楊全增 張成俊 丁寧 李忠浩 夏亞一*

1. 蘭州大學(xué)第二醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000

2. 甘肅省骨關(guān)節(jié)疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000

適宜的機(jī)械應(yīng)力可以刺激成骨細(xì)胞，介導(dǎo)骨組織的重建，通常機(jī)體能感受到的機(jī)械應(yīng)力有牽張應(yīng)力、壓應(yīng)力、FSS、電磁力及離心力等[1]。FSS是一種存在廣泛、研究較為充分的機(jī)械應(yīng)力，正常活動對骨組織施加的機(jī)械應(yīng)力刺激可引起骨組織腔隙結(jié)構(gòu)內(nèi)液體的流動，形成FSS，最終導(dǎo)致成骨細(xì)胞增殖及分化[1]。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶5(extracellular signal regulated kinase，ERK5)信號通路是目前發(fā)現(xiàn)的絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族新成員，它可以被應(yīng)激、生長因子和應(yīng)力刺激等干預(yù)措施激活，參與細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等[2]。我們實(shí)驗(yàn)室前期研究已發(fā)現(xiàn) ERK5 信號通路可被FSS激活，從而參與細(xì)胞的增殖[2]、分化[3]和抑制凋亡[4]等過程。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)可以降解骨基質(zhì)，基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs)可以抑制MMPs的功能，MMPs和TIMPs之間保持平衡有利于骨重建的正常進(jìn)行[5]。但是，F(xiàn)SS是否通過 ERK5 信號通路調(diào)節(jié)MMPs和TIMPs的表達(dá)水平，目前還不清楚。本研究將采用ERK5 特異性阻斷劑 XMD8-92 干預(yù)成骨細(xì)胞，觀察FSS對成骨細(xì)胞 MMPs 和 TIMPs 表達(dá)的影響，并探討ERK5 信號通路在這一過程中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：MC3T3-E1 細(xì)胞(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院)。試劑：胎牛血清(PAN-Biotech，德國)；α-MEM培養(yǎng)基(Hyclone 公司，美國)；磷酸鹽緩沖液PBS(中杉金橋，中國)；胰蛋白酶(Sigma 公司，美國)；青霉素-鏈霉素雙抗(武漢博士德，中國)；RIPA 強(qiáng)力細(xì)胞裂解液(碧云天生物技術(shù)有限公司，中國)；PMSF(Genview，美國)；鼠β-actin一抗(Sigma，美國)；兔MMP-1-抗(Abcam，英國)；兔MMP-3-抗(Abcam，英國)；兔MMP-13-抗(Abcam，英國)；鼠TIMP-1-抗(Abcam，英國)；兔TIMP-2-抗(Abcam，英國)；兔TIMP-3-抗(Abcam，英國)；山羊抗兔二抗(中杉金橋，中國)；兔抗小鼠二抗(中杉金橋，中國)。實(shí)驗(yàn)儀器：細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海力申科學(xué)儀器有限公司，中國)；垂直電泳儀(Bio-Rad，美國)，電轉(zhuǎn)儀(Bio-Rad，美國)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)：將小鼠MC3T3-E1細(xì)胞接種到無菌培養(yǎng)瓶中，α-MEM 培養(yǎng)基中添加10% 胎牛血清和 100 U/mL青-鏈霉素制成完全培養(yǎng)基，在溫度37 ℃、CO2飽和度5%的培養(yǎng)箱中孵育細(xì)胞，每隔2 d～3 d換液1次，待細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)，用0.25%胰酶消化，接種至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)傳代培養(yǎng)。

1.2.2加載流體剪切力(FSS)：加載FSS時(shí)使用的是我們實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的數(shù)字化多通道 FSS 加載系統(tǒng)(實(shí)用新型專利號：ZL201520637211.6)，該系統(tǒng)主要包括：計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)、6個(gè)密閉加力小室、醫(yī)用硅膠管道、蠕動泵、儲液柱、硅膠墊圈及螺絲等。在顯微鏡下觀察培養(yǎng)瓶中的成骨細(xì)胞，選擇生長達(dá)80%～90%時(shí)以上融合的成骨細(xì)胞，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的成骨細(xì)胞用胰酶作用后，輕輕吹打成細(xì)胞懸液。將吹打好的細(xì)胞懸液(濃度約為4 000個(gè)/ mL)接種于20 mm×50 mm無菌蓋玻片上，靜置約1 h待細(xì)胞完全貼壁后加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞融合至80%～90%后，放置蓋玻片到密閉加力小室中，組裝層流流體小室，并將其連接到儲液柱和蠕動泵上。向儲液柱中加入200 mL預(yù)熱(37 ℃)的α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以蠕動泵為動力，在時(shí)效試驗(yàn)時(shí)，加載大小為12 dyn/cm2的FSS，分別作用0、15、30、45、60 min，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中加載FSS 45 min。

