吳 瓊， 汪順貴， 郭雪峰， 李華瓊， 陳愛玲， 刁麗梅2，， 仇小強

癲癇(Epilepsy，EP)是由于大腦神經(jīng)元異常放電引起的短暫性中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，表現(xiàn)為突發(fā)意識喪失和全身強直抽搐。世界衛(wèi)生組織報告目前全世界約有5000萬癲癇患者，其中約90%患者來自發(fā)展中國家[1]。我國約有900萬癲癇患者，每年新發(fā)40～70萬例,對社會、家庭構(gòu)成了巨大的負擔(dān)[2]。生物信息學(xué)是近年來隨著計算機信息處理技術(shù)與人類基因組工程等生物醫(yī)學(xué)研究的快速進展而發(fā)展起來的新學(xué)科[3]，其中基因本體(Gene Ontology,GO)是一個系統(tǒng)化注釋基因及基因產(chǎn)物功能的規(guī)范化科學(xué)分類體系。京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)是一個整合了基因組、化學(xué)和系統(tǒng)功能信息的數(shù)據(jù)庫，把從已經(jīng)完整測序的基因組中得到的基因目錄與更高級別的細胞、物種和生態(tài)系統(tǒng)水平的系統(tǒng)功能關(guān)聯(lián)起來。生物信息學(xué)從基因芯片數(shù)據(jù)中挖掘有用信息,利用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫對結(jié)果進行歸納整理，系統(tǒng)分析海量基因數(shù)據(jù)中可能涉及的最為相關(guān)的生物學(xué)功能。本課題組采用基因芯片技術(shù)挖掘差異基因，并對差異基因進行生物信息學(xué)分析，研究其在癲癇中可能參與的調(diào)控機制，為下一步實驗研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性昆明小鼠100只，清潔級，約25～30 g。其中80只用于實驗，另外20只用于替換實驗中造模失敗的小鼠。昆明小鼠由廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心購買。

1.1.2 實驗試劑 氯化鋰(中國醫(yī)藥集團上海試劑公司)、鹽酸匹羅卡品(美國Sigma公司)、硫酸阿托品注射液(鄭州鈴銳制藥有限公司)、水合氯醛(青島宇龍海藻有限公司)、0.9%氯化鈉注射液(北京雙鶴藥業(yè)有限公司)、Agilent RNA 6000 Nano Kit(美國Agilent公司)、FlashTag Biotin HSR RNA Labeing Kit(美國Affymetrix公司)、GeneChip Hybridizatin Wash and Stain Kit(美國Affymetrix公司)、AxyPrep總RNA提取試劑盒(美國Axygent公司)、miRNAs RT-PCR Quantitation Kit(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及引物(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)，Mmu-miRNA-187引物序列：上游引物序列CTTCTTCGTGTCTTGTGTTGCAG，下游引物序列TATGGTTGTTCTCGACTCCTTCAC。內(nèi)參U6 snRNA引物序列:上游引物序列ATTGGAACGATACAGAGAAGATT，下游引物序列GGAACGCTTCACGAATTTG。

1.1.3 實驗儀器 Thremo Nanodrop 2000(美國 Thremo公司)、Aglient 2100 Bioanalyzer(美國Agilent公司)、GeneChip Hybridization Oven 645(美國Affymetrix公司)、GeneChip Fluidics Station 450(美國Affymetrix公司)、GeneChip Scanner 3000(美國Affymetrix公司)、GeneAmp PCR System 9700(美國 Applied Biosystems公司)、StepOnePlus Real-Time PCR System(美國 Applied Biosystems公司)。

1.1.4 靶基因預(yù)測工具 (1)TargetScan 7.1版在線預(yù)測網(wǎng)站，網(wǎng)址為http://www.targetscan.org/，是預(yù)測miRNA靶基因假陽性率較低的軟件,TargetScan通過搜索與每個miRNA的種子區(qū)域相匹配的保守8 mer，7 mer和6 mer位點的存在來預(yù)測miRNA的生物靶點[4];(2)miRBase在線預(yù)測網(wǎng)站，網(wǎng)址為http://mirdb.org/，可提供miRNA注釋、基因組坐標(biāo)以及預(yù)測和驗證的miRNA目標(biāo)位點數(shù)據(jù)庫，并可以按順序，關(guān)鍵字，參考文獻和組織表達搜索條目;(3)rna22在線預(yù)測工具，網(wǎng)址為https://cm.jefferson.edu/rna22/，由悉尼大學(xué)醫(yī)學(xué)院計算醫(yī)學(xué)中心創(chuàng)建，rna22提出一種鑒定miRNA結(jié)合位點及相應(yīng)異源雙鏈的方法進行miRNA靶基因的預(yù)測。

