張?zhí)焖?，董憲喆，馮 霞，朱維煜，胡 園，劉 屏（．解放軍總醫(yī)院臨床藥理藥學(xué)研究室，北京 0085；2.北京中醫(yī)藥

大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100029；3．總參第六十一研究所門診部，北京 100041）

抑郁癥是以顯著而持久的心境低落為主要特征的心境障礙類型，據(jù)世界衛(wèi)生組織最新數(shù)據(jù)顯示，全世界抑郁癥患病率約為11%[1]。從情緒消沉到出現(xiàn)幻覺，甚至可能會影響患者行為，導(dǎo)致自殺傾向。抑郁癥具有發(fā)病率高、易被患者忽視、易復(fù)發(fā)、逐漸低齡化等特點，其對患者的危害性逐漸增大，不容忽視。

定志小丸始載于唐代孫思邈所著的《備急千金要方》，由人參、茯苓、遠(yuǎn)志、菖蒲按照3 : 3 : 2 : 2的配比組成，主治“心氣不定，五臟不足，甚者憂愁悲傷不樂，忽忽喜忘，朝愈暮劇，或暮愈朝發(fā)狂?！薄６ㄖ拘⊥柚髦沃橹绢惣膊〉拿枋龇衔麽t(yī)中抑郁癥持續(xù)性心境低落，思維緩慢，興趣感缺乏等心境障礙的表現(xiàn)。已有研究發(fā)現(xiàn)，定志小丸可顯著增加抑郁動物海馬中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）的含量，改善慢性不可預(yù)知性應(yīng)激大鼠模型（chronic unpredictable mild stress，CUMS）的抑郁樣行為，升高大鼠腦內(nèi)5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）水平，具有明顯的抗抑郁作用[2-4]。

本研究于前期研究基礎(chǔ)上[5-6]，建立過氧化氫損傷的SH-SY5Y細(xì)胞、C6細(xì)胞和大鼠原代海馬神經(jīng)細(xì)胞三種細(xì)胞損傷模型，觀察實驗組、模型組和不同濃度定志小丸組的MDA、ROS、SOD、CAT相關(guān)氧化應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)的變化，研究定志小丸的抗氧化作用。同時根據(jù)Willner的方法[7]建立CUMS模型，觀察定志小丸灌胃前后大鼠海馬內(nèi)5-HT水平，結(jié)合大鼠海馬和血清中氧化應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)SOD和MDA的活性，研究定志小丸對動物腦內(nèi)氧化應(yīng)激水平及與5-HT系統(tǒng)的作用，探討定志小丸對5-HT系統(tǒng)和氧化應(yīng)激系統(tǒng)的調(diào)控機(jī)制，為進(jìn)一步研究定志小丸抗氧化作用機(jī)制提供一定的基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 細(xì)胞株

SH-SY5Y細(xì)胞株（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所畢明剛教授惠贈）；C6細(xì)胞株（購置于南京凱基生物技術(shù)有限公司）。

1.2 實驗動物

新生48 h內(nèi)SD大鼠30只及40只180 ～ 220 g健康雄性SPF級SD大鼠（由解放軍總醫(yī)院實驗動物中心提供）。實驗動物質(zhì)量合格證號：SCXX（京）2011-0004，飼養(yǎng)于無特定病原體（specific pathogen free，SPF）環(huán)境中。

1.3 實驗儀器

MCO-15AC型CO2培養(yǎng)箱（Sanyo公司）；XD-101型倒置顯微鏡（Olympus公司）；超凈工作臺（江蘇吳縣市凈化技術(shù)研究所）；HY-2A數(shù)顯調(diào)速多用振蕩器（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；SE1501F電子天平（奧豪斯儀器有限公司）；Anymaze動物行為學(xué)視頻分析系統(tǒng)（上海軟隆科技發(fā)展有限公司）。

1.4 主要試劑

人參、遠(yuǎn)志、茯苓、石菖蒲（北京同仁堂藥材有限責(zé)任公司）；定志小丸提取物0.21 g干粉/g生藥（中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所制劑中心提供，批號20160930）；鹽酸氟西汀膠囊（規(guī)格：20 mg，批號：7322B，法國PATHEON公司）；DMEM（GIBCO公司）；胎牛血清（GIBCO公司）；胰蛋白酶（Hyclone公司）；NaHCO3分析純、多聚賴氨酸（Sigma公司）；5-HT檢測試劑盒（上海藍(lán)基生物科技有限公司）；CAT測試盒、MDA測試盒、SOD測試盒、ROS測試盒（南京建成生物工程研究所）。

