張 旭，張 蕾，馬媛媛

(1、甘肅省獸藥飼料監(jiān)察所，蘭州 730030 2、蘭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，蘭州 730030)

山楂收錄于《中華人民共和國獸藥典》2015年版二部，是薔薇科山楂屬植物山里紅(CrataeguspinnatifidaBge.var.major N. E. Br.)或山楂(CrataeguspinnatifidaBge.)的干燥成熟果實，具有消食化積，行氣散瘀之功效[1]。另有山楂葉的記載，其葉片亦具有活血化瘀，理氣通脈、化濁降脂之功效[2]。山楂中含有黃酮類、有機酸類等多種成分[3-4]，不同樣品間各成分含量相差較大[5]。目前已從中分離得到了金絲桃苷、槲皮素、牡荊素、蘆丁等多種成分[6]。同時山楂也作為一種飼料添加劑廣泛應(yīng)用在畜牧業(yè)中，發(fā)揮著提高飼料蛋白質(zhì)、脂肪的消化率，降低飼料消耗，防治疾病，提高成活率，促進動物生長發(fā)育的作用[7]，從而提高經(jīng)濟效益。因此，山楂總黃酮的研究開發(fā)具有重要的經(jīng)濟和社會效益，山楂在獸藥飼料中的開發(fā)與利用應(yīng)備受關(guān)注。

在我國該屬植物種類繁多且分布廣泛，《甘肅中草藥資源志》[8]中記載的原植物有山楂、山里紅、甘肅山楂、華中山楂四種。試驗對甘肅山楂與山里紅果實和葉片中總黃酮的提取及含量測定方法進行了研究，以期為甘肅省該屬植物的綜合開發(fā)利用提供實驗基礎(chǔ)。

1 材 料

1.1 儀器 METTLER AE240電子天平，METTLER AE110電子天平，BX8200HP超聲波清洗器，Evolution 300 LC紫外-可見分光光度計，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，粉碎機。

1.2 試劑與藥材 氫氧化鈉，亞硝酸鈉，硝酸鋁，乙醇，均為分析純，純化水。蘆丁對照品(中國藥品生物制品檢定所提供，100080-200707)，山里紅果和葉藥材(購于蘭州黃河藥市)，甘肅山楂果和葉(采于榆中官灘溝)，以上兩種材料均由蘭州大學(xué)馬志剛教授鑒定，以山里紅為例進行方法驗證實驗。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮的含量測定

2.1.1 樣品與對照品溶液的制備 精密稱取山里紅果實粉末1.0 g，以20倍量60%乙醇回流1 h，抽濾，濾液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用60%乙醇定容至刻度，搖勻，即為樣品溶液。

精密稱取蘆丁對照品20.0 mg，置于50 mL容量瓶中，用乙醇溶解，超聲助溶，放冷，定容至刻度，搖勻，即為對照品溶液。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

2.1.2.1 測定最大吸收波長 將處理好的樣品溶液過濾，精密量取續(xù)濾液1 mL至25 mL容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min；加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min；加4%氫氧化鈉溶液10 mL，加乙醇定容至刻度，搖勻，進行顯色處理。放置15 min后，以乙醇為空白，在480～570 nm處進行掃描。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液亦按以上步驟進行顯色、掃描。由圖1可知，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液吸收曲線形狀相同，且均在507 nm處有最大吸收，故實驗選取507 nm作為測定波長。結(jié)果見圖1。

(1)蘆丁吸光光譜曲線; (2)山里紅吸收光譜曲線(1) Absorption spectrum curve of rutin (2) Absorption spectrum curve of Crataegus pinnatifida圖1 吸收光譜圖Fig 1 Absorption spectrogram

2.1.2.2 線性關(guān)系考察 精密量取上述蘆丁對照品溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL分別置于25 mL容量瓶中，按2.1.2.1所述方法，進行顯色，靜置15 min后，以乙醇為空白，在507 nm的波長處測定吸光度，以吸光度(y)為縱坐標(biāo)，濃度(x)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：y=12.607x-0.0055，R2=0.9996，在質(zhì)量濃度為0.0082～0.0820 mg/mL范圍內(nèi)，蘆丁質(zhì)量濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系。結(jié)果見圖2。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig 2 Standard curve diagram

