張軻 羅由平

宜賓市第二人民醫(yī)院小兒外科，四川 宜賓 644000

更年期是婦女重要的身體過渡期，而絕經后骨質疏松癥是一個嚴重的健康問題[1]。目前絕經后骨質疏松癥的治療在很大程度上依靠藥物治療[2]。然而，由于藥物治療過程帶來的副作用導致部分患者依從性嚴重降低。相比之下，全身振動性訓練法(Whole body vibration，WBV)作為一種自然、有效的非藥物性手段，近年來在絕經后骨質疏松癥治療中越來越受到重視[3-4]。然而，WBV預防骨質疏松癥的確切機制尚不完全清楚。

最近有報道，絕經后婦女[5]或去卵巢(ovariectomized，OVX)大鼠[6-7]的骨質疏松癥與骨髓脂肪組織的增加導致以成骨細胞為代價的脂肪細胞的形成有關。成骨細胞和骨髓脂肪細胞來源于常見的骨多能間充質干細胞(BMSC)祖細胞[8]。據(jù)報道，機械負荷可以下調BMSCs中的過氧化物酶體增殖劑激活受體(PPARγ)，并以犧牲脂肪生成為代價促進成骨細胞生成[9]。已知β-連環(huán)蛋白是眾所周知的多基因位點的調節(jié)脂肪細胞分化，包括PPAR衰減。機械應變通過持久的刺激β-連環(huán)蛋白信號來抑制間充質干細胞的脂肪形成[10]。此外，據(jù)報道機械負荷通過磷酸化骨骼肌細胞中GSK3β酶來抑制其活性，進而激活β-連環(huán)蛋白，進一步證明機械負荷可以利用GSK-3β/β -連環(huán)蛋白信號傳導通路[11]。

因此，我們假設全身振動性訓練法可能通過抑制OVX大鼠骨骼肌中GSK-3的表達來調節(jié)β-連環(huán)蛋白信號。在本研究中，我們考察了全身振動性訓練法對OVX大鼠骨骼肌中PPARγ，β-連環(huán)蛋白和磷酸化糖原的表達合成酶激酶-3(P-GSK-3)蛋白質表達的影響，并與雌激素替代療法的療效進行比較。此外，我們還考察了全身振動性訓練對血清黃體生成素(LH)和17β-雌二醇水平的影響，旨在為WBV改善絕經后骨質疏松癥提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動物和材料

健康3月齡雌性SD大鼠50只購自川北醫(yī)學院動物實驗中心(實驗動物生產許可證號：SCXK(川)2013-0004)，體重(230 ± 25)g，所有大鼠分籠飼養(yǎng)在具有標準飼養(yǎng)條件的動物房。大鼠標準飼料由動物實驗中心提供。哺乳動物細胞裂解試劑盒(MCL-1)、17β-雌二醇購自北京博歐實德生物技術有限公司，LH、E2試劑盒的試劑盒購于上海酶聯(lián)生物科技公司。羊抗鼠β-連環(huán)蛋白單抗、兔抗鼠P-GSK-3β單抗、兔抗鼠PPARγ單抗、羊抗鼠β-actin單抗均購自上海廣銳生物科技有限公司，二抗以及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒均購自北京中杉金橋生物公司。LC-714掃頻振動試驗機購自上海林頻儀器股份有限公司。BX51-P光學顯微鏡購自日本奧林巴斯公司。

1.2 動物分組和干預

所有雌性大鼠適應性飼養(yǎng)2周后，根據(jù)體重隨機分為正常對照組、去卵巢組、17β-雌二醇治療組和全身振動性訓練組。正常對照組(Sham，n=10)大鼠進行與去勢手術相同的手術操作，但僅切除雙側卵巢周圍的小塊脂肪組織；其余三組大鼠均實施去勢手術。去勢手術基本過程如下：大鼠經常規(guī)腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉后，仰臥固定，在無菌操作下以第13肋遠端脊柱旁縱行切開，逐層分離，找到卵巢并完全摘除，最后逐層縫合。傷口用碘酒外擦，并于術后第2 d起每只大鼠肌注青霉素，連續(xù)3 d，3萬U/d，以預防術后感染。術后適應性喂養(yǎng)7天，隨機分為三組：去卵巢組(OVX組，n=10)，給予17β-雌二醇治療組(E2組，n=10)和進行全身振動性訓練組(WBV組，n=10)。術后14天，E2組大鼠皮下注射17β-雌二醇25 g/ kg，3次/周，共14周。術后7天，WBV組大鼠進行適應性振動訓練，每天首先持續(xù)運動10 min、休息10 min后再連續(xù)運動10 min，振動頻率50 Hz、振幅0.9 mm[12]。7天后，改用Tezval等[13]提出的方法進行振動訓練，每天首先持續(xù)運動15 min、休息15 min后再連續(xù)運動15 min，振動頻率90 Hz、振幅0.5 mm。大鼠在振動過程中允許在籠中自由移動。持續(xù)訓練14周。每周根據(jù)體重變化調整E2的注射劑量。模型組和正常對照組均在同一時間灌胃攝入等質量蒸餾水，但不進行全身振動性訓練運動。所有干預治療均在早上進行。

