李彥瑋，王 偉，梅少帥，滕 飛，陳 東

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院病理科，北京 100029

心血管疾病是我國(guó)城鄉(xiāng)居民死亡的首位病因，高于腫瘤及其他疾病[1]。隨著人口老齡化及城鎮(zhèn)化進(jìn)程的加速，今后10年心血管病患病人數(shù)仍將快速增長(zhǎng)[2]，已成為當(dāng)前重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題。然而，有關(guān)心血管疾病病理改變方面的研究，尤其是針對(duì)組織成分改變量化的大宗病例研究，目前比較少見(jiàn)，這跟各大醫(yī)院心血管病例標(biāo)本量偏少有一定關(guān)系。HE作為觀察鏡下改變最基本的一種染色方法，難以有針對(duì)性地顯示細(xì)胞成分的改變。Verhoeff-Van Gieson、AB/PAS和Masson 3種特殊染色技術(shù)主要著染細(xì)胞中彈力纖維、黏液、膠原纖維成分，能夠直觀而準(zhǔn)確地展示出這些細(xì)胞成分的數(shù)量及形態(tài)改變。本研究聯(lián)合病理實(shí)驗(yàn)室常用的Verhoeff-Van Gieson、AB/PAS和Masson特殊染色技術(shù)，觀測(cè)了999例血管壁疾病標(biāo)本中彈力纖維、膠原纖維及黏液等的變化情況，并對(duì)血管壁的微觀改變做出了半定量分析，以期評(píng)估聯(lián)合特殊染色技術(shù)在觀察血管疾病病理改變中的應(yīng)用價(jià)值，并為心血管疾病病理發(fā)生機(jī)制的研究提供組織形態(tài)學(xué)依據(jù)。

材料和方法

標(biāo)本來(lái)源2014年1月至2017年9月在北京安貞醫(yī)院病理科接收的心血管疾病標(biāo)本。入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)病歷資料完整；(2)疾病診斷明確。排除標(biāo)準(zhǔn)：年齡小于18歲的病例。共有999 例入選，其中，男814 例，女185 例，中位年齡51.0 歲(18～83 歲)，平均發(fā)病年齡(49.7±9.6)歲；選取無(wú)心血管疾病的尸檢血管壁作為對(duì)照。所有標(biāo)本取材前均經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)石蠟切片4 μm。本研究經(jīng)北京安貞醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，標(biāo)本采集均獲得患者本人或家屬的知情同意，并簽署知情同意書(shū)。

材料SAKURA VIP5 Tissue-Tek組織脫水機(jī)(美國(guó)SAKURA公司)，Leica ST5020多功能染色機(jī)(德國(guó)Leica公司)，HE染色試劑(哈爾濱格林標(biāo)本技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)，Verhoeff-Van Gieson、AB/PAS、Masson染色試劑盒(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)。

染色所有標(biāo)本行常規(guī)HE染色[3]。

Verhoeff-Van Gieson染色：切片常規(guī)脫蠟至水；鐵蘇木素染色20 min；三氯化鐵分化15 s，鏡下觀察彈力纖維染色清晰，蒸餾水沖洗；VG染液染色1 min，蒸餾水沖洗；95%乙醇急速分化，蒸餾水沖洗；梯度乙醇脫水，透明，封片。

AB-PAS染色：切片常規(guī)脫蠟至水；3%醋酸水溶液處理1 min；1%阿爾新藍(lán)染液(pH值為2.5)染色10 min，蒸餾水沖洗；1%過(guò)碘酸氧化10 min，蒸餾水沖洗；schiff試劑染色15 min，蒸餾水沖洗；梯度乙醇脫水，透明，封片。

Masson染色：切片常規(guī)脫蠟至水；麗春紅酸性品紅染液染色5 min，蒸餾水沖洗；磷鉬酸溶液處理5 min，鏡下觀察肌纖維著色，呈淡紅色時(shí)直接傾掉磷鉬酸；苯胺藍(lán)染液復(fù)染3 min，傾掉染液；1%冰醋酸沖洗切片，至藍(lán)色不再分化為止；梯度乙醇脫水，透明，封片。

