葉 坤， 蘆顏美， 張 玲， 周賢惠， 李耀東， 張疆華， 邢 強(qiáng)， 祖克拉·吐爾洪，張銀玲， 布阿杰爾·古麗， 湯寶鵬

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟起搏電生理科， 烏魯木齊 830054)

心房纖顫是危害人類健康、嚴(yán)重影響生活質(zhì)量的重要心血管疾患之一，隨著人口老齡化，房顫的發(fā)生率逐漸增高[1-2]。對房顫發(fā)病機(jī)制的理解有助于指導(dǎo)臨床建立更有效的治療方案[3]。而穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)動物疾病模型的建立是研究發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ)。上個(gè)世紀(jì)開始，出現(xiàn)了構(gòu)建房顫的各種動物模型以供臨床研究[4-6]。目前最經(jīng)典的房顫電重構(gòu)模型為心房快速起搏(rapid atria pacing，RAP)，可以模擬房顫時(shí)各項(xiàng)電生理數(shù)據(jù)的變化[7]。本研究在此基礎(chǔ)上建立閾上迷走神經(jīng)刺激介導(dǎo)型的心房纖顫模型，模型制作成功后，檢測房顫模型中電重構(gòu)的電生理指標(biāo)變化、結(jié)構(gòu)重構(gòu)的心肌纖維化以及糖原累積的變化、自主神經(jīng)重構(gòu)中心房神經(jīng)節(jié)叢的神經(jīng)指標(biāo)變化，最終通過這些客觀指標(biāo)評價(jià)模型的優(yōu)劣。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)對象成年健康比格犬13只，雌雄不限，體質(zhì)量(12.0±1.5)kg，年齡1～2歲，由新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物中心提供。實(shí)驗(yàn)通過新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)，審批號：IACUC-20121122005。實(shí)驗(yàn)遵守美國國立衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)動物研究指南指導(dǎo)實(shí)施，犬年齡、健康狀況、以及后期犬的營養(yǎng)飼養(yǎng)、監(jiān)護(hù)等，均由中級職稱獸醫(yī)師(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物中心)評定、專業(yè)飼養(yǎng)員負(fù)責(zé)。

1.2方法

1.2.1 動物準(zhǔn)備和電生理測量標(biāo)準(zhǔn) 13只比格犬，隨機(jī)分為2組，GroupI為心房快速起搏(rapid atria pacing，RAP)6 h組(n=6)，GroupII為RAP+迷走神經(jīng)刺激(vagal nerve stimulation，VNS)6 h組(n=7)。欲行手術(shù)前動物禁食、水12 h。常規(guī)消毒手術(shù)器械、手術(shù)服、手術(shù)環(huán)境。嚴(yán)格按照無菌技術(shù)規(guī)范要求操作。專職獸醫(yī)給予犬戊巴比妥鈉20 mg/kg麻醉，并建立通暢靜脈通道，給予持續(xù)滴注麻醉鎮(zhèn)痛復(fù)合液(具體成份包含：0.9%氯化鈉注射液250 mL，氯化琥珀膽堿注射液300 mg，枸櫞酸芬太尼注射液0.1 mg)，維持手術(shù)中肌松狀態(tài)。待犬的狀況穩(wěn)定后行氣管插管，呼吸機(jī)輔助呼吸，調(diào)節(jié)氧流量4～6 L/min，潮氣量計(jì)算為20 mL/kg，在空氣流通的房間內(nèi)給予呼吸機(jī)正壓通氣、保溫毯保持體溫(36.5±1.5)℃上下。按照標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)聯(lián)連接心電圖導(dǎo)線，應(yīng)用LEAD-7000多導(dǎo)電生理記錄儀-動態(tài)記錄犬正常肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖。犬胸部剪除犬毛，用碘酒、酒精消毒切口后，選擇左、右兩側(cè)按順序先后分別第4肋間開胸。多極電極分別縫制在左右心房、左右心耳，用于起搏以及記錄單相動作電位(monophasic action potential，MAP)，各個(gè)部位程序刺激以及MAP記錄均由電極連接心臟程序刺激儀完成(Lead-7000 EP Control，Sichuan Jinjiang，China)。電極縫制完畢，逐層關(guān)胸。監(jiān)測血氧飽和度、動脈血壓等犬的基礎(chǔ)生命體征及癥狀。左心耳縫制的多極電極，起搏頻率設(shè)定為1 200次/min，起搏電壓為2倍起搏閾值(threshold，TH)。房顫誘發(fā)率測量應(yīng)用LEAD-7000電生理儀，采用S1S1刺激30 s，觀察房顫是否維持5 s以上，若有則定義為成功誘發(fā)1次，每個(gè)部位重復(fù)測量3次，同一區(qū)域多個(gè)部位誘發(fā)率的平均值為最終區(qū)域誘發(fā)率。房顫定義為心房無序的電活動，心電圖表現(xiàn)為P波消失，代之以大小不等、間隔不均，形態(tài)不一的f波，頻率450～600次/min，RR間期不等，持續(xù)5 s以上。

