吳寧鵬，呂小月，于 輝，周 娟

(1.河南省獸藥飼料監(jiān)察所，鄭州 450008；2.河南省動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，鄭州 450008)

大腸埃希菌(Escherichiacoli),通常稱為大腸桿菌，為腸桿菌科，埃氏菌屬的革蘭氏陰性菌。豬感染大腸桿菌通常引起仔豬腸道傳染性疾病，常見的有仔豬黃痢、仔豬白痢和水腫病三種[1]。近年，隨著抗菌藥物的不當(dāng)使用，耐藥菌株越來越多，耐藥問題日趨嚴(yán)重[2]，因此對(duì)大腸桿菌進(jìn)行長(zhǎng)期的監(jiān)測(cè)研究工作十分重要。脈沖場(chǎng)凝膠電泳(Pulsed field gel electrophoresis, PFGE)是近年發(fā)展起來的一種重要的分離大分子量線性DNA分子的電泳技術(shù)，因其重復(fù)性好，分辨力強(qiáng)被譽(yù)為細(xì)菌分子分型技術(shù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，被廣泛應(yīng)用于分子分型研究[3]。通過微生物分型可以鑒定菌株是否一致、比較它們的親緣關(guān)系，對(duì)于細(xì)菌性傳染病的監(jiān)測(cè)、傳染源的追蹤、傳播途徑的調(diào)查和識(shí)別有著非常重要的意義[4]。

碳青霉烯類抗菌藥物通常被認(rèn)為是治療泛耐藥腸桿菌的最后手段，而黏菌素是治療耐碳青霉烯類病原體感染的關(guān)鍵藥物，因此，耐黏菌素的菌株的傳播，會(huì)嚴(yán)重影響臨床治療的有效性[5]。本研究對(duì)2014、2015年分離于河南省焦作市、許昌市養(yǎng)殖場(chǎng)的耐黏菌素大腸桿菌進(jìn)行PFGE基因分型及耐藥性研究，以達(dá)到對(duì)河南省內(nèi)耐黏菌素大腸桿菌流行情況的準(zhǔn)確判斷，從而對(duì)耐黏菌素大腸桿菌引起的疾病的防治提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 2014與2015年從河南省焦作市、許昌市規(guī)?；B(yǎng)殖廠健康豬或病豬中分離并保存的共333株大腸桿菌中32株耐黏菌素大腸桿菌。沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H9812由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 主要儀器和試劑 動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性藥敏檢測(cè)板，購自上海星佰生物技術(shù)有限公司；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、腦心浸萃液瓊脂培養(yǎng)基，購自北京路橋公司；蛋白酶K、限制性內(nèi)切酶XbaⅠ購自寶生物工程(大連)有限公司；PFGE專用瓊脂糖為Bio-Rad公司配套產(chǎn)品；細(xì)胞懸浮液(CSB)、細(xì)胞裂解液(CLB)均為新鮮配制；CHEF-MapperXA型脈沖電泳儀、GELDOC凝膠成像系統(tǒng)購自BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗(yàn) 使用藥敏檢測(cè)板對(duì)32株耐黏菌素大腸桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果判定依照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)推薦的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 PFGE分型

1.2.2.1 細(xì)菌的培養(yǎng) 將受試菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株H9812劃線接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃過夜培養(yǎng)。

1.2.2.2 膠塊的制備 挑取適量的過夜培養(yǎng)的新鮮菌落制備菌懸液，加入10 μL的蛋白酶K和200 μL溶化的56 ℃的1% SeaKem Gold 1% SDS瓊脂糖。

1.2.2.3 細(xì)胞裂解 將膠塊于細(xì)胞裂解液中(5 mL CLB，25 μL蛋白酶K)裂解，水浴搖床55 ℃，165 r/min孵育5 h。

1.2.2.4 裂解后洗膠 分別用超純水和TE緩沖液洗滌膠塊。

1.2.2.5 酶切 用刀片切下約1/3的小膠塊，加入XbaⅠ酶切體系，37 ℃水浴3 h。

1.2.2.6 電泳 棄去酶切體系，將膠塊按順序置于梳子上，倒入溶解的1%的瓊脂糖制膠；使用CHEF-mapperXA型脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀和0.5×TBE進(jìn)行電泳。

1.2.2.7 染色與圖像的獲取 將凝膠置于500 mL含1 μg/mL的EB溶液中染色30 min，然后純水脫色30 min，用凝膠成像系統(tǒng)Gel Doc獲取膠圖，并用Bio Numerics軟件聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥敏試驗(yàn) 32株豬源大腸桿菌分離株對(duì)13種臨床常用抗菌藥物耐藥情況見表1。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，32株豬源耐黏菌素大腸桿菌對(duì)四環(huán)素的耐藥性(100%)最為普遍，其次是磺胺異噁唑(96.8%)，多西環(huán)素(96.8%)，復(fù)方新諾明(90.6%)，耐藥率均高達(dá)90%以上，對(duì)氟苯尼考、氨芐西林、大觀霉素、恩諾沙星的耐藥率分別為87.5%、84.4%、81.3%、59.4%，均在50%以上，對(duì)氧氟沙星(46.9%)、慶大霉素(31.3%)、阿莫西林/棒酸(12.5%)耐藥率較低，對(duì)頭孢噻呋耐藥率最低(0)。