特殊染色評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合2016年美國(guó)心血管病理學(xué)學(xué)會(huì)及歐洲心血管病理學(xué)協(xié)會(huì)提出的共識(shí)[4]，全面評(píng)價(jià)血管壁內(nèi)膜、中膜和外膜3層結(jié)構(gòu)發(fā)生的病理改變。鏡下分別觀察HE染色及聯(lián)合彈力/VG、AB/PAS、Masson特殊染色結(jié)果，根據(jù)以下5個(gè)方面評(píng)分：(1)內(nèi)膜纖維性增厚；(2)平滑肌細(xì)胞核缺失；(3)彈力纖維斷裂、減少；(4)黏液樣細(xì)胞外基質(zhì)聚集；(5)外膜炎細(xì)胞浸潤(rùn)進(jìn)行評(píng)分；每項(xiàng)得1 分，共5 分。由兩位病理醫(yī)師對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行評(píng)分，并計(jì)算平均值。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，染色評(píng)分結(jié)果以M(Q1，Q3)表示，組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

鏡下觀察HE染色鏡下僅觀察到少量彈力纖維斷裂；聯(lián)合Verhoeff-Van Gieson、AB/PAS和Masson特殊染色可觀察到病變血管壁中膜的彈力纖維紊亂、斷裂、減少，黏液樣基質(zhì)細(xì)胞外聚集，外膜膠原纖維增生。隨著血管壁病變進(jìn)展，可見(jiàn)更多彈力纖維的斷裂和減少及膠原纖維增生(圖1～2)。研究選取的無(wú)心血管疾病的尸檢血管壁內(nèi)、中、外膜均未見(jiàn)異常。

染色評(píng)分結(jié)果血管壁組999例患者中，主動(dòng)脈竇瘤(aneurysm of sinus of valsalva，SVA)3 例，主動(dòng)脈根部瘤(aortic root aneurysm，ARA)177 例，胸主動(dòng)脈瘤(thoracic aortic aneurysm，TAA)78 例，腹主動(dòng)脈瘤(abdominal aortic aneurysm，AAA)17 例，全胸腹主動(dòng)脈瘤(total thoracoabdominal aortic aneurysm，tTAAA)32 例，主動(dòng)脈夾層(aortic dissection，AD)692 例；其中，AD的聯(lián)合特殊染色中位評(píng)分最高[3.7(3.5，3.8)分]，TAA最低[2.7(2.9，3.0)分]；SVA(Z=3.857，P=0.040)、ARA(Z=14.307，P=0.000)、TAA(Z=26.939，P=0.000)、AAA(Z=22.412，P=0.000)、tTAAA(Z=15.926，P=0.000)和AD組(Z=39.213，P=0.000)的聯(lián)合特殊染色中位評(píng)分均明顯高于HE染色(表1)。

討 論

在常規(guī)病理工作中，HE是觀察疾病鏡下改變最基本的一種染色方法。然而，這種染色一般僅能顯示細(xì)胞核和細(xì)胞漿的結(jié)構(gòu)，難以對(duì)細(xì)胞成分做出特異性的顯示。Verhoeff-Van Gieson、AB/PAS和Masson 3種特殊染色技術(shù)，主要著染細(xì)胞中彈力纖維、黏液、膠原纖維成分，能夠直觀而準(zhǔn)確地顯示出這些細(xì)胞成分的數(shù)量及形態(tài)改變。

心血管系統(tǒng)的大動(dòng)脈分為3層：內(nèi)膜由內(nèi)皮、內(nèi)皮下層構(gòu)成；中膜的主要結(jié)構(gòu)是彈力纖維和膠原纖維[5]，有40～70層彈性膜，彈力纖維是維持主動(dòng)脈軸向回縮力的主要成分；外膜較薄。本研究選取了6種類型動(dòng)脈瘤的病例，病理結(jié)果發(fā)現(xiàn)均有不同程度的內(nèi)膜纖維性增厚，中膜彈力纖維減少、變平、斷裂，平滑肌細(xì)胞核缺失，排列紊亂，黏液樣細(xì)胞外基質(zhì)聚集及外膜炎細(xì)胞浸潤(rùn)。按照內(nèi)膜纖維性增厚、平滑肌細(xì)胞排列紊亂、彈力纖維斷裂、減少、黏液樣細(xì)胞外基質(zhì)聚集及外膜炎細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分，AD評(píng)分最高，TAA評(píng)分最低；6種類型動(dòng)脈瘤病例聯(lián)合特殊染色的染色評(píng)分均明顯高于HE染色，提示聯(lián)合特殊染色技術(shù)確實(shí)較HE染色能夠更好地評(píng)價(jià)血管壁中3層結(jié)構(gòu)的病理改變。