1.2.2 頸部迷走神經(jīng)干刺激 分離犬頸部右側(cè)迷走神經(jīng)干，給予采用一對自制鍍鎢銀絲(直徑0.1 mm)平行插入頸部迷走交感神經(jīng)干，間距2～3 mm，通過Grass刺激儀(S88X，Astro-Med Inc.，Warwick，RI，USA)高頻電刺激迷走神經(jīng)干(high-frequency stimulation，HFS；20 Hz，間隔0.1 ms，方波)進(jìn)行迷走刺激(vagal nerve stimulation，VNS)，產(chǎn)生效應(yīng)。為避免神經(jīng)干燥，給予液體石蠟浸潤。能延緩竇性心率的VNS最低電壓值即被定義為閾值，選擇高于閾值、引起竇性心率下降50%或者出現(xiàn)二度房室傳導(dǎo)阻滯的電壓為刺激電壓，所需的電壓范圍為2.0～3.5 V，稱為閾上迷走神經(jīng)刺激。

1.2.3 馬松染色(MASSON染色)、糖原染色(PAS染色)心房肌形態(tài)學(xué)觀察 取冷鹽水沖洗各部位標(biāo)本。分別取GroupI和GroupII左、右心房肌組織進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)觀察，組織(1 mm×3～5 mm)用4%多聚甲醛液體固定，經(jīng)過石蠟包埋切片，室溫下放置備用。切片常規(guī)脫蠟，行MASSON和PAS染色。

1.2.4 免疫組化法半定量檢測右上神經(jīng)節(jié)(anterior right ganglionated plexi，ARGP)中酪氨酸羥化酶(Tyrosine hydroxylase，TH)、膽堿乙酰轉(zhuǎn)氨酶(Choline acetyl transaminase，CHAT)的表達(dá) 一抗孵育：滴加多克隆抗體50 μL，4℃冰箱過液，次日晨37℃復(fù)溫30 min。PBS沖洗3次，每次3 min；二抗孵育：滴加兔二步法檢測盒二抗工作液50 μL，37℃孵育20 min，PBS沖洗3次，每次3 min；DAB顯色5～10 min，在顯微鏡下掌握染色程度；蘇木素復(fù)染5 min，鹽酸乙醇中分化，自來水沖洗15 min。脫水，透明，封片，鏡檢。

本實(shí)驗(yàn)選用計(jì)算機(jī)輔助形態(tài)計(jì)量分析系統(tǒng)(Image-Pro Plus 6.0)測定密度，計(jì)算機(jī)自動識別顯色后的自主神經(jīng)，并計(jì)算出顯色神經(jīng)的像素面積，神經(jīng)密度定義為神經(jīng)的面積除以總的檢測面積(μm2/mm2)。每張切片于40倍目鏡下觀察，并選取神經(jīng)密度最大的3個(gè)視野，其平均值為每張切片的神經(jīng)密度[6]。

2 結(jié)果

2.1模型制作完成情況在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，動物血氧飽和度持續(xù)維持在95%以上、血壓平穩(wěn)，未出現(xiàn)因快速起搏造成的心力衰竭征象。起搏6 h后，2組制作犬急性房顫模型成功率可達(dá)到100%。