1.2.3蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blotting)：迅速吸除成骨細(xì)胞的培養(yǎng)液，用預(yù)冷(4 ℃)的 PBS 輕柔沖洗細(xì)胞 3 次，然后吸凈培養(yǎng)瓶或是玻片中的 PBS 液體。接著加入 RIPA和PMSF的混合液(100∶1)裂解細(xì)胞，置于冰上緩慢搖晃30 min 后，用細(xì)胞刮刀刮下，將細(xì)胞收集于1.5 mL的EP管中。然后，在 4 ℃ 12 000 r/min 條件下離心 15 min，用移液器緩慢吸取上清液于EP管中，加入上清液1/3體積量的蛋白上樣緩沖液，立即在沸水中煮沸3 min～5 min，然后放到-80 ℃冰箱冷藏。以β-actin作為內(nèi)參；配制聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE凝膠)，然后經(jīng)過上樣、電泳、電轉(zhuǎn)、封閉、孵育一抗、洗膜、孵育二抗、洗膜、曝光等步驟得到條帶。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 加載不同時(shí)間FSS對MMP-1 和TIMP-1 蛋白表達(dá)的影響

我們課題組前期研究已表明，12 dyn/cm2FSS是對成骨細(xì)胞最適宜的刺激，為了尋求最佳的FSS加載時(shí)間，對MC3T3-E1細(xì)胞加載12 dyn/cm2FSS 分別作用0、15、30、45、60 min，采用 Western blotting方法檢測MMP-1和 TIMP-1蛋白表達(dá)的情況，以β-actin 作為內(nèi)參。如圖1～圖3所示，MMP-1和TIMP-1蛋白的變化呈現(xiàn)時(shí)間依賴性。MMP-1從15 min 開始逐漸增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，在45 min達(dá)到高峰，60 min已經(jīng)開始下降，但仍然高于空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，TIMP-1在15 min時(shí)表達(dá)量開始下降，在45 min時(shí)降到最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；在60 min時(shí)表達(dá)量又上調(diào)。這說明在MC3T3-E1成骨細(xì)胞中，隨著FSS加載時(shí)間的延長，F(xiàn)SS可以上調(diào)MMP-1的表達(dá)，下調(diào)TIMP-1的表達(dá)，加載45 min作用最明顯，因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選用45 min的FSS加載時(shí)間。

圖4 XMD8-92及FSS對P-ERK5表達(dá)的影響注：*P<0.05；**P<0.01Fig.4 Effect of XMD8-92 and FSS on the expression of P-ERK5Note:*P<0.05；**P<0.01

圖1 FSS對成骨細(xì)胞內(nèi)的 MMP-1和TIMP-1 蛋白表達(dá)的影響Fig.1 Effect of fluid shear stress on the expression of MMP-1 and TIMP-1 in osteoblasts

圖2 FSS對成骨細(xì)胞內(nèi)MMP-1表達(dá)的影響注：*P<0.05；**P<0.01Fig.2 Effect of fluid shear stress on the expression of MMP-1 in osteoblastsNote:*P<0.05；**P<0.01

圖3 FSS對成骨細(xì)胞內(nèi)TIMP-1表達(dá)的影響注：*P<0.05；**P<0.01Fig.3 Effect of fluid shear stress on the expression of TIMP-1 in osteoblastsNote:*P<0.05；**P<0.01

2.2 XMD8-92及FSS對P-ERK5表達(dá)的影響

我們實(shí)驗(yàn)室前期研究已發(fā)現(xiàn)，加載FSS 45 min可以完全激活MC3T3-E1細(xì)胞中的ERK5，即促進(jìn)ERK5的磷酸化水平，XMD8-92為ERK5 特異性的抑制劑；如圖4所示，為了檢測 FSS 對MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)ERK5活化的影響，加載12 dyn/cm2的FSS作用45 min，可以明顯促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)ERK5的磷酸化，即P-ERK5/ERK5比例明顯上升(P<0.01)；用5 μmol XMD8-92預(yù)處理MC3T3-E1細(xì)胞1 h，Western blotting結(jié)果發(fā)現(xiàn)XMD8-92不僅能抑制正常 MC3T3-E1細(xì)胞中的ERK5 的活化(P<0.05)，而且能抑制FSS誘導(dǎo)的P-ERK5的表達(dá)(P<0.01)，這與我們以前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

