張香芝，吳淑華，李揚揚，溫菲菲，高向前，何雙，劉夢瑤

(濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院，山東濱州256603)

胃癌發(fā)生隱匿，且許多患者的組織標本在形態(tài)學上難以區(qū)別高級別上皮內瘤變(HGIN)與早期胃癌，給早期胃癌的診斷帶來困難[1,2]。近年來研究發(fā)現，真核細胞存在一種程序性死亡方式，即自噬。自噬與許多疾病的發(fā)生密切相關[3,4]。但有關自噬在早期胃癌演進過程中的變化規(guī)律及作用尚不明確。本研究采用免疫組化法同步檢測正常胃黏膜、慢性萎縮性胃炎、低級別上皮內瘤變(LGIN)、HGIN和早期胃癌組織中自噬相關基因LC3、Raptor、Rictor表達，探討細胞自噬在胃癌發(fā)生中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年6月～2016年12月于濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院行胃鏡檢查者160例。病理檢查提示胃黏膜正常30例(正常組)，其中男20例、女10例，年齡34～70歲；慢性萎縮性胃炎30例(胃炎組)，其中男22例、女8例，年齡35～65歲；LGIN 30例(LGIN組)，其中男18例、女12例，年齡30～65歲)；HGIN 30例(HGIN組)，其中男16例、女14例，年齡30～70歲；早期胃癌40例(胃癌組)，其中男26例、女14例，年齡30～70歲。各組性別、年齡具有可比性。早期胃癌的診斷參照中國早期胃癌篩查及內鏡診治共識意見[5]，上皮內瘤變診斷參照維也納分型標準[6]，慢性萎縮性胃炎診斷參照2010年WHO消化系統(tǒng)疾病診斷標準[7]。病例均為首次發(fā)現，取病理標本前均未進行任何治療。

1.2 胃黏膜組織LC3、Raptor、Rictor表達檢測 采用免疫組化EnVision法。取各組胃黏膜組織(胃鏡下胃黏膜剝離術獲得)石蠟標本切片，脫蠟，水化，高壓熱修復抗原，3%過氧化氫氧化15 min；滴加LC3、Raptor、Rictor一抗(工作液濃度均為1∶100)，4 ℃過夜；滴加通用型二抗，37 ℃孵育30 min；DAB顯色，LC3顯色時間為1 min，Raptor、Rictor顯色時間為2 min；蘇木素復染，鹽酸乙醇分化，返藍，脫水透明，封片。LC3用已知結直腸癌的陽性切片作為陽性對照，Raptor、Rictor用睪丸癌切片作為陽性對照，均用PBS代替一抗作為陰性對照。LC3表達于細胞膜或細胞質，Raptor、Rictor表達于細胞質，均以出現棕黃色顆粒為陽性標志。每張切片隨機選取10個高倍(×400)視野進行圖像采集，采用Image Pro Plus6.0圖像分析軟件進行半定量分析，檢測所選10個視野陽性區(qū)域的積分光密度(IOD)值，以平均值作為相對表達量。

2 結果

2.1 各組胃黏膜組織 LC3、 Raptor、Rictor表達比較 LC3表達：正常組、胃炎組、LGIN組、HGIN組、胃癌組胃黏膜組織LC3表達逐漸升高，除LGIN組與胃炎組比較差異無統(tǒng)計學意義外，其他各組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。Rictor表達：胃炎組、LGIN組、HGIN組、早期胃癌組Rictor表達逐漸升高，組間比較P均<0.05；早期胃癌組、HGIN組、LGIN組均高于胃炎組和正常組(P均<0.05)，早期胃癌組低于HGIN組、LGIN組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組胃黏膜組織LC3與 Raptor、Rictor相對表達量比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與胃炎組比較，△P<0.05；與LGIN組比較，#P<0.05；與HGIN組比較，▲P<0.05。

2.2 各組胃黏膜組織LC3、Raptor、Rictor表達的相關性 LGIN組、HGIN組及胃癌組胃黏膜組織LC3表達與Raptor表達均呈負相關(r分別為-0.435、-0.168、-0.467，P均<0.05)，Raptor與Rictor表達均呈負相關(r分別為-0.260、-0.312、-0.223，P均<0.05)；各組LC3與Rictor表達均無明顯相關性。見表2。