2.1.3 總黃酮工藝優(yōu)化

2.1.3.1 總黃酮含量測定 精密稱取1.0 g山里紅果實粉末，置于圓底燒瓶中，用一定量的乙醇回流提取一段時間后，抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)；用乙醇定容至50 mL容量瓶中，搖勻，作為待測液；取0.5 mL待測液按2.1.2.1所述方法，進行顯色，靜置15 min后，以乙醇為空白，在507 nm的波長處測定吸光度。測3次，取平均值。根據(jù)回歸方程，用吸光度計算出被測液中黃酮含量。

式中：V為提取液定容體積/mL；B為吸取測定體積/mL；C為線性方程計算出的質(zhì)量濃度/(mg/mL)；D為測定時定容體積/mL；m為稱取的樣品質(zhì)量/g。

2.1.3.2 單因素試驗

2.1.3.2.1 乙醇濃度對黃酮提取量的影響 精密稱取5份山里紅果實粉末樣品各1.0 g置于100 mL圓底燒瓶中，分別加入30 mL乙醇溶液作為溶劑，控制乙醇濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%，提取2 h。抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，用乙醇定容至50 mL。從中取1 mL按4.2.1.2.1所述方法顯色，在波長507 nm處測定提取液吸光度，計算總黃酮提取率。結(jié)果見圖3。

圖3 乙醇濃度影響Fig 3 Effect of ethanol concentration

由圖可知，隨著乙醇濃度的增大，山里紅果實粉末總黃酮的提取率先增大后減小，這可能是因為乙醇濃度的增加會使一些醇溶性雜質(zhì)的溶出量增加，這些雜質(zhì)與黃酮類化合物競爭乙醇，從而導(dǎo)致溶出的黃酮類化合物減少。實驗結(jié)果表明，60%乙醇作為提取濃度時總黃酮提取率最高。因此，選定60%、70%、80%作為正交實驗中乙醇濃度的三個水平。

2.1.3.2.2 料液比 精密稱取5份粉碎的山里紅果實粉末樣品各1.0 g，置于500 mL圓底燒瓶中，分別用60%乙醇溶液作為溶劑，控制料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，提取2 h。抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，用60%乙醇定容至50 mL。從中取1 mL按2.1.2.1所述方法顯色，在波長507 nm處測定提取液吸光度，計算總黃酮提取率。結(jié)果見圖4。

圖4 料液比的影響Fig 4 Effect of Solid-liquid ratio

由圖可知，隨著料液比的減小，山里紅果實總黃酮的提取率增大，但料液比達到1∶40后，提取率趨于穩(wěn)定，此時黃酮類化合物已基本提取完全。且考慮到乙醇濃度過高會增加生產(chǎn)成本，因此，選定1∶20、1∶30、1∶40作為正交實驗中料液比的三個水平。

2.1.3.2.3 提取時間 精密稱取5份山里紅果實粉末樣品各1.0 g，置于500 mL圓底燒瓶中，分別加入30 mL60%乙醇溶液作為溶劑，控制提取時間為1、2、3、4 h。抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，用60%乙醇定容至50 mL。從中取1 mL按2.1.2.1所述方法顯色，在波長507 nm處測定提取液吸光度，計算總黃酮提取率。結(jié)果見圖5。

圖5 提取時間的影響Fig 5 Effect of extracting time

由圖5可知，隨著提取時間的延長,提取得到的總黃酮逐漸增加，3 h后提取率增加緩慢。為了提高提取效率和縮短生產(chǎn)周期。選定1、2、3 h作為正交實驗中乙醇體積分?jǐn)?shù)的三個水平。

通過上述實驗，對乙醇體積分?jǐn)?shù)(50%、60%、70%、80%、90%)、料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50)、提取時間(1、2、3、4 h)等影響因素進行分析，擬定影響山里紅果實總黃酮提取率的四個因素即A(乙醇濃度)、B(料液比)、 C(提取時間)、D(提取次數(shù))為優(yōu)選因素，每個因素三個水平進行L9(34)正交試驗，以確定山里紅果實總黃酮的最佳提取條件。

2.1.3.3 正交優(yōu)化試驗 選取乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、料液比(B)、提取時間(C)、提取次數(shù)(D)進行4因素3水平正交試驗，L9(34)試驗設(shè)計與結(jié)果見表1、2。

表1 正交試驗結(jié)果Tab 1 Results of orthogonal test

表2 山里紅果實總黃酮提取正交試驗因素水平表Tab 2 Orthogonal factor level table for total flavonoidsextraction of C.kansuensis fruit

表3 山里紅和甘肅山楂的果實和葉片中總黃酮的含量(n=3)Tab 3 The content of Flavonoids in fruit or leaf ofC.kansuensis and Crataegus pinnatifida(n=3)