1.1.5 篩選靶基因的標(biāo)準(zhǔn) (1)miRNA5’端“種子序列”與靶基因3’端UTR序列的完全互補配對；(2)miRNA5’端結(jié)合的mRNA3’端UTR的位點數(shù)目；(3)miRNA與mRNA結(jié)合位點的不同類型；(4)miRNA與mRNA結(jié)合位點上下游堿基組成；(5)基于mRNA3’端UTR高度保守序列優(yōu)先排序等[5]。

1.1.6 GO分析和KEGG分析工具 DAVID 6.8版(The Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery)是一個在線綜合分析工具，網(wǎng)址https://david.ncifcrf.gov/。

1.2 方法

1.2.1 氯化鋰-匹羅卡品致癇小鼠模型制備 采用氯化鋰-匹羅卡品的化學(xué)點燃方法制作癲癇小鼠模型:昆明小鼠腹腔注射氯化鋰(127 mg/kg)，18～24 h后注射阿托品1 mg/kg，30 min后腹腔注射匹羅卡品(10 mg/kg)。如未出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)，則每隔 30 min 繼續(xù)腹腔注射匹羅卡品(10 mg/kg)，直至小鼠出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)后停止注射。待癲癇持續(xù)狀態(tài)出現(xiàn)60 min，腹腔注射10% 的水合氯醛(300 mg/kg)終止發(fā)作。每隔2 d，進行上述造模實驗一次，共進行5次，注射后觀察小鼠行為變化60 min，每次達Ⅳ級以上發(fā)作為成功的癲癇發(fā)作模型，3次未達到Ⅳ級以上發(fā)作的棄用。

1.2.2 實驗動物癲癇發(fā)作Racine分級[6]0級:無發(fā)作反應(yīng);Ⅰ級:節(jié)律性口角、耳或面部肌肉抽搐陣攣;Ⅱ級:點頭并伴隨更嚴(yán)重的面部肌肉抽動陣攣;Ⅲ級:出現(xiàn)前肢陣攣但不伴隨直立;Ⅳ級:雙側(cè)后肢表現(xiàn)為站立，雙側(cè)前肢表現(xiàn)為抽搐;Ⅴ級:四肢強直、抽搐、角弓反張。癲癇持續(xù)狀態(tài):出現(xiàn)連續(xù)Ⅵ級以上發(fā)作，時間超過 30 min。

1.2.3 實驗動物分組及干預(yù)措施 將制備成功的癲癇小鼠模型按隨機數(shù)字表法隨機分為4組：造模組 (A)、空白對照組(B)、造模組(C)、空白對照組(D)，每組各20只。(1)A組和B組取小鼠海馬組織用于基因芯片實驗，篩選癲癇組和空白對照組差異基因;(2)C組和D組取小鼠海馬組織用于q-PCR實驗，驗證基因芯片實驗中的差異基因的表達。

1.2.4 基因芯片實驗 (1)取30 mg小鼠海馬組織，采用Trizol法進行樣品的總RNA抽提純化，經(jīng)NanoDrop 2000儀器和Agilent Bioanalyzer 2100儀器質(zhì)檢;(2)將提取的總RNA,由RNA合成雙鏈cDNA，用FlashTag Biotin HSR RNA Labeing Kit試劑盒把熒光染料Cy5和Cy3接dUTP 上;(3)在GeneChip Hybridization Oven 645儀器中將已片段化的cRNA 在GeneChip Fluidics Station 450儀器中洗脫和染色探針陣列;(4)用GeneChip Scanner 3000掃描儀掃描雜交后芯片，然后提取數(shù)據(jù)進行計算。根據(jù)實驗設(shè)計的要求，篩選出有顯著差異的基因。

1.2.5 q-PCR實驗 (1)取30 mg小鼠海馬組織，采用Trizol法進行樣品的總RNA抽提，經(jīng)NanoDrop 2000和Agilent Bioanalyzer 2100質(zhì)檢;(2)取上步提取的總RNA加入miRNA-187和內(nèi)參基因U6引物混合物逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，并放入ABI GeneAmp PCR System 9700儀器進行逆轉(zhuǎn)錄,制備成cDNA;(3)取上步制備的cDNA 加入miRNA-187 Primer set 制成定量PCR反應(yīng)體系。同法制備內(nèi)參基因U6的定量PCR反應(yīng)體系。放入ABI StepOnePlus real-Time PCR System儀器中進行實時定量分析。

