離肌肉及腹膜,在腸系膜脂肪中找到呈紅色的,大小約3~4 mm的卵巢,在子宮角上用絲線結(jié)扎輸卵管,完整切斷輸卵管及卵巢[15]。使用同樣的方法進行切除對側(cè)卵巢及輸卵管。使用可吸收線依次縫合肌肉及皮膚。術(shù)后將切除的組織行HE染色以確定為卵巢組織。實驗期間所有小鼠均未出現(xiàn)傷口感染及死亡。

1.4 BMD測量

小鼠使用戊巴比妥鈉(1%,50 mg/kg,腹腔注射)麻醉成功后,固定于俯臥位。根據(jù)既往研究所描述的流程[16],使用DEXA(LUNAR DPXMD#5966, Madison, WI, USA)及系統(tǒng)自帶的小動物骨密度分析軟件測定小鼠的全身、脊柱及下肢的BMD(g/cm2)。

1.5 micro-CT測定

所有小鼠均在測量BMD結(jié)束后予過量麻醉藥法處死。將剔除周圍軟組織的脛骨標本置于10%福爾馬林中固定24 h后進行micro-CT掃描 (SkyScan 1176; SkyScan, Kontich, Belgium)。掃描條件如下:源電壓45 kV、源電流500 μA、曝光時間240 ms,分辨率18 μ m,濾片選擇0.2 mm厚度的鋁片。使用micro-CT自帶的三維重建軟件(NRecon, Skyscan, Kontich, Belgium)對所有掃描圖片進行3D重建,并使用系統(tǒng)分析軟件(CTAn, Skyscan, Kontich, Belgium)計算距離脛骨近端骺板1 mm~2mm區(qū)域(共60張圖片)的松質(zhì)骨的骨體積分數(shù) (BV/TV,%),骨小梁數(shù)量(Tb. N, 1/nm)及骨小梁分離度 (Tb. Sp, μm)。所有測量及分析流程均嚴格遵守美國骨礦鹽研究學會推薦的骨微結(jié)構(gòu)micro-CT測量指南的規(guī)定[17]。

1.6 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示。使用K-S檢驗確定所有數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布后,使用方差分析進行多組間的比較,如發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學差異,則使用LSD檢驗進行進一步的兩兩比較。兩組間的比較則使用獨立樣本t檢驗。P<0.05為具有統(tǒng)計學差異。上述計算使用SPSS 20.0軟件(SPSS Headquarters, Chicago, IL, USA)實現(xiàn)。

2 結(jié)果

2.1 DEXA測定的小鼠全身、脊柱及下肢BMD

12周小鼠的全身、脊柱及下肢BMD均較8周時有所升高,但差異無統(tǒng)計學意義(圖1A-C)。8周去勢組小鼠的術(shù)后6周及8周的全身和下肢BMD較術(shù)前顯著升高,隨后的時間點則可見BMD的緩慢下降(圖1D, 1F)。8周去勢組小鼠各時間點的脊柱BMD相比無統(tǒng)計學差異(圖1E)。12周去勢組小鼠各時間點的全身,脊柱及下肢BMD相比均無統(tǒng)計學差異(圖1G-I)。

2.2 micro-CT測量結(jié)果

micro-CT三維重建圖可見,兩組小鼠在去勢后,其脛骨近端骨微結(jié)構(gòu)均隨著時間的推移而退化,且12周小鼠更為顯著(圖2)。定量分析的結(jié)果顯示:與8周相比,12周小鼠的脛骨近端Tb.N有顯著升高(圖3B),Tb.Sp有顯著下降(圖3C)。8周去勢組的小鼠在術(shù)后8周首次觀察到BV/TV,Tb.N及Tb.Sp較術(shù)前的顯著性改變,上述參數(shù)的變化在隨后的時間點有所減緩(圖3D-F)。12周去勢組小鼠則在去勢6周后即可觀察到BV/TV,Tb.N及Tb.Sp的顯著性變化,上述參數(shù)在隨后的隨訪時間中進入平臺期(圖3G-I)。