2 方法

2.1 過氧化氫損傷細(xì)胞模型的建立

用DMEM培養(yǎng)液分別調(diào)整SY5Y細(xì)胞和C6細(xì)胞密度為1×105個·mL-1，以80 μL/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，模型組和對照組加入10 μL蒸餾水，4個定志小丸組分別加入10 μL的不同濃度（10 μg·mL-1，100 μg·mL-1，200 μg·mL-1，500 μg·mL-1）定志小丸液，再加入含10 μL濃度為100 μmol·L-1過氧化氫損傷劑，36 h后終止培養(yǎng)，每組設(shè)5個復(fù)孔；將96孔板中的大鼠原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞做相似處理。

2.2 慢性不可預(yù)知性應(yīng)激大鼠模型的建立

SD大鼠適應(yīng)環(huán)境3 d后采用體重、曠場和糖水偏嗜度綜合評分。選取評分相近的大鼠隨機(jī)分組，每組8只。將40只SD大鼠分為5組，即正常組、模型組、氟西汀組（4 mg·mL-1）、定志小丸低劑量組（150 mg·mL-1）、定志小丸中劑量組（300 mg·mL-1）和定志小丸高劑量組（600 mg·mL-1）。除正常組每籠4只飼養(yǎng), 不給予任何刺激外，其余各組均每籠1只孤養(yǎng)，每天給予不同刺激，包括45度角傾斜12 h，冷水（10 ℃）游泳5 min，禁食24 h，震蕩5 min，照明24 h，束縛2 h，禁水24 h，順序隨機(jī)。刺激28 d后評價各組大鼠曠場得分和糖水偏嗜度，除正常組外其余各組繼續(xù)刺激，同時各給藥組連續(xù)灌胃給藥28 d，按5 mL·kg-1大鼠的體積給藥，正常組和模型組給予同等體積的蒸餾水。末次給藥后檢測糖水偏嗜度和曠場得分。

2.3 糖水偏嗜度測試

造模前后和給藥后第1天測試各組大鼠1%蔗糖水消耗量。測試前給予每只大鼠兩瓶糖水適應(yīng)24 h，然后把兩瓶糖水換成兩瓶自來水適應(yīng)24 h，禁水12 h后，給予每只大鼠一瓶糖水和一瓶自來水，測定每只大鼠1 h的1%蔗糖水?dāng)z入百分比，即1%蔗糖水?dāng)z入百分比=糖水消耗量/（糖水消耗量+自來水消耗量）×100%。

2.4 Open-f i led法測試

實驗裝置為立方形敞箱，高40 cm，長寬均為80 cm，周壁、底面為黑色，底面由面積相等的25個方塊組成，用白線劃分。實驗時將大鼠置于敞箱右上方方格內(nèi)，觀察大鼠在5 min內(nèi)穿越底面塊數(shù)（四爪均進(jìn)入的方格方可記數(shù)）的水平活動（crossing）得分，以及后肢直立次數(shù)（兩前爪騰空或攀附墻壁）的垂直活動（rearing）得分，二者之和為總得分。

2.5 MDA、ROS、SOD、CAT、5-HT測定

將給藥后的大鼠用10%的水合氯醛麻醉后，腹主動脈取血分離出血清，并斷頭取腦剝離出海馬，精密稱重，按重量（g）：體積（mL）=1 : 9的比例加入9倍體積生理鹽水，剪碎組織，冰水浴制備勻漿，3000 r·min-1離心10 min，取上清待用。

將培養(yǎng)好的細(xì)胞收集到EP管中，1000 r·min-1離心10 min棄上清，留沉淀細(xì)胞，再加入1 mL PBS輕輕吹打，再次以相同條件離心棄上清，留沉淀細(xì)胞加入一定量（106的細(xì)胞一般加0.3 ～ 0.5 mL）的生理鹽水，用超聲破碎儀，功率300 W，冰水浴，每3 ～ 5 s超聲一次，間隔4次（每次間隔時間為30 s左右）。