2.2電重構(gòu)指標(biāo)在不同房顫模型中的變化水平

2.2.1 心房肌單相動作電位變化 GroupI與GroupII左、右心房肌MAP變化的組間比較顯示， 隨著起搏時(shí)間的延長，MAP形態(tài)變化明顯，振幅減小、時(shí)限縮短，誘發(fā)房顫時(shí)心動周期不規(guī)則，MAP呈現(xiàn)多形性，連續(xù)的MAP間舒張間期消失，且2組APD90比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

2.2.2 左右房區(qū)域房顫誘發(fā)率的比較 2組組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。組內(nèi)比較可見，各組隨著電重構(gòu)時(shí)間的延長，左、右心耳房顫誘發(fā)率和基線水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，每小時(shí)末誘發(fā)率顯著增加，2組均在6 h誘發(fā)率達(dá)到最高。其中，GroupII左心耳AF誘發(fā)率在6 h達(dá)到100%(表2)。

表1 左右心房肌MAP(APD90)的比較

注：與基線比較，*P<0.05。

表2 房顫誘發(fā)率的比較/%

注：與基線比較，*P<0.05。

2.3結(jié)構(gòu)重構(gòu)指標(biāo)在不同房顫模型中的變化水平

2.3.1 馬松染色(MASSON染色)的比較 MASSON染色顯示左、右心房均可見膠原纖維呈現(xiàn)藍(lán)色，心肌纖維呈現(xiàn)紅色，膠原纖維相互連接成網(wǎng)狀。2組均可見膠原纖維分布紊亂，心肌束被膠原纖維包繞分隔。但是組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2組左心房分別為(24.60±2.47)×1 000 μm2/mm2和(22.54±5.21)×1 000 μm2/mm2；2組右心房分別為(26.34±3.12)×1 000 μm2/mm2和(27.55±4.63)×1 000 μm2/mm2(圖1)。

A： GroupI左心房MASSON染色 B：GroupII左心房MASSON染色，均可見膠原纖維分布紊亂，心肌束被膠原纖維包繞分隔

圖12組左心房肌MASSON染色觀察

2.3.2 PAS染色的比較 PAS染色顯示2組左心房心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，被少量的間質(zhì)組織包繞；細(xì)胞核大而清晰，但2組心肌細(xì)胞均有糖原異常累積聚集，累積糖原顯示為紫紅色聚集。2組左心房分別為(35.42±5.26)×1 000 μm2/mm2和(41.25±4.32)×1 000 μm2/mm2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；2組右心房分別為(29.34±6.18)×1 000 μm2/mm2和(36.25±4.67)×1 000 μm2/mm2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。

圖2 左、右心房肌PAS染色

2.4神經(jīng)重構(gòu)指標(biāo)在不同房顫模型中的變化水平心外膜神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)在房顫起源和維持中擔(dān)任重要角色，神經(jīng)節(jié)叢為重要組成部分，本實(shí)驗(yàn)選取ARGP進(jìn)行TH和CHAT的免疫組化染色，半定量對比不同情況下蛋白表達(dá)的區(qū)別。免疫組化顯示神經(jīng)節(jié)中數(shù)個(gè)陽性細(xì)胞呈深棕色，形狀不一，核呈藍(lán)染。2組心外膜神經(jīng)節(jié)叢均顯示了以CHAT染色為主的特點(diǎn)，且膽堿能和腎上腺素能神經(jīng)元共存。2組ARGP中TH分別為(10.85±3.24)×1 000 μm2/mm2和(25.63±1.20)×1 000 μm2/mm2,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2組ARGP中CHAT分別為(33.36±5.24)×1 000 μm2/mm2和(72.35±4.65)×1 000 μm2/mm2,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。

圖3 ARGP中TH、CHAT的表達(dá)