1.2.6 靶基因預(yù)測 采用靶基因預(yù)測工具TargetScan 7.1版在線預(yù)測軟件，miRBase在線預(yù)測網(wǎng)站、rna22在線預(yù)測工具。選擇物種為小鼠，輸入miRNA-187運行后導(dǎo)出靶基因預(yù)測結(jié)果，并把3個靶基因預(yù)測工具預(yù)測出的靶基因取交集。

1.2.7 GO分析和KEGG分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫，以小鼠基因組為背景對照，利用“Functional AnnotationChart” 功能模塊下的基因本體論對差異表達基因的分析，將差異表達基因按功能分為3大類:生物學(xué)過程、細胞組分和分子功能3類，并利用KEGG分析功能進行通路分析。

2 結(jié) 果

2.1 篩選出差異基因 根據(jù)實驗設(shè)計的要求，計算兩兩實驗樣本間的熒光訊號log2比值及P-value，篩選|FC|≥ 1.5。最終篩選出下調(diào)miRNA共18個:miRNA-193b、miRNA-187、miRNA-365、miRNA-125b、miRNA-543、miRNA-495、miRNA-6995、miRNA-383、miRNA-345、miRNA-1982、miRNA-31、miRNA-7668、miRNA-134、miRNA-193b、miRNA-6360、miRNA-431、miRNA-6540、miRNA-204，上調(diào)miRNA共10個：miRNA-669l、miRNA-468、miRNA-1946a、miRNA-7004、miRNA-5620、miRNA-1941、miRNA-3470a、miRNA-6933、miRNA-1946b、miRNA-466c。在此基礎(chǔ)上對差異表達miRNA進行聚類分析(見圖1)，每個小方格表示每個基因，其顏色表示該基因表達量大小，表達量越大顏色越深，紅色為上調(diào)，綠色為下調(diào)。

2.2 q-PCR驗證miRNA-187表達 通過查閱相關(guān)文獻及基因芯片的篩選結(jié)果[7～9]。本課題組選擇miRNA-187作為目標(biāo)基因，并運用q-PCR實驗驗證基因芯片miRNA-187表達，結(jié)果：癲癇造模組(C)中小鼠海馬組織的miRNA-187的相對表達量低于空白對照組(D)(P<0.05),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果表明miRNA-187的表達趨勢在基因芯片和q-PCR兩種檢測方法中表現(xiàn)出一致性,說明基因芯片數(shù)據(jù)具有生物學(xué)意義上的可重復(fù)性,結(jié)果是可信的(見圖2)。

2.3 miRNA-187靶基因預(yù)測結(jié)果 利用TargetScan預(yù)測靶基因4133個，miRBase在線預(yù)測網(wǎng)站預(yù)測靶基因251個、rna22在線預(yù)測工具預(yù)測靶基因6986個，對3種軟件預(yù)測出的靶基因取交集得到107個共同的靶基因。

2.4 miRNA-187靶基因GO分析結(jié)果 通過DAVID綜合分析工具進行GO富集分析，選取顯著差異的靶基因進行注釋(P< 0.05)，主要富集于19個基因功能，按生物學(xué)過程、細胞組分和分子功能3類基因功能分類(見表1)。

2.5 miRNA-187靶基因KEGG富集分析結(jié)果 KEGG通路分析顯示miRNA-187靶基因主要富集在在7條通路中(見表2)。

圖1 差異miRNA表達趨勢分析

造模組(C)與空白對照組(D)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義*P=0.02

圖2 造模組(C)和空白對照組(D)miRNA-187的表達量

表1 miRNA-187靶基因GO富集分析結(jié)果

表2 miRNA-187靶基因KEGG通路分析結(jié)果

3 討 論

通過對miRNA-187靶基因的功能注釋及GO富集，發(fā)現(xiàn)miRNA-187靶基因富集在與調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞突觸可塑性、神經(jīng)細胞軸突髓鞘形成等相關(guān)的基因功能上?，F(xiàn)有研究已表明[7,8]，神經(jīng)元細胞重塑、突觸聯(lián)系重建以及神經(jīng)膠質(zhì)纖維細胞增生可以導(dǎo)致異常興奮性突觸環(huán)路，引起癲癇反復(fù)發(fā)作。Haenisch等[9]研究也發(fā)現(xiàn)miRNA-187在大鼠癲癇模型的慢性期表達增加，通過介導(dǎo)KCNK10/TREK-2鉀離子通道在大鼠癲癇模型中發(fā)揮抑制神經(jīng)元異常放電的作用。miRNA-187所調(diào)控的靶基因富集與此相關(guān)，綜合GO分析的結(jié)果可以推測，miRNA-187可能是通過調(diào)控神經(jīng)細胞突觸可塑性、神經(jīng)細胞軸突髓鞘形成影響癲癇的發(fā)生發(fā)展過程。