1.3 組織收集

大鼠在最后一次運動或E2治療24-36 h后處死，在處死前禁食12 h。從大鼠腹主動脈收集血液樣品，4 ℃，1 800 g離心15 min，收集血清樣本并冷凍保存。血液采集結束后立即分離并稱重每只大鼠的子宮和內臟脂肪。然后將腰椎切除并清除軟組織，將Wfth腰椎(L5)用生理鹽水濕潤的紗布包裹，并冷凍至-70 ℃以進行生物力學測量。剝離下肢取出雙側腓腸肌組織，一部分保存于在含4%甲醛的磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中用于免疫組織化學，另一部分在液氮中冷凍以進行蛋白質提取。

1.4 血清E2和LH

通過放射免疫測定(RIA)測定血清E2(批內和批間變異系數(shù)：4.8%和10.0%)和LH(批內和批間變異系數(shù)：5.4%和10.2%)濃度。

1.5 生物力學測量

生物力學測量通過腰椎椎體與材料測試系統(tǒng)進行測定，在測試之前使用金剛石鋸去除頭側和尾側以便于加載至儀器表面。在測試過程中，每隔0.02秒收集一次力和位移測量值，從而得出極限力。

1.6 免疫組化

根據(jù)文獻報道的方法進行免疫組織化學[14]。方法為：將腓腸肌組織進行脫蠟和水化，D用PBS沖洗后提取抗原，PBS洗滌3次，使用10%牛血清室溫封閉1 h。然后在4 ℃下將切片與稀釋的小鼠單克隆β-連環(huán)蛋白抗體(1∶100)孵育一個晚上，第二天用PBS洗滌組織，隨后與生物素綴合的第二抗體(載體，1∶200)在37 ℃下溫育1 h。PBS洗滌切片，加入辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素，在37 ℃溫育1 h。進行PBS沖洗，根據(jù)制造商的說明書用DAB試劑盒使第一抗體結合顯現(xiàn)。最后用水洗滌組織，進行蘇木精復染。為確?？乖禺愋?，使用動物免疫前IgG作為陰性對照進行平行實驗。

1.7 蛋白質提取和Western blot分析

使用哺乳動物細胞裂解試劑盒獲得腓腸肌組織的蛋白質裂解物。簡而言之，在冰上，將50 mg腓腸肌組織置于RIPA緩沖液中進行勻漿，隨后將勻漿物與該試劑盒一起提供的蛋白酶抑制劑混合物在冰上放置1 h，12000 ×g，4 ℃，離心30 min。收集上清液并測定蛋白濃度。制作10%～20% Tricine梯度凝膠，加入20 μg蛋白進行電泳分離，轉移至纖維蛋白膜，并用5%脫脂牛奶溶液室溫封閉1 h，加入1∶1000倍稀釋的β-連環(huán)蛋白單抗(同免疫組織化學)、1∶1000倍稀釋的P-GSK-3β單抗、1∶2000倍稀釋的PPARγ單抗和1∶4000倍稀釋的β-actin單抗與膜一起在4 ℃孵育過夜。膜洗3次，HRP標記的山羊抗鼠IgG二抗(1∶1000)室溫孵育2 h。根據(jù)制造商的說明書進行NBT-BCIP檢測。

1.8 統(tǒng)計分析

2 結果

2.1 體重和臟器脂肪重量

在OVX術后第1周末，四組之間的體重沒有顯著差異。從OVX術后第2周到實驗結束，OVX組的體重均顯著高于Sham組(P<0.05)。從OVX術后第4周或第3周到實驗結束，WBV組或E2組的體重均顯著低于OVX組(P<0.05)，見圖1A。