2.3 XMD8-92及FSS對MMPs表達(dá)的影響

為了檢測FSS對MC3T3-E1細(xì)胞MMPs表達(dá)的影響，加載12 dyn/cm2的FSS作用45 min，如圖5～圖8所示，可以明顯上調(diào)MC3T3-E1細(xì)胞MMP-1、MMP-13的表達(dá)(P<0.001)和MMP-3的表達(dá)(P<0.05)；用5 μmol XMD8-92預(yù)處理MC3T3-E1細(xì)胞1 h，Western blotting結(jié)果發(fā)現(xiàn)XMD8-92不僅能下調(diào)正常MC3T3-E1細(xì)胞中的MMP-1、MMP-3的表達(dá)(P<0.001)和MMP-13的表達(dá)(P<0.05)，而且能下調(diào)FSS誘導(dǎo)的MMP-1、MMP-13的表達(dá)(P<0.001)和MMP-3的表達(dá)(P<0.05)。

圖5 XMD8-92及FSS對MMPs表達(dá)的影響Fig.5 Effect of XMD8-92 and FSS on the Expression of MMPs

圖6 XMD8-92及FSS對MMP-1表達(dá)的影響Fig.6 Effect of XMD8-92 and FSS on the Expression of MMP-1

圖7 XMD8-92及FSS對MMP-3表達(dá)的影響注：*P<0.05；***P<0.001Fig.7 Effect of XMD8-92 and FSS on the Expression of MMP-3Note:*P<0.05；***P<0.001

圖8 XMD8-92及FSS對MMP-13表達(dá)的影響Fig.8 Effect of XMD8-92 and FSS on the Expression of MMP-13

2.4 XMD8-92及FSS對TIMPs表達(dá)的影響

為了檢測FSS對MC3T3-E1細(xì)胞TIMPs表達(dá)的影響，加載12 dyn/cm2的FSS作用45 min，如圖9～圖12所示，可以明顯下調(diào)MC3T3-E1細(xì)胞TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3的表達(dá)(P<0.05)，用5 μmol XMD8-92預(yù)處理MC3T3-E1細(xì)胞1 h，Western blotting結(jié)果發(fā)現(xiàn)XMD8-92不僅能上調(diào)正常MC3T3-E1細(xì)胞中TIMP-1、TIMP-2的表達(dá)(P<0.05)和TIMP-3的表達(dá)(P<0.001)，而且能上調(diào)FSS誘導(dǎo)的TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3的表達(dá)(P<0.05)。

圖9 XMD8-92及FSS對TIMPs表達(dá)的影響Fig.9 Effect of XMD8-92 and FSS on the Expression of TIMPs

圖10 XMD8-92及FSS對TIMP-1表達(dá)的影響Fig.10 Effect of XMD8-92 and FSS on the Expression of TIMP-1

圖11 XMD8-92及FSS對TIMP-2表達(dá)的影響注：*P<0.05；***P<0.001Fig.11 Effect of XMD8-92 and FSS on the Expression of TIMP-2Note:*P<0.05；***P<0.001

圖12 XMD8-92及FSS對TIMP-3表達(dá)的影響Fig.12 Effect of XMD8-92 and FSS on the Expression of TIMP-3

3 討 論

適宜的機(jī)械應(yīng)力刺激對成骨細(xì)胞的功能和代謝起著重要的作用[6]，通常機(jī)體能感受到的機(jī)械應(yīng)力有壓應(yīng)力、牽張應(yīng)力、剪切應(yīng)力、離心力及電磁力等，正常骨組織的生長、重建以及骨折后的骨痂塑形等都與生理性或外加機(jī)械應(yīng)力刺激密切相關(guān)[7]。FSS是一種存在廣泛、研究較為充分的機(jī)械應(yīng)力，人體正常骨組織中存在大量的腔隙結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)中充滿了組織液，機(jī)體正?；顒訒r(shí)對骨組織施加的機(jī)械應(yīng)力將引起骨腔隙間液流動產(chǎn)生FSS，最終導(dǎo)致成骨細(xì)胞增殖及分化[8]。中等大小FSS作用30 min～60 min可刺激成骨細(xì)胞增殖，而較高的FSS反而則抑制成骨細(xì)胞增殖[9]。

MAPK家族是重要的信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，主要包括ERK1/2、JNK、P38、ERK5以及ERK3/4[10]，ERK5信號通路是MAPK 家族中最新的成員，目前對其研究較少，MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可以被應(yīng)激、生長因子和應(yīng)力刺激等干預(yù)措施激活，通過信號分子的磷酸化將細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)信號，廣泛參與到細(xì)胞的增殖、分化以及凋亡等活動中[11]。我們實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，ERK5在FSS調(diào)節(jié)的成骨細(xì)胞增殖中發(fā)揮著重要作用[12]。