3 討論

本研究中RAP引起的電生理變化和人類房顫及其他動物房顫模型的電生理改變一致。RAP模型很適合被應(yīng)用于研究房顫的發(fā)生和相關(guān)電生理、分子生物學(xué)等機(jī)制。大量實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，與臨床房顫接近，房顫誘發(fā)率高，制作簡單可靠的動物模型是RAP模型[8]。但是，本研究在迷走神經(jīng)興奮可誘發(fā)房顫的理論依據(jù)下，通過頸部迷走神經(jīng)干閾上刺激加心房不同部位快速心房起搏的方法成功制作了閾上迷走神經(jīng)刺激介導(dǎo)的犬急性房顫模型。結(jié)果檢測心房組織各項(xiàng)電生理指標(biāo)可見代表電重構(gòu)的電生理指標(biāo)MAP縮短明顯，提示迷走神經(jīng)介導(dǎo)的急性房顫模型電重構(gòu)更加容易發(fā)生；檢測心房組織結(jié)構(gòu)重構(gòu)的心肌纖維化指標(biāo)中，既往研究對于犬房顫模型中結(jié)構(gòu)重構(gòu)的研究是有限的，只有少數(shù)研究提及在犬房顫模型制作1周后代表心房組織學(xué)的心房纖維化并無明顯改變[9-10]。這和本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致，雖然MASSON染色片未見心肌膠原纖維表達(dá)有差異，但是心房組織糖原染色中提示迷走神經(jīng)刺激狀態(tài)下糖原累計(jì)更加嚴(yán)重，說明早期急性房顫模型中結(jié)構(gòu)重構(gòu)雖然沒有發(fā)生，但是糖原累積這一特異性標(biāo)志改變已經(jīng)開始。檢測心外膜神經(jīng)節(jié)叢代表自主神經(jīng)重構(gòu)的TH、CHAT表達(dá)可見，疊加迷走神經(jīng)刺激的心外膜神經(jīng)節(jié)叢TH、CHAT表達(dá)均上調(diào)，并且同一神經(jīng)節(jié)叢中以CHAT表達(dá)為主?？偠灾?，閾上迷走神經(jīng)刺激介導(dǎo)急性房顫模型的成功主要建立在形成電重構(gòu)和自主神經(jīng)重構(gòu)基礎(chǔ)之上。

與既往實(shí)驗(yàn)研究相比，本實(shí)驗(yàn)還顯示，經(jīng)典的RAP模型制作不僅是在長時(shí)間后才能逐漸出現(xiàn)誘發(fā)房顫的現(xiàn)象，而且雖然在6 h達(dá)到頂峰，但房顫誘發(fā)率也沒有超過50%；給予閾上迷走神經(jīng)刺激的房顫模型組，顯示出從基礎(chǔ)值開始，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均易于誘發(fā)房顫，于6 h到達(dá)頂峰，所有部位房顫誘發(fā)率>60%，左心耳區(qū)域可達(dá)到100%誘發(fā)。故本研究還顯示出在RAP基礎(chǔ)上疊加閾上迷走神經(jīng)刺激，更加易于成功構(gòu)建犬房顫模型。對于需要制作周期短、模型穩(wěn)定、成功率高的動物模型，選擇VNS+RAP將更為適合。

國內(nèi)外研究者探究各種模型房顫發(fā)生、維持和終止可能的機(jī)制[11-15]，但是臨床上房顫的發(fā)生機(jī)制不應(yīng)是單一的，不能用一種房顫模型模擬出臨床上種類眾多的房顫。我們可對不同房顫模型進(jìn)行關(guān)于房顫共性的研究，同時(shí)也可對相應(yīng)原因的房顫作一些個(gè)性的研究。隨著實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⒊先梭w病理生理學(xué)方向的發(fā)展，以及新的房顫致病基因的發(fā)現(xiàn)，我們對房顫機(jī)制的認(rèn)知必定大大改進(jìn)，從而可能有更有效的治療策略應(yīng)用于臨床。

本模型制作方法相對簡單，房顫誘發(fā)率高、重復(fù)性好、持續(xù)時(shí)間長，病理生理基礎(chǔ)與臨床狀況較為相似，一次實(shí)驗(yàn)即可完成模型制作，同時(shí)也為研究迷走神經(jīng)在房顫發(fā)病及治療中的地位和作用提供了重要的研究基礎(chǔ)。