3 討論

圖1 DEXA測量的8周及12周小鼠的全身、脊柱及下肢BMD(g/cm2)(A-C)對比。8周去勢組(D-F)及12周去勢組小鼠(G-I)各部位的各時間點的BMD(g/cm2)對比*P<0.05Fig.1 Comparison of the BMD (g/cm2) of total body, spine and lower extremity assessed by DEXA between 8-week-old mice and 12-week-old mice (A-C), and the comparison among different time points in both groups (D-F: 8 w-OVX group, G-H: 12 w-OVX group).*indicated P<0.05 when comparing to the baseline.

圖2 8周去勢組及12周去勢組小鼠各時間點的代表性脛骨近端松質(zhì)骨micro-CT三維重建圖(A: 8周去勢組, B: 12周去勢組)Fig.2 Representative micro-CT 3D reconstructed images of the proximal tibia obtained from each time points in both groups (A: 8 w-OVX group, B: 12 w-OVX group).

圖3 8周小鼠的骨體積分數(shù)(BV/TV,%),骨小梁數(shù)目(Tb.N,1/μm)和骨小梁分離度(Tb.Sp,μm)與12周小鼠的對比(A-C)。8周去勢組(D-F)及12周去勢組(G-I)小鼠組內(nèi)各時間點之間BV/TV(%), Tb.N(1/μm)和Tb.Sp(μm)的比較。與基線相比時,*P<0.05,**P<0.01。與前一個時間點相比時,# P<0.05,## P<0.01。Fig.3 Comparison of t BV/TV (%), Tb.N (1/μm), and Tb.Sp (μm) of the proximal tibia between 8-week-old mice and 12-week-old mice (A-C), and the comparison among different time points in both groups (D-F: 8 w-OVX group, G-I: 12 w-OVX group). *indicated P<0.05 and **indicated P<0.01 when comparing to the baseline.#indicated P<0.05 and ##indicated P<0.01 when comparing to the former time point.

DEXA測量的脊柱、股骨近端及髖部BMD是美國骨質(zhì)疏松指南小組推薦的臨床診斷骨質(zhì)疏松癥的金標準,同時也是目前評估動物(兔、大鼠等)BMD及骨礦鹽含量應(yīng)用最為廣泛的非侵入性檢測技術(shù)[18-20]。既往的研究發(fā)現(xiàn),DEXA測量的大鼠肱骨標本骨礦鹽含量與骨灰量測定法的結(jié)果有顯著的相關(guān)性(r=0.988)[21]。DEXA還可檢測出小動物脛骨骨礦鹽含量最小低至0.004 g,BMD最小低至0.003 g/cm2的變化[22]。但近期有研究者發(fā)現(xiàn),在使用DEXA測量體重僅為20~30 mg的小鼠骨量時會存在較大誤差。與骨灰量測定法相比,DEXA測得的小鼠股骨及脛骨的骨礦鹽含量分別有最高達68%及107%的增加,且兩種方法的測量結(jié)果無明顯的相關(guān)性。研究者認為,小鼠骨骼尺寸較小、骨量較低,會增加DEXA分辨骨骼及周圍軟組織的難度,最終影響DEXA測量結(jié)果的準確性[23]。此外,雖已有為小動物BMD測量而設(shè)計的專用軟件,但測量過程仍需較多的人工操作,難以避免會存在一定的偏倚。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥以骨量減少,骨微結(jié)構(gòu)退化為特征,而微結(jié)構(gòu)的退化從形態(tài)學觀察主要表現(xiàn)為骨小梁變薄、變細,甚至斷裂。因此,骨小梁也是骨質(zhì)疏松動物模型非常重要的觀察指標[24]。micro-CT的最高分辨率可達微米級,可提供足夠的精度供其對小鼠的骨小梁(寬度約為30~50 μm)等微結(jié)構(gòu)進行精確測量[25]。此外,研究者還發(fā)現(xiàn)micro-CT與骨標本組織形態(tài)學的測量結(jié)果具有良好的一致性[26]。micro-CT是非侵入性檢查方法,與骨標本組織形態(tài)學相比,還具有可對小鼠進行多次重復(fù)檢查,動態(tài)觀察骨微結(jié)構(gòu)變化的優(yōu)勢。骨質(zhì)疏松領(lǐng)域權(quán)威雜志《Journal of Bone and Mineral Research》2010年發(fā)表的《運用micro-CT評價嚙齒類動物骨微結(jié)構(gòu)指南》也推薦micro-CT作為評估小鼠及其他小動物骨形態(tài)及骨微結(jié)構(gòu)的金標準[17]。本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn),在12周小鼠去勢6周后,micro-CT已發(fā)現(xiàn)脛骨近端骨微結(jié)構(gòu)明顯的惡化及相關(guān)參數(shù)的顯著下降,但DEXA測量的BMD仍較術(shù)前無顯著的變化。鑒于C57/BL6J小鼠的BMD均低于目前常用的小鼠種屬(C3H, CD-1及SW)[27]。故我們認為,本研究中出現(xiàn)的DEXA測量的BMD結(jié)果與micro-CT測量結(jié)果并不完全一致的現(xiàn)象與C57/BL6J小鼠BMD較低,DEXA未能對其進行精確測量有關(guān)。綜上所述,與DEXA相比,micro-CT更適合于評估小鼠模型的BMD及骨微結(jié)構(gòu)變化。