2.3 早期胃癌組織LC3、Raptor、Rictor表達與患者臨床病理參數的關系 早期胃癌組織LC3、Raptor與Rictor表達與腫瘤分化程度、浸潤深度均相關(P均<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤直徑均無明顯關系(P均>0.05)。見表3。

表2 各組 LC3、Raptor、Rictor表達的相關性

3 討論

細胞自噬是一種依賴溶酶體的降解途徑，與細胞生存、生長、分化及內環(huán)境穩(wěn)態(tài)關系密切。不同狀態(tài)下的細胞自噬其功能和作用不盡相同。正常細胞中的自噬通常呈低水平，這種適度的基礎自噬對于生命個體至關重要，通過降解和再利用細胞內受損物質發(fā)揮抗凋亡和促進細胞修復的作用，從而維持生命過程[3]。腫瘤細胞中的自噬不僅在腫瘤細胞生長、分化和腫瘤耐藥等方面扮演重要角色，而且存在促進與抑制腫瘤進展的雙重作用[7,8]。在腫瘤進展階段，由于腫瘤細胞的快速生長往往造成部分腫瘤細胞處于缺氧及饑餓狀態(tài)，通過自噬可降解腫瘤細胞內受損的蛋白質和細胞器，為其生長提供營養(yǎng)及能量[9]。腫瘤細胞可通過自噬維持線粒體功能及能量平衡，以滿足自身生長及增殖所需的代謝，從而促進腫瘤生長。另一方面，過度自噬可導致腫瘤細胞自噬性死亡[11,12]。Shchors等[13]研究發(fā)現，聯(lián)合應用丙咪嗪與噻氯匹定可誘導神經膠質瘤細胞過度自噬，引起腫瘤細胞自噬性死亡。本課題組前期研究顯示，自噬不僅影響結直癌的發(fā)生、發(fā)展，并且與腫瘤耐藥密切相關，不同的自噬相關基因在腫瘤的不同階段發(fā)揮的作用不同[11～14]。由此可見，自噬與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關系復雜，明確自噬活性改變對腫瘤發(fā)生、發(fā)展的影響及其意義，對于進一步揭示腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制，對于為臨床提供腫瘤檢測、診斷、治療等有價值的指標具有重要意義。

表3 早期胃癌組織LC3、Raptor、Rictor相對表達量與患者臨床病理參數的關系

注：浸潤深度中黏膜內為癌組織未侵犯黏膜肌層，黏膜下層為癌組織侵犯黏膜下層。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是多階段、多基因和多因素參與的復雜過程。在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中，Correa[15]提出的正常胃黏膜→慢性淺表性胃炎→慢性萎縮性胃炎→腸上皮化生→LGIN→HGIN→胃癌的演變途徑，已成為公認的腸型胃癌發(fā)生模式[15]。該途徑中自噬所扮演的角色及意義也引起人們的關注。LC3是哺乳動物細胞自噬發(fā)生的標志物，其表達水平可以直接反映自噬的活性。研究發(fā)現，胃癌組織中LC3表達異常升高[16]；胃癌細胞質中LC3呈高表達，而在非癌性上皮細胞中其不表達或低表達[17]；LC3在胃癌組織中高表達，其與腫瘤分期相關[18]。目前正常胃黏膜、萎縮性胃炎、LGIN、HGIN、早期胃癌細胞自噬變化規(guī)律的相關研究鮮見。本研究結果顯示，LC3在正常胃黏膜、慢性萎縮性胃炎、LGIN、HGIN、早期胃癌組織中均有不同程度表達，且呈逐漸升高趨勢。LC3陽性表達部位因病變類型不同而不同，非腫瘤性腺體中LC3主要表達于細胞膜及細胞膜下，而在腫瘤性腺體中則同時表達于細胞質和細胞膜。我們認為這可能與腫瘤細胞和非腫瘤細胞的超微結構及代謝不同有關。慢性萎縮性胃炎時胃黏膜腺體萎縮、減少，萎縮的細胞內自噬泡、微囊泡和殘留小體增加；固有腺黏液顆粒及囊泡的擴張導致自噬泡在內的其他細胞器被推擠于胞膜下，甚至與胞膜融合，所以自噬標記物LC3表達多位于細胞膜及細胞膜下。當細胞發(fā)生癌變時，細胞質和細胞膜可同時表達LC3。我們推測，此時細胞增生活躍，代謝旺盛，且處于去分化狀態(tài)。細胞的自噬活性增加，一方面通過增加自噬降解自身代謝產物，另一方面通過與胞膜結合，加強向胞外輸出不能再利用的代謝產物，以維持腫瘤細胞的內環(huán)境穩(wěn)態(tài)[19]。因此，LC3的不同表達部位對于判斷腫瘤性與非瘤性腺體有潛在意義。

