杜吉革，彭小兵，張秀坤，朱 真，薛 麒，王 磊，李啟紅，印春生，姚文生，康 凱，蔣玉文，陳小云

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

產(chǎn)氣莢膜梭菌舊稱魏氏梭菌，是一種重要的人畜共患病原，常常誘發(fā)創(chuàng)傷性氣性壞疽和人類食物中毒以及羔羊痢疾、牛羊壞死性腸炎、牛羊腸毒血癥[1-3]，對畜牧業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失[4-7]。產(chǎn)氣莢膜梭菌的主要致病因子是其分泌的引起人和動物發(fā)病的外毒素[8]。根據(jù)產(chǎn)生的4種主要致死性外毒素α(CPA)、β(CPB)、ε(ETX)和ι(CPI)的種類，將該菌分為A、B、C、D、E五個毒素型[9]。由B型和D型產(chǎn)生的ETX[10]，在該菌所有外毒素中毒力最強[11]。該分子主要分為I、II和III三個區(qū)域，且有兩條肽鏈同時跨過I、II和III三個區(qū)域[12]，這導(dǎo)致僅使用ETX的一個域作為疫苗候選抗原的策略(如CPA、CPB的C末端[13-14])很難應(yīng)用于該毒素的防控。因此，實現(xiàn)毒素的減毒乃至無毒，對于開發(fā)毒素基因工程亞單位疫苗，及以其作為抗原組分的多價亞單位疫苗的研究和應(yīng)用顯得尤為重要。已有的研究發(fā)現(xiàn)，106位組氨酸突變?yōu)楦彼岬闹亟METX基本是無毒的，且保留了良好的免疫原性[15-17]。然而，該蛋白的可溶性表達量非常低，不足5%[18-19]，這將大大增加該蛋白用于制備亞單位疫苗的純化難度和生產(chǎn)成本，同時降低了表達蛋白的免疫原性。

已有的研究發(fā)現(xiàn)，將目的基因按照大腸桿菌偏好的密碼子進行優(yōu)化后可明顯促進目的蛋白的可溶表達[20-21]。為此，對我國現(xiàn)行D型產(chǎn)氣莢膜梭菌制苗用菌株(C60-2株)ETX的編碼基因進行了優(yōu)化研究，同時突變第106位氨基酸，經(jīng)原核系統(tǒng)表達、純化和鑒定，并對其毒力和免疫原性進行了研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 D型產(chǎn)氣莢膜梭菌C60-2株、D型產(chǎn)氣莢膜梭菌C60-2株天然毒素、兔源D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素抗血清以及pET-30a(+)表達載體均為中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所基礎(chǔ)保障處微生物實驗室保存；1.5～2.0 kg普通級健康日本大耳白兔和16～18 g ICR小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司；pEASY-Blunt Cloning Vector、感受態(tài)細胞Top10和BL21(DE3)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Montanide ISA 201佐劑購自法國賽彼科(seppic)公司；Ni-IDA親和層析介質(zhì)試劑盒、蛋白Marker、Western blot Marker、蛋白溶解液(50 mmol/L Tris-HCl,10% Glycerol,150 mmol/L NaCl,pH 8.0)， 均購自南京金斯瑞生物科技有限公司; 高保真PCR酶(KFX-401S)購自東洋坊公司；premix Taq version 2.0、DNA Marker購自Takara公司。T4 DNA連接酶、DNA凝膠回收試劑盒購自Promaga公司；限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和Hind Ⅲ購自NEB公司；抗His標簽單抗、Bradford蛋白濃度測定試劑盒，購自碧云天生物技術(shù)有限公司；明膠緩沖溶液，LB培養(yǎng)基購自北京中海生物科技有限公司。

1.2 基因合成及密碼子優(yōu)化 以前期擴增的D型產(chǎn)氣莢膜梭菌C60-2株ETX編碼基因為模版，按大腸桿菌偏愛的密碼子進行了優(yōu)化設(shè)計和人工合成。同時將第106位組氨酸突變?yōu)楦彼?。此外，在突變基因后添?*His標簽蛋白序列?；蚝铣捎赡暇┙鹚谷鹕锟萍加邢薰就瓿?，合成的基因稱為GETXH106P。