上述樣品準(zhǔn)備好后，按照試劑盒說明書的步驟，用比色法檢測SOD活性、MDA含量、ROS含量、CAT活性，用ELISA法檢測5-HT含量。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 定志小丸對CUMS大鼠行為學(xué)的影響

連續(xù)灌胃給藥4周后，與正常組相比，模型組大鼠的體重、曠場總得分及糖水偏嗜度明顯下降（P＜0.01）。與模型組相比，氟西汀組、定志小丸中劑量及高劑量組大鼠的體重、曠場總得分及糖水偏嗜度顯著增加（P＜ 0.01）；定志小丸低劑量組大鼠的體重也明顯增加（P＜ 0.01），但曠場總得分和糖水偏嗜度無明顯變化。詳見表1、2、3。

表1 各組大鼠體重變化. g, n = 8Tab 1 Results of body weight in each group. g, n = 8

表2 各組大鼠曠場得分變化. n = 8Tab 2 Results of open-f i eld test in each group. n = 8

3.2 定志小丸對大鼠海馬區(qū)5-HT水平的影響

連續(xù)灌胃給藥4周后，與正常組相比，模型組大鼠海馬內(nèi)5-HT水平顯著下降（P＜ 0.01）；與模型組相比，氟西汀組、定志小丸中劑量組和高劑量組大鼠海馬內(nèi)5-HT水平顯著升高（P＜ 0.01），定志小丸低劑量組沒有明顯變化。詳見表4。

3.3 定志小丸對大鼠海馬區(qū)及血清中MDA和SOD活性的影響

連續(xù)灌胃4周后，與正常組相比，模型組大鼠血清和海馬中SOD顯著下降（P＜ 0.01），MDA顯著升高（P＜ 0.01）。與模型組相比，氟西汀組可顯著增加大鼠血清和海馬中SOD的活力（P＜ 0.05）；定志小丸中劑量組和高劑量組均能顯著增加大鼠血清和海馬中SOD的活力（P＜ 0.01），顯著降低MDA的含量（P＜0.01）；定志小丸低劑量組沒有明顯變化。詳見表5。

3.4 定志小丸對過氧化氫損傷細(xì)胞模型內(nèi)氧化還原系統(tǒng)的影響

實驗結(jié)果如表1所示，定志小丸組除10 μg·mL-1組（DZ-10組）外，定志小丸100 μg·mL-1組（DZ-100組）、定志小丸200 μg·mL-1組（DZ-200組）及定志小丸500 μg·mL-1組（DZ-500組）與模型組相比，SY5Y細(xì)胞和原代大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞中SOD和CAT的活性均顯著升高（P＜ 0.01或P＜ 0.05），同時ROS和MDA的含量均降低或顯著降低（P＜ 0.01或P＜ 0.05）；在C6細(xì)胞中，定志小丸（除10 μg·mL-1組）也可顯著升高SOD和CAT的活力（P＜ 0.01或P＜ 0.05），降低ROS和MDA的表達(dá)水平（P＜ 0.01或P＜ 0.05）。詳見表6。

表3 各組大鼠糖水偏嗜度變化. n = 8Tab 3 Results of sucrose preference in each group. n = 8

表4 大鼠海馬區(qū)5-HT的水平. ng·mL-1，n = 8Tab 4 The contents of 5-HT in the hippocampus of rats.ng·mL-1, n = 8

表5 大鼠海馬及血清中SOD和MDA的含量. n = 8Tab 5 The contents of SOD and MDA in the hippocampus and serum of rats. n = 8

4 討論

CUMS模型能較好地模擬臨床中抑郁人群的癥狀，是較為成熟的抑郁模型[8]。糖水偏嗜度體現(xiàn)了動物對獎賞的反應(yīng)程度，曠場水平活動反映動物的活動度，曠場垂直活動反映動物對新鮮環(huán)境的好奇程度，本實驗結(jié)果顯示，定志小丸中劑量組和高劑量組能明顯升高曠場得分和糖水偏嗜度，從而提高抑郁大鼠的自主運(yùn)動行為和對獎賞的反應(yīng)程度。