與體重變化相一致，OVX組的臟器脂肪重量顯著高于Sham組(P<0.05)。在WBV或雌激素替代治療的干預下，WBV組或E2組的臟器脂肪重量均顯著低于OVX組(P<0.05)，見圖1B。

圖1 各組體重(A)和臟器脂肪重量(B)情況與Sham組比較，*P<0.05；與OVX組比較，#P<0.05Fig.1 Body weight (A) and organ fat weight (B) in each group. Compared with Sham group,*P<0.05; compared with OVX group,#P<0.05

2.2 血清E2和LH水平

OVX組大鼠血清LH比Sham組和E2組明顯升高(P<0.05)，而WBV組血清相比較沒有明顯變化(圖2A)。OVX組大鼠血清E2水平與Sham組、E2組和WBV組相比明顯上升(P<0.05)(圖2B)。

圖2 各組血清LH(A)和E2(B)水平變化與Sham組比較，*P<0.05；與OVX組比較，#P<0.05Fig.2 The changes of serum LH (A) and E2 (B) levels in each group. Compared with Sham group,*P<0.05; compared with OVX group,#P<0.05

2.3 生物力學

如圖3所示，與其他三組相比，OVX組的L5極限強度顯著降低(P<0.05)。

圖3 各組L5極限強度。與Sham組比較，*P<0.05；與OVX組比較，#P<0.05Fig.3 Ultimate Strength of L5 in each group. Compared with Sham group,*P<0.05; compared with OVX group,#P<0.05

2.4 Western blot分析結果

Western blot檢測骨骼肌組織中PPARγ、β-連環(huán)蛋白和P-GSK-3β蛋白的表達，結果顯示，與Sham組相比，OVX組骨骼肌PPARγ表達顯著升高(P< 0.05)，而β-連環(huán)蛋白和P-GSK-3β蛋白表達均顯著降低(P< 0.05)。在WBV或雌激素替代治療的干預下，這一變化得到有效阻止，即WBV組或E2組的PPARγ較OVX組明顯下降(P<0.05)，β-連環(huán)蛋白和P-GSK-3β蛋白表達均顯著高于OVX組(P<0.05)，見圖4。

圖4 各組大鼠骨骼肌組織中PPARγ、β-連環(huán)蛋白和P-GSK-3β蛋白的表達情況與Sham組比較，*P<0.05；與OVX組比較，#P<0.05Fig.4 The expression of PPARγ, β-catenin and P-GSK-3β proteins in skeletal muscles of rats in each group. Compared with Sham group,*P<0.05; compared with OVX group,#P<0.05

2.5 免疫組織化學結果

免疫組織化學結果顯示，Sham組的骨骼肌組織中β-連環(huán)蛋白陽性染色主要集中在細胞核和細胞質中。OVX組的細胞核和細胞質中幾乎沒發(fā)現(xiàn)β-連環(huán)蛋白陽性表達，而WBV組或E2組均存在β-連環(huán)蛋白陽性表達。在沒有加入第一抗體的陰性對照中沒有發(fā)現(xiàn)β-連環(huán)蛋白的免疫反應性染色。免疫組化觀察到與Western blot結果相同的變化趨勢，見圖5。

圖5 免疫組織化學方法檢測骨骼肌中β-連環(huán)蛋白的表達(×100)A：Sham組，B：OVX組，C：WBV組，D：E2組，E：陰性對照組Fig.5 The protein expression of β-catenin in skeletal muscles detected by immunohistochemistry. Specimens were observed at magnification ×100. A: Sham group, B: OVX group, C: WBV group, D: E2 group, E: negative control group

3 討論

WBV是一種新興的訓練方法，是指在被動的狀態(tài)下通過振動來刺激肌肉反應和協(xié)調能力，進而提高肌肉伸縮力量[15-16]。近年來，WBV已經引起我國康復界和體育界研究人員的重視，如陸鐵[17]等研究認為低量高頻率全身振動干預是降低老年女性骨質疏松性骨折發(fā)生的有效措施；劉洋等[18]研究發(fā)現(xiàn)振動方案可延緩絕經后女性股骨上端骨丟失。然而，目前對WBV訓練對骨骼肌的影響研究較少，尤其對于其作用機制的研究更是少見。因此，本研究的主要目的是強調WBV可以激活OVX大鼠骨骼肌中Wnt/β-連環(huán)蛋白信號傳導通路，并抑制PPARγ蛋白的表達。研究結果顯示，OVX大鼠腰椎強度顯著降低，以及骨骼肌中β-連環(huán)蛋白和P-GSK-3β蛋白表達顯著降低。所有這些OVX引起的變化都能通過WBV或雌激素替代治療干預進行明顯地逆轉。此外，WBV干預不會產生雌激素對血清LH水平的影響。