細胞自噬的激活和抑制過程受到多種細胞信號通路的調控，其中PI3K/AKT/mTOR信號通路對自噬發(fā)揮重要調控作用[20]，該通路中mTOR是負向調控自噬的重要分子，被稱為自噬的“門控分子”[21]。mTOR屬于大分子復合物，以mTORC1和mTORC2兩種復合體形式存在，其中Raptor(mTOR)與Rictor分別為兩者的核心分子，分別在調控蛋白質合成、代謝以及細胞增殖、血管生成和自噬等過程中發(fā)揮重要作用，Raptor、Rictor表達水平可反映mTORC1和mTORC2的生物學活性[22]。研究表明，在PI3K/AKT/mTOR信號通路中，Raptor不僅負向調控自噬，同時抑制Rictor活性，而Rictor則可通過激活上游AKT形成對Raptor的負反饋調節(jié)通路[23]。Byeon等[24]對mTOR與胃癌的相關研究發(fā)現，mTOR在胃癌組織中呈高表達，其高表達的患者預后較差。目前Raptor、Rictor與早期胃癌的關系尚缺乏深入研究。本研究結果顯示，Raptor在早期胃癌組織中的表達高于慢性萎縮性胃炎和正常黏膜組織，但低于各上皮內瘤變組織，而Rictor表達隨腫瘤級別的增加而逐漸升高，且在早期胃癌組織中其表達高于其他組織。我們認為這種現象與mTOR的負反饋調節(jié)通路及腫瘤發(fā)生過程中Raptor、Rictor的功能可能不同有關[25,26]。在上皮內瘤變階段，Raptor、Rictor同時被激活，細胞開始處于活躍增殖狀態(tài)。伴隨腫瘤進展，為適應腫瘤細胞快速生長和代謝需求，Raptor水平逐漸降低，腫瘤細胞自噬活性增強，以維持腫瘤細胞內環(huán)境穩(wěn)態(tài)[27]。與此同時，由于Raptor對Rictor的抑制作用減弱，Rictor則相應地被進一步激活，并通過負反饋機制激活其上游的AKT，繼而調控下游的Raptor，使自噬保持在一個適度的維穩(wěn)狀態(tài)[28～30]。本研究中上皮內瘤變及早期胃癌組織中Raptor表達分別與LC3、Rictor表達呈負相關，LC3與Rictor之間無相關性。提示Raptor與Rictor兩者互為調控，在早期胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮協(xié)同作用，維持腫瘤細胞生長內環(huán)境的穩(wěn)定。

如前所述，自噬與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關，Raptor、Rictor在調節(jié)細胞自噬狀態(tài)的過程中發(fā)揮調控作用，但在早期胃癌發(fā)生、發(fā)展的不同階段，LC3與Raptor、Rictor表達與患者臨床病理參數的關系鮮見報道。本研究結果發(fā)現，在早期胃癌組織中LC3、Raptor、Rictor表達與腫瘤分化程度、浸潤深度均密切相關。我們認為，早期胃癌組織中LC3表達升高與Raptor表達減低有關，而維持自噬水平的平衡則與Rictor的負反饋有關，三者在促進細胞癌變和持續(xù)增殖中發(fā)揮協(xié)同作用。

綜上所述，細胞自噬可促進胃癌的發(fā)生，其機制可能為促進LC3、Raptor、Rictor表達。LC3、Raptor、Rictor在促進胃癌的發(fā)生中起協(xié)同作用。