5-羥色胺學(xué)說是Coppen等[9]于1965年首先提出，認(rèn)為抑郁癥的發(fā)生是由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中5-HT功能下降，釋放5-HT減少，突觸間隙含量下降。選擇性5-HT再攝取抑制劑（如氟西?。┠芤种仆挥|間隙對5-HT的重吸收，使5-HT含量增高。本實驗結(jié)果表明，模型組大鼠海馬區(qū)5-HT含量明顯下降；給予定志小丸后，5-HT的含量顯著升高，表明定志小丸可以顯著促進(jìn)CUMS模型大鼠海馬中5-HT的表達(dá)。提示定志小丸可能是通過調(diào)節(jié)5-HT的含量起到一定的抗抑郁作用。

表6 定志小丸對過氧化氫損傷細(xì)胞模型內(nèi)氧化還原系統(tǒng)的影響Tab 6 Effects of Dingzhi Xiaowan on oxidation-reduction system in the cell model damaged by hydrogen peroxide

氧化應(yīng)激是指細(xì)胞暴露于高濃度氧分子或氧的化學(xué)衍生物而引起的細(xì)胞損傷。自由基作用于生物大分子，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致一系列疾病的發(fā)生發(fā)展[10]。

有研究[11-12]顯示，氧化應(yīng)激產(chǎn)生的自由基可能在抑郁癥的發(fā)病過程中起著重要作用。氧化應(yīng)激是指包括活性氧和活性氮對機(jī)體造成的氧化損傷。當(dāng)自由基產(chǎn)生過多或氧化-抗氧化系統(tǒng)出現(xiàn)故障時，未被清除的自由基在體內(nèi)積聚，對機(jī)體導(dǎo)致?lián)p害作用，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，破壞海馬區(qū)及大腦皮層細(xì)胞，引發(fā)海馬長時程突觸可塑性異常[13-16]，激活HPA軸，刺激糖皮質(zhì)激素釋放，提高機(jī)體對應(yīng)激的適應(yīng)性。長時間處于應(yīng)激狀態(tài)下，高水平的糖皮質(zhì)激素或?qū)p害海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞，造成HPA軸功能障礙[17]，進(jìn)而引發(fā)抑郁癥狀。Zafir等[18]報道，抑郁動物模型體內(nèi)的酶類抗氧化物包括SOD、CAT、GST等活性及非酶類抗氧化物包括谷胱甘肽、葡萄糖和尿素含量都明顯下降，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的含量明顯升高，而抗抑郁藥物如氟西汀可明顯逆轉(zhuǎn)這種改變。

本實驗結(jié)果表明，模型組大鼠海馬和血清的SOD活性明顯下降，MDA含量顯著升高，給予定志小丸后能明顯升高SOD水平，降低MDA含量。同時在過氧化氫誘導(dǎo)的多種細(xì)胞損傷模型中，定志小丸在100 ～500 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)也可升高SOD和CAT的水平，降低ROS和MDA的含量。5-HT的水平和氧化應(yīng)激反應(yīng)與抑郁癥關(guān)系密切，通過降低5-HT含量、抗氧化水平降低、氧自由基水平上調(diào)等途徑參與了抑郁癥的發(fā)病過程。有研究表明，ROS可以氧化損傷DNA，并且DNA損傷會升高細(xì)胞內(nèi)ROS水平，進(jìn)而引起氧化還原系統(tǒng)的失衡。5-HT系統(tǒng)產(chǎn)物褪黑素（melatonin，MT）可提高抗氧化酶活性，同時降低MDA水平，提高機(jī)體的抗氧化能力[19]。本實驗結(jié)果表明定志小丸不僅能改善由過氧化氫誘導(dǎo)的多種細(xì)胞損傷模型以及CUMS模型大鼠的氧化還原系統(tǒng)，還可調(diào)節(jié)CUMS大鼠海馬區(qū)5-HT的水平，說明定志小丸的抗抑郁機(jī)制可能與其抗氧化作用和調(diào)節(jié)5-HT水平有關(guān)。

[1] 景泉凱.電針對慢性應(yīng)激抑郁大鼠腦海馬磷酸二酯酶-4亞型表達(dá)的影響[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2017.