小鼠8周~12周時體成熟并具有繁殖能力,此時卵巢切除術(shù)對其骨量的影響顯著[28]。在12周之前,小鼠長骨生長迅速,骨形態(tài)、骨礦質(zhì)量及骨生物力學等指標快速增加,其脛骨總BMD、皮質(zhì)骨BMD與小鼠周齡有顯著的相關(guān)性;12周~42周期間,小鼠骨代謝進入平穩(wěn)期,上述指標趨于穩(wěn)定[29]。Glatt等的研究也得到類似的結(jié)果:C57/BL6J雄性及雌性小鼠的全身BMD均在12周前有顯著的升高,并在隨后的24周內(nèi)保持穩(wěn)定的水平[30]。本研究的結(jié)果也發(fā)現(xiàn),12周小鼠脛骨近端的骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)顯著高于8周小鼠,與既往研究結(jié)果相符。因此我們認為,8周的C57/BL6J小鼠雖然已接近體成熟,但仍處于生長發(fā)育階段,骨代謝活躍,骨礦鹽含量、BMD及骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)仍隨周齡的增大而顯著增加,對卵巢切除術(shù)誘導(dǎo)的骨量丟失有一定的影響,故其建立骨質(zhì)疏松模型所需的時間可能較長。進一步的結(jié)果也證實了這一假設(shè),12周去勢組小鼠在去勢6周后即出現(xiàn)脛骨近端骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)的顯著變化,而8周去勢組小鼠則需要8周??偠灾?,考慮到建模的成功率及建模時間,本研究認為12周是使用卵巢切除法建立雌性C57/BL6J成年小鼠絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型的合適時機。

本研究存在一定的局限性。首先,離體標本的micro-CT測量僅提供了小鼠特定時間點的BMD及骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)信息,活體micro-CT可提供對小鼠BMD變化的連續(xù)縱向的評估,可有效降低誤差。其次,對小鼠外觀變化,脛骨標本組織學分析及骨轉(zhuǎn)換標志物水平的測量可提供小鼠在卵巢切除術(shù)后骨重塑方面的更多的信息,下一步的研究將繼續(xù)完善上述內(nèi)容。

綜上所述,與DEXA相比,micro-CT更適合于評估小鼠模型的BMD及骨微結(jié)構(gòu)變化??紤]到建模的成功率及建模時間,本研究認為12周是使用卵巢切除法建立雌性C57/BL6J成年小鼠絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型的合適時機。

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