在KEGG通路分析中提示miRNA-187靶基因富集于Wnt信號通路的包括：CSNK1A1、TBL1XR1、MAPK8、AXIN2、CTNNB1。Wnt 信號通路作為多細胞真核生物中的重要信號通路，不僅參與神經(jīng)干細胞的增殖、分化、軸突形成等過程，還調(diào)控突觸發(fā)生、突觸囊泡循環(huán)等生理過程。最近的一些研究發(fā)現(xiàn)，Wnt 的部分配體Wnt3a、GSK-3β在小鼠海馬神經(jīng)元的突觸可塑性方面發(fā)揮著一定作用[10,11]。Wnt7a參與成熟海馬神經(jīng)元的突觸囊泡循環(huán)和突觸傳遞過程[12]。Rubio等[13]研究發(fā)現(xiàn)電刺激點燃癲癇模型激活Wnt /β-catenin通路，Theilhaber等[14]觀察到在低氧性癲癇發(fā)作中Wnt/β-catenin通路基因的表達增加。Qu等[15]發(fā)現(xiàn)了Wnt3a /β-catenin信號通路作為異常神經(jīng)發(fā)生與海馬組織內(nèi)基礎(chǔ)重構(gòu)之間的聯(lián)系。Wnt信號通路中關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子β-catenin、Wnt3a和cyclin D1的表達水平在注射紅藻氨酸誘導(dǎo)的急性癲癇中上調(diào)，Wnt信號通路被激活，促進異常神經(jīng)發(fā)生。異常神經(jīng)發(fā)生會引起海馬硬化并伴隨大量神經(jīng)元丟失和嚴(yán)重神經(jīng)膠質(zhì)增生，引起顳葉癲癇。而通過敲減β-catenin阻斷由紅藻氨酸注射誘導(dǎo)的Wnt信號，可減弱的異常神經(jīng)發(fā)生，提示W(wǎng)nt/β-catenin信號通路可調(diào)控海馬神經(jīng)元發(fā)生，抑制海馬神經(jīng)元異常放電環(huán)路重塑，減少癲癇的發(fā)作。Huang等[16]研究發(fā)現(xiàn)由于Wnt/β-catenin通路的失調(diào)，在癲癇急性期海馬神經(jīng)發(fā)生顯著增加，而在癲癇的慢性階段神經(jīng)發(fā)生減少，Dkk-1、GSK-3b和β-catenin作為調(diào)節(jié)Wnt信號通路的關(guān)鍵，成為潛在研制治療癲癇活性的藥物的重要靶點。

越來越多的證據(jù)表明神經(jīng)炎癥在癲癇持續(xù)狀態(tài)的發(fā)病機制中起著關(guān)鍵作用。Srivastava等[17]通過Meta分析發(fā)現(xiàn)，在癲癇發(fā)生期間失調(diào)的miRNA的靶基因功能多富集在與神經(jīng)炎癥有關(guān)的分子過程。Alsharafi等[18]實驗發(fā)現(xiàn)miRNA-187在顳葉癲癇動物模型和慢性顳葉癲癇患者的海馬組織中顯著降低，miRNA-187的這種下降與IL-10的表達水平成反比，miRNA-187在潛伏期處于最高水平并且在IL-10最大的慢性期下降。在癲癇持續(xù)狀態(tài)后，使用miRNA-187的拮抗劑可抑制癲癇發(fā)作早期IL-10水平。Bot和Rossato等[19,20]研究顯示在癲癇動物模型中隨著癲癇的持續(xù)發(fā)作，炎癥反應(yīng)產(chǎn)生的IL-10增加，而miRNA-187的表達減少。癲癇發(fā)作后引起的不良的神經(jīng)重塑和神經(jīng)炎癥是癲癇慢性化的關(guān)鍵，miRNA通過調(diào)控干預(yù)神經(jīng)細胞相關(guān)炎癥因子，減少不良的神經(jīng)重塑和神經(jīng)炎癥發(fā)生，預(yù)防癲癇慢性發(fā)展[21]。

miRNA與其靶基因的研究分為生物信息學(xué)預(yù)測和試驗驗證兩部分?；诨蛐酒Y(jié)合生物信息學(xué)方法分析得到的與癲癇關(guān)系密切的基因功能信息，需要進一步實驗研究驗證,但本研究結(jié)果的部分內(nèi)容與已證實、已發(fā)表文獻相符,提示本研究獲得的通路及靶基因功能信息具有研究價值。課題組將在以后的研究中對本文預(yù)測出的與癲癇相關(guān)靶基因和通路進一步完善實驗研究。

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