[2] Zhu Y, Duan X, Huang F,et al. Kai-Xin-San, a traditional Chinese medicine formula, induces neuronal differentiation of cultured PC12 cells: modulating neurotransmitter regulation enzymes and potentiating NGF inducing neurite outgrowth[J].J Ethnopharmacol, 2016, 193: 272-282.

[3] Hu Y, Zhou XJ, Liu P,et al. Antidepressant and neuroprotective effect of the Chinese herb kaixinsan against lentiviral shRNA knockdown brain-derived neurotrophic factor-induced injuryin vitroandin vivo[J]. Neuropsychobiology, 2014, 69(3): 129-139.

[4] Dong XZ, Li ZL, Zheng XL,et al. A representative for emotional disease, Ding-Zhi Xiao-Wan restores 5-HT system def i cit through interfering the synthesisand transshipment in chronic mild stressinduced depressive rats[J]. J Ethnopharmacol, 2013, 150(3):1053-1061.

[5] Hu Y, Liu M, Liu P,et al. Effect of kai xin san on learning and memory in a rat model of paradoxical sleep deprivation[J]. J Med Food, 2013, 16(4): 280-287.

[6] 劉婉婉，許璐，董憲喆，等.開心散類方對慢性應(yīng)激大鼠行為學(xué)及中樞單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響[J].中國中藥雜志，2015，40（11）：2180-2185.

[7] Willner P. Animal models as simulations of depression[J]. Trends Pharmacol Sci, 1991, 12(4): 131-136.

[8] 龔琳，邱彥，劉靜，等.知母總皂苷對血管性抑郁小鼠行為和腦組織病理學(xué)的影響[J].中國藥物應(yīng)用與監(jiān)測，2017，14（2）：88-92.

[9] Coppen A, Shaw DM, Malleson A. Changes in 5-hydroxytryptophan metabolism in depression[J]. Br J Psychiaty, 1965, 111(470): 105-107.

[10] 胡楚璇，林壯民，全佳，等.阿魏酸鈉對慢性不可預(yù)知溫和刺激抑郁癥大鼠抑郁行為的影響及其機(jī)制[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2017，37（17）：1697-1701.

[11] Herken H, Gurel A, Selek S,et al. Adenosine deaminase, nitric oxide, superoxide dismutase, and xanthine oxidase in patients with major depression: impact of antidepressant treatment[J].Arch Med Res, 2007, 38(2): 247-252.

[12] Maes M, Kubera M, Obuchowiczwa E,et al. Depression's multiple comorbidities explained by (neuro) inflammatoty and oxidative and nitrosative stress pathways[J]. Neuro Endocrinol Lett, 2011, 32(1): 7-24．

[13] 田桂琴，唐佳琦，徐鵬飛，等.丁苯酞對慢性應(yīng)激大鼠海馬組合氧化應(yīng)激及炎癥因子的影響[J].中國藥學(xué)，2017，15（4）：420-423.

[14] Drevets WC, Price JL, Furey ML. Brain structural and functional abnormalities in mood disorders: implications for neurocircuitry models of depression[J]. Brain Struct Funct, 2008, 213(1-2): 93-118.

[15] 吳磊，吳文，曾慶，等.腦卒中后抑郁患者前扣帶回、海馬灰質(zhì)體積磁共振成像研究[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2013，35（23）：2577-2581.

[16] Slavich GM, Irwin MR. From stress to inf l ammation and major depressive disorder: a social signal transduction theory of depression[J]. Psychol Bull, 2014, 140(3): 774-815.

[17] Aschbacher K, O'Donovan A, Wolkowitz OM,et al. Good stress,bad stress and oxidative stress: insights from anticipatory cortisol reactivity[J]. Psychoneuroendocrinology, 2013, 38(9): 1698-1708.

[18] Zaf i r A, Banu N. Antioxidant potential of fl uoxetine in comparison to Curcuma longa in restraint-stressed rats[J]. Eur J Pharmacol,2007, 572(1): 23-31.

[19] 王瓏，王實濤.抑郁癥氧化應(yīng)激發(fā)病機(jī)制及針刺治療研究進(jìn)展[J].針灸臨床雜志，2017，33（11）：76-80.