骨密度是骨質疏松癥診斷的良好預測指標，而骨強度是骨折風險的重要預測指標。本研究結果顯示，OVX組的L5極限強度較Sham組顯著降低，而這種降低可以被WBV干預治療有效阻止。我們的結果與Bu等[19]報道的結果一致，因此可以認為WBV在防止絕經大鼠腰椎骨量減少有重要作用。

骨質量穩(wěn)態(tài)受多種因素相互作用的調節(jié)，包括生長因子、全身性激素和機械負荷[20]。在這些因素中，機械負荷是骨細胞調整骨骼結構以維持骨強度的重要因素[21]。目前，已有研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路不僅在對骨機械負荷的正常生理反應發(fā)揮重要作用[22]，同時也是成骨細胞早期對負荷反應的一個組成部分[23]。由于β-連環(huán)蛋白的水平可以作為判斷Wnt/β -連環(huán)蛋白信號傳導通路激活的指標[24]，因此本研究首先分析了WBV干預后OVX大鼠骨骼肌β-連環(huán)蛋白的表達情況，Western blot分析和免疫組織化學結果發(fā)現(xiàn)WBV干預有效提高了骨骼肌中β-連環(huán)蛋白表達，表明Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路參與了運動抑制OVX大鼠骨質流失。最近的證據(jù)表明，機械應變通過持久刺激β-連環(huán)蛋白信號來抑制間充質干細胞向脂肪細胞分化[25]，然而對于β-連環(huán)蛋白的機械刺激是否對OVX大鼠骨骼肌細胞向脂肪細胞分化產生抑制作用仍需進一步研究。

GSK-3β在經典Wnt信號通路中發(fā)揮關鍵作用，其通過對底物的磷酸化激活Wnt信號通路或使其失活，并參與骨量的調節(jié)。GSK-3β失活會導致β-連環(huán)蛋白穩(wěn)定化并轉移至衛(wèi)星細胞的細胞核中，從而激活下游Wnt靶基因[26]。以往的研究表明，GSK3β可加快β-連環(huán)蛋白磷酸化進程，導致其被蛋白酶體降解。因此，細胞中β-連環(huán)蛋白水平的保存至少部分取決于機械負荷通過磷酸化GSK-3β酶來抑制其活性[25]。本研究中，WBV增加了OVX大鼠骨骼肌中GSK-3β的磷酸化，表明機械活化OVX大鼠骨骼肌中的β-連環(huán)蛋白信號可能部分取決于對GSK-3β活性的抑制作用。

PPARγ通過結合PPAR反應元件而對基因轉錄予以調節(jié)[27]。PPARγ和β-連環(huán)蛋白的功能相互作用已在包括BMSCs在內的一些組織和細胞中得到證實[28]。PPARγ表達降低可增加骨髓腔中成骨細胞生成，相反PPARγ表達增加可以通過誘導β-連環(huán)蛋白的降解來增強脂肪形成[29]。這些結果表明，防止β-連環(huán)蛋白的降解可以阻止干細胞向脂肪細胞分化。在本研究中，WBV不僅抑制了PPARγ蛋白表達，而且刺激了β-連環(huán)蛋白表達。提示WBV對降低脂肪量和防止骨量丟失的作用機制可能與調節(jié)骨髓間充質干細胞分化，并防止β-連環(huán)蛋白的降解有關，然而具體作用機制仍需進一步研究。

總之，我們的數(shù)據(jù)表明WBV能有效預防OVX大鼠的骨質流失，并提高骨質強度，這可能與抑制OVX大鼠骨骼肌中GSK-3β和PPARγ活性來激活β-連環(huán)蛋白信號傳導通路有關。此外，WBV與雌激素替代治療干預治療療效相當，但是WBV干預不會產生雌激素對血清LH水平的影響。