A.HE；B. Verhoeff-Van Gieson染色，彈力纖維顯示黑色，膠原纖維顯示紅色；C. AB/PAS染色，酸性黏液顯示藍(lán)色，中性黏液顯示紅色；D. Masson染色，肌纖維顯示紅色，膠原纖維顯示藍(lán)色

A.HE；B. Verhoeff-Van Gieson：black for elastic fibers and red for collagens；C.AB/PAS：blue for acid mucus and red for neutral mucus；D. Masson：red for muscle fibers and blue for collagens

圖1主動(dòng)脈根部瘤

Fig1Aortic root aneurysm

A.HE；B. Verhoeff-Van Gieson染色，彈力纖維顯示黑色，膠原纖維顯示紅色；C. AB/PAS染色，酸性黏液顯示藍(lán)色，中性黏液顯示紅色；D. Masson染色，肌纖維顯示紅色，膠原纖維顯示藍(lán)色

A.HE；B.Verhoeff-Van Gieson：black for elastic fibers and red for collagens；C.AB/PAS：blue for acid mucus and red for neutral mucus；D. Masson：red for muscle fibers and blue for collagens

圖2主動(dòng)脈夾層

Fig2Aortic dissection

表 1 HE染色與聯(lián)合特殊染色評(píng)分的比較Table 1 Comparison of scores between HE stain and combined special staining

SVA：主動(dòng)脈竇瘤；ARA：主動(dòng)脈根部瘤；TAA：胸主動(dòng)脈瘤；AAA：腹主動(dòng)脈瘤；tTAAA：全胸腹主動(dòng)脈瘤；AD：主動(dòng)脈夾層

SVA：aneurysm of sinus of valsalva；ARA：aortic root aneurysm；TAA：thoracic aortic aneurysm；AAA：abdominal aortic aneurysm；tTAAA：total thoracoabdominal aortic aneurysm；AD：aortic dissection

本研究還選取了無(wú)心血管疾病的尸檢血管壁組織作為對(duì)照，鏡檢結(jié)果顯示血管壁內(nèi)、中、外膜均未見(jiàn)異常。通過(guò)對(duì)比聯(lián)合特殊染色及HE染色結(jié)果，發(fā)現(xiàn)病變的血管壁組織，其內(nèi)膜發(fā)生不同程度的纖維化，中膜常有彈力纖維的斷裂、消失以及平滑肌細(xì)胞核缺失等，外膜可有不同程度的炎細(xì)胞浸潤(rùn)。有報(bào)道認(rèn)為，血管壁組織中彈力纖維斷裂、排列紊亂，膠原纖維、平滑肌細(xì)胞含量改變與動(dòng)脈管壁的重塑有關(guān)[6- 7]。動(dòng)脈壁的中膜層，膠原纖維和平滑肌細(xì)胞排列的變化參與了主動(dòng)脈夾層的形成[8]。由于彈力纖維的斷裂與減少，可以導(dǎo)致血管中膜的順應(yīng)力下降，從而引起血管壁事件的發(fā)生。本研究結(jié)果與以往報(bào)道一致。

綜上，本研究結(jié)果顯示，使用Verhoeff-Van Gieson、AB/PAS和Masson聯(lián)合特殊染色技術(shù)能更好地觀察血管壁病變中彈力纖維、膠原纖維及黏液等成分的病理改變，可應(yīng)用于血管壁病變的觀測(cè)。

[1] 國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì).中國(guó)衛(wèi)生和計(jì)劃生育統(tǒng)計(jì)年鑒2016[M].北京：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，2016：295- 323.

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