2.2 PFGE 32株豬源耐黏菌素大腸桿菌的聚類分析見圖1，其中M14～39于2014年分離于許昌，2015M29、2015M31于2015年分離于許昌，2015M32、2015M35、2015M38、2015M39于2015年分離于焦作，分離株共存在30種帶型，其中，1、2、3、4帶型間相似性在90%以上，各菌株帶型間基本無差異，可認(rèn)為是同一流行亞種，5、6、7、8、9各帶型間相似性約為85%，可能存在克隆相關(guān)，其他帶型相似性均低于85%，說明親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，菌株遺傳基因之間不緊密相關(guān)，流行病學(xué)上可能不存在相關(guān)性。

表1 32株豬源大腸桿菌耐藥情況Tab 1 Antimicrobial resistance of 32 chicken E.coli isolates

圖1 32株耐黏菌素大腸桿菌PFGE聚類分析圖Fig 1 The cluster analysis of 32 strains of Colistin resistance E.coli

3 討論與小結(jié)

來自中國、英國和美國多所大學(xué)的研究者在期刊《柳葉刀·傳染病》上宣布[6]，發(fā)現(xiàn)了一種新形式的抗藥性，首次在腸桿菌科中發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒介導(dǎo)的黏菌素抗性機(jī)制，MCR-1。在此之前，黏菌素耐藥性僅由染色體突變介導(dǎo)，從未有過耐藥基因水平轉(zhuǎn)移的報(bào)道。面對(duì)最后的防線之一多粘菌素，而且這種抗藥性還在肉用動(dòng)物和人類中同時(shí)存在，可能是因?yàn)樵撍幍霓r(nóng)業(yè)使用。這種抗藥性可在細(xì)菌之間輕易地轉(zhuǎn)移，而且可能已經(jīng)蔓延至多個(gè)國家。

為了對(duì)河南省許昌市、焦作市兩規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)黏菌素耐藥菌株作流行病學(xué)分析，對(duì)分離于兩地市的黏菌素耐藥大腸桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)和分子分型研究，研究發(fā)現(xiàn)，32株豬源耐黏菌素大腸桿菌對(duì)四環(huán)素的耐藥性最為普遍，其次是磺胺異噁唑，多西環(huán)素，復(fù)方新諾明，耐藥率均高達(dá)90%以上，此外，對(duì)氟苯尼考、氨芐西林、大觀霉素、恩諾沙星的耐藥率均在50%以上，對(duì)氧氟沙星(46.9%)、慶大霉素(31.3%)、阿莫西林/棒酸(12.5%)耐藥率較低，對(duì)頭孢噻呋耐藥率最低，為0。分離株對(duì)多種抗菌藥物耐受，耐藥譜廣，可能與PFGE型較多有關(guān)。

脈沖場(chǎng)電泳(PFGE)技術(shù)重復(fù)性好，特異性、分辨性高，作為一種成功的基因分型方法，廣泛應(yīng)用于各種病原微生物分型和溯源中。在歐美等發(fā)達(dá)國家中，許多公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室采用PFGE技術(shù)進(jìn)行DNA指紋圖譜鑒定，確定食源性疾病發(fā)生時(shí)致病菌的種屬[7-8]。美國疾病預(yù)防及控制中心(CDC)通過建立細(xì)菌基因分型國家電子網(wǎng)絡(luò)(PulseNet)，將來自各地市的病人或可疑食品樣本的細(xì)菌PFGE實(shí)驗(yàn)結(jié)果與全國各地的結(jié)果進(jìn)行比較，根據(jù)來自同一親代的個(gè)體具有共同的遺傳物質(zhì)，故可以在PFGE實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出相同的指紋圖譜這一原理，確定各地致病菌的親緣關(guān)系，追溯共同的致病食品的源頭所在[9-10]。目前美國已應(yīng)用這種方式成功地查獲了多起食源性疾病的源頭食品，并通過對(duì)生產(chǎn)這些食品的單位進(jìn)行有效地干預(yù)控制[11]，從根本上防止了食源性疾病的發(fā)生[12]。