MMPs是存在于骨基質(zhì)中的蛋白酶，可降解多種膠原和骨基質(zhì)，在重建細(xì)胞外基質(zhì)和維持正常的骨形態(tài)方面起著重要的作用；當(dāng)骨組織受到較小的機(jī)械應(yīng)力作用時(shí)，不能有效刺激骨基質(zhì)的合成，長此以往則會導(dǎo)致骨量減少，形成骨質(zhì)疏松；而過載的機(jī)械應(yīng)力作用則會產(chǎn)生病理性編織骨，骨質(zhì)發(fā)生增生硬化，骨細(xì)胞的生長也受到抑制，只有處于生理范圍內(nèi)的機(jī)械力學(xué)刺激才能有效的促進(jìn)成骨，介導(dǎo)骨組織的重建[13]。骨重建是通過骨吸收和骨形成兩種機(jī)制的偶聯(lián)進(jìn)行，骨吸收包括骨基質(zhì)的降解，成骨細(xì)胞產(chǎn)生的MMPs可以降解骨基質(zhì)，TIMPs可以特異性的抑制MMPs的功能，MMPs和TIMPs之間保持平衡是有利于骨重建的正常進(jìn)行[14]。

有研究表明FSS作用于成骨細(xì)胞，可以上調(diào) MMPs 的表達(dá)，MMPs是存在于骨基質(zhì)中的蛋白酶，可以降解細(xì)胞外基質(zhì)，引起信號分子的釋放，誘導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的啟動，從而促進(jìn) Runx-2、c-fos/c-jun、Nmp4/CIZ 等基因的表達(dá)[15]。在本研究中，根據(jù)我們實(shí)驗(yàn)室前期的研究，對MC3T3-E1成骨細(xì)胞加載12 dyn/cm2FSS 分別作用0、15、30、45、60 min，MMP-1和TIMP-1蛋白的變化呈時(shí)間依賴性；MMP-1從15 min 開始逐漸增加，在45 min達(dá)到高峰，60 min已經(jīng)開始下降，TIMP-1在15 min時(shí)表達(dá)量開始下降，在45 min時(shí)降到最低，在60 min時(shí)表達(dá)量又上調(diào)。這說明加載FSS 45 min是最有效的刺激，F(xiàn)SS可以促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞中MMPs的表達(dá)，降解骨基質(zhì)和Ⅰ型膠原，進(jìn)而促進(jìn)骨吸收；隨著FSS加載時(shí)間的延長，MMPs表達(dá)量上調(diào)，可以激活其特異性抑制因子TIMPs，從而抑制MMPs的功能以阻止其對骨基質(zhì)和Ⅰ型膠原的過度降解，調(diào)節(jié)MMPS和TIMP-1保持平衡，維持機(jī)體正常的骨重建。有研究發(fā)現(xiàn)在人牙周韌帶干細(xì)胞中，F(xiàn)SS增加了MMP-1、MMP-2的表達(dá)，抑制TIMP-2的表達(dá)，用細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)阻滯劑干預(yù)后阻斷了FSS誘導(dǎo)的MMP-1的表達(dá)，這表明FSS誘導(dǎo)MMP-1的表達(dá)是通過ERK信號通路來調(diào)節(jié)的[16]。本研究結(jié)果表明，F(xiàn)SS加載45 min可以明顯促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞MMP-1、MMP-3、MMP-13的表達(dá)，下調(diào)TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3的表達(dá)，用ERK5 特異性抑制劑 XMD8-92 干預(yù)后減弱了FSS 對MMPs和TIMPs的作用，說明 ERK5信號通路參與了FSS對MMPs和TIMPs表達(dá)的調(diào)節(jié)。

ERK5信號通路具體是通過哪個(gè)靶點(diǎn)分子介導(dǎo)FSS對MC3T3-E1成骨細(xì)胞MMPs和TIMPs表達(dá)的調(diào)節(jié)，是否有其他通路參與其中，目前還不清楚，有待進(jìn)一步的研究。骨質(zhì)疏松癥等骨吸收性疾病與局部MMPs的異常表達(dá)密切相關(guān)，目前對MMPs的認(rèn)識還很有限，希望通過更深入的研究，闡明其與原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥發(fā)病的關(guān)系，有助于研發(fā)MMPs抑制性藥物用于該類疾病的治療。