由表2中的R極差分析可以得出，各因素影響的主次關(guān)系為D>A>C>B。山里紅總黃酮的最佳提取條件為A1B3C3D3，即乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶40、提取時間3 h、提取次數(shù)3次。按A1B3C3D3組合平行進行3次試驗，得到山里紅和甘肅山楂的果實和葉片中的總黃酮提取率平均值，見表3。

由表3可見，山里紅果和甘肅山楂果中總黃酮的平均含量分別為7.91%和6.75%，葉中的平均含量分別為2.55%和3.35%。

2.1.3.4 方法學(xué)驗證

2.1.3.4.1 精密度實驗 取2 mL蘆丁對照品溶液(0.41 mg/mL)置于25 mL容量瓶中，顯色后，在507 nm波長處測定其吸光度，連續(xù)測定6次。計算RSD=0.01%，RSD<5%，表明精密度良好。結(jié)果見表4。

表4 精密度實驗結(jié)果Tab 4 Results of the precision experiment

2.1.3.4.2 穩(wěn)定性實驗 按優(yōu)選出的方法制備山里紅果實粉末的供試品溶液，按2.1.2項下方法顯色，室溫下分別放置 0、2、4、8、24、48 h 后，在507 nm波長處測定其吸收度。計算得其RSD分別為1.68%，RSD<5%，說明供試品在兩天內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)果見表5。

表5 穩(wěn)定性實驗結(jié)果Tab 5 Results of the stability Experiment

2.1.3.4.3 重現(xiàn)性實驗 取5份山里紅果實粉末，精密稱定，按優(yōu)選出的方法制備供試品溶液，按2.1.2項下方法顯色，507 nm波長處測定其吸光度。計算含量，計算RSD=3.03%，RSD<5%，說明優(yōu)選方案的重現(xiàn)性良好。計算濃度時使用之前的標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=12.607x-0.0055，結(jié)果見表6。

表6 重現(xiàn)性實驗結(jié)果Tab 6 Results of the reproducibility Experiment

2.1.3.4.4 加樣回收試驗 取9份2.1.3.4.3項中的樣品各0.5 mL，分別置于25 mL容量瓶中，平均分為三組，各組分別精密加入對應(yīng)的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0.41 mg/mL)，進行加樣回收率測定。測定量是由測得的吸光度根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算得到的含量。計算得，加樣回收率RSD=3.42%，回收率較高，偏差較小，說明該方法準(zhǔn)確度較高。結(jié)果見表7。

加樣回收率=(測定量-已知量)/加入量×100%

已知量：取重現(xiàn)性實驗所得的濃度1.5761 mg/mL來計算，即為V樣·C樣=0.7881 mg

3 討 論

實驗驗證各因素影響的主次關(guān)系為提取次數(shù)(D)>乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)>提取時間(C)>料液比(B)，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、料液比為1∶40、提取時間為3 h、提取次數(shù)為3次是最佳提取條件。因此，最終確定甘肅山楂與山里紅總黃酮含量的測定方法為：精密稱取1.0000 g山里紅果實粉末，置于圓底燒瓶中，用60%乙醇為溶劑，按料液比為1∶40回流提取3 h，抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)；用60%乙醇定容至50 mL容量瓶中，搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液1 mL至25 mL量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min；加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min；加4%氫氧化鈉溶液10 mL，加60%乙醇定容至刻度，搖勻，進行顯色處理。放置15 min后，以乙醇為空白，在507 nm的波長處測定吸光度。該方法的精密度、重現(xiàn)性良好，加樣回收率高，偏差較小，準(zhǔn)確度較高。

表7 加樣回收實驗結(jié)果Tab 7 Results of the recovery Experiment

山里紅和山楂在甘肅主要是人工栽培，且產(chǎn)量較山東、山西等大產(chǎn)區(qū)要少，而甘肅山楂在甘肅具有豐富的野生資源，卻鮮為利用[9]。

山楂屬植物全身是寶，山楂葉在《中國藥典》中有收錄，而在《中國獸藥典》中未有收錄，山楂葉在獸藥、飼料添加劑中的利用有待進一步開發(fā)。

據(jù)文獻報道，山楂總黃酮中3個主要有效成分分別為蘆丁、金絲桃苷、牡荊素。其中蘆丁為主要成分，因此作者只對蘆丁進行了含量測定的研究，而其他兩種成分有待進一步研究分析。

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