32株耐黏菌素大腸桿菌整體上表現(xiàn)出較大的遺傳多樣性，但不同菌株存在著不同程度的親緣關(guān)系，其中，帶型5中菌株M35和2015M31分別于2014年，2015年分離于許昌，其帶型具有較高的同源性，可能是許昌該養(yǎng)殖廠優(yōu)勢(shì)流行的菌株，菌株M20與2015M35分別于2014年，2015年分離于許昌和焦作，其帶型間相似性約為85%。

綜上所述，本研究為豬源耐黏菌素大腸桿菌的流行病學(xué)提供了一些本底數(shù)據(jù)，為今后大腸桿菌的監(jiān)測(cè)提供數(shù)據(jù)參考，為臨床篩選安全敏感抗菌藥物，初步建立細(xì)菌耐藥性流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)庫及疾病流行和暴發(fā)過程中的追蹤溯源提供參考。

參考文獻(xiàn)：

[1] 曾俊棋，岳萬福. 豬源大腸桿菌耐藥性與毒力的研究[J]. 現(xiàn)代畜牧獸醫(yī). 2016，(1): 38-44.

Zeng J Q, Yue W F. Study on the Resistance and Toxicity ofEscherichiacoliin Swine[J]. Modern Journal of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, 2016, (1):38-44.

[2] 王克領(lǐng)，張青嫻，徐引弟，等. 河南地區(qū)豬源性大腸桿菌血清型鑒定與耐藥性調(diào)查[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014，(9): 164-167.

Wang K L, Zhang Q X, Xu Y D,etal. Serotype Identification and Drug Resistance Investigation of SwineEscherichiacoliin Henan Area[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences, 2014，(9):164-167.

[3] 葉 蕊，石麗媛，王 鵬，等. 脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)簡(jiǎn)介及其在細(xì)菌分子分型中的應(yīng)用[J]. 中國媒介生物學(xué)及控制雜志. 2013，(2): 182-185.

Ye R, Shi L Y, Wang P,etal. Brief introduction of pulsed-field gel electrophoresis and its application in bacterial molecular typing[J]. Chinese Journal of Vector Biology and Control. 2013，(2):182-185.

[4] 張惠媛，汪 琦，張 昕，等. 進(jìn)出境食品中單核增生李斯特菌的血清分型與脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型分析[J]. 中國食品衛(wèi)生雜志, 2012，(5): 407-411.

Zhang H Y, Wang Q, Zhang X,etal. Analysis on pulsed-field gel electrophoresis and serotyping of Listeria monocytogenes isolates from import and export food[J]. Chinese Journal of Food Hygiene, 2012，(5):407-411.

[5] Johnson A P, Woodford N. Global spread of antibiotic resistance: the example of New Delhi metallo-beta-lactamase (NDM)-mediated carbapenem resistance[J]. J Med Microbiol, 2013, 62(Pt4): 499-513.

[6] Liu Y Y, Wang Y, Walsh T R,etal. Emergence of plasmid-mediated colistin resistance mechanism MCR-1 in animals and human beings in China: a microbiological and molecular biolo￣gical study[J]. Lancet Infect Dis, 2016, 16(2): 161-168.

[7] Felix B, Danan C, Van Walle I,etal. Building a molecular Listeria monocytogenes database to centralize and share PFGE typing data from food, environmental and animal strains throughout Europe[J]. J Microbiol Methods, 2014, 104: 1-8.

[8] Magnusson S H, Guethmundsdottir S, Reynisson E,etal. Comparison of Campylobacter jejuni isolates from human, food, veterinary and environmental sources in Iceland using PFGE, MLST and fla-SVR sequencing[J]. J Appl Microbiol, 2011, 111(4): 971-981.

[9] 游興勇，劉成偉，朱應(yīng)飛，等. 江西省食源性沙門菌血清分型及脈沖場(chǎng)凝膠電泳指紋圖譜研究[J]. 中國食品衛(wèi)生雜志, 2014, (6): 528-532.

You X Y, Liu C W, Zhu Y F,etal. Serotyping and PFGE type ofSalmonellaisolates from food in Jiangxi Province[J]. Chinese Journal of Food Hygiene, 2014, (6):528-532.

[10] Bakhshi B, Kalantar M, Rastegar-Lari A,etal. PFGE genotyping and molecular characterization of Campylobacter spp. isolated from chicken meat[J]. Iran J Vet Res, 2016, 17(3): 177-183.

[11] Lytsy B, Engstrand L, Gustafsson A,etal. Time to review the gold standard for genotyping vancomycin-resistant enterococci in epidemiology: Comparing whole-genome sequencing with PFGE and MLST in three suspected outbreaks in Sweden during 2013-2015[J]. Infect Genet Evol, 2017, 54: 74-80.

[12] Murase T, Nakamura A, Matsushima A,etal. An epidemiological study of Salmonella enteritidis by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE): several PFGE patterns observed in isolates from a food poisoning outbreak[J]. Microbiol Immunol, 1996, 40(11): 873-875.