1.3 ETX突變體原核表達載體的構(gòu)建 以GETXH106P基因為模板，采用引物對GETXH106P-F/ GETXH106P-R進行PCR擴增。其中上游引物GETXH106P-F序列為：5'-CGCCATATGAAAGAAA￣TCTC -3'，其5'端引入限制性內(nèi)切酶NdeⅠ位點(下劃線部分)及保護性堿基；下游引物GETXH106P-R序列為：5'-CCGAAGCTTTTAGTGGTGATG，其5'端引入限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ位點及保護性堿基(下劃線部分)。PCR體系為50 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；98 ℃變性10 s，56 ℃退火30 s，68 ℃延伸60 s，共33個循環(huán)；最后68 ℃延伸7 min。擴增得到的目的DNA條帶，經(jīng)回收后，采用NdeⅠ/Hind Ⅲ雙酶切消化，與經(jīng)過相同酶切消化的pET30a(+)載體連接。將連接好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細胞，挑取單克隆至含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒進行PCR和雙酶切鑒定，鑒定結(jié)果為陽性的質(zhì)粒送中美泰和公司測序，將測序正確的質(zhì)粒命名為pET30a-GETXH106P。

1.4 重組蛋白的表達與鑒定 將pET30a-GETXH106P質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細胞，分別在16 ℃和37 ℃條件下用IPTG誘導(dǎo)表達，收集菌體，超聲破碎后分別收集上清和沉淀，采用SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達情況及其可溶性，將表達的目的蛋白稱為rETXH106P。采用Western blot方法，以抗His標簽蛋白抗體為一抗，以HRP標記的山羊抗鼠IgG為二抗進行孵育，進而對重組蛋白做進一步的鑒定。

1.5 重組蛋白的純化與鑒定 按照Ni-IDA親和層析介質(zhì)試劑盒的使用說明書對菌體裂解上清中呈可溶性表達的目的蛋白進行純化，用Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，-80 ℃保存?zhèn)溆?。將純化后的目的蛋?0.5 μg)經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，以兔源D型產(chǎn)氣莢膜梭菌抗毒素為一抗，以HRP標記的山羊抗兔IgG為二抗進行孵育，按照底物顯色試劑盒說明書進行顯色，檢測純化的重組蛋白與D型產(chǎn)氣莢膜梭菌抗毒素的反應(yīng)情況。

1.6 重組蛋白的純化與鑒定

1.6.1 細胞毒性試驗 將MDCK細胞接種96孔細胞培養(yǎng)板，置37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至形成細胞單層后，棄細胞生長液。將rETXH106P用細胞維持液稀釋至100 μg/mL以及10 μg/mL，每個稀釋度各接種3孔細胞，每孔100 μL，置37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察并記錄細胞的病變情況。同時將肉肝胃酶消化湯和洗脫液用細胞維持液稀釋100倍后，分別孵育細胞，作為陰性對照組，將D型產(chǎn)氣莢膜梭菌C60-2株天然毒素做5000倍稀釋后作為陽性對照。

1.6.2 小鼠的毒力測定 已有的研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)氣莢膜梭菌ETX首先以前體毒素形式分泌，當被蛋白酶，如胰酶、糜蛋白酶以及羧肽酶等，切除N端以及C端相應(yīng)的氨基酸后，毒素被活化，從而發(fā)揮相應(yīng)的生物活性[22-24]?；罨腅TX對小鼠的半數(shù)致死量可達50 ng/kg[25]。按照我國現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》(2015年版)規(guī)定的方法，用終濃度為1%的胰酶對純化的rETXH106P在37 ℃條件下活化1 h。將16～18 g ICR小鼠隨機分為9組，每組5只。分別用活化前和活化后的rETXH106P靜脈注射，注射劑量分為1 μg(6.25×104ng/kg)、10 μg(6.25×105ng/kg)、100 μg(6.25×106ng/kg)3個梯度。同時設(shè)置胰酶消化液(終濃度為1%)以及蛋白溶解液兩個陰性對照和1個MLD的天然毒素陽性對照。所有樣品均用明膠緩沖液進行稀釋，注射的液體總體積為200 μL。注射后觀察2 d，記錄小鼠的存活狀態(tài)。

1.7 免疫原性分析

1.7.1 免疫程序 將合適濃度的純化rETXH106P與Montanide ISA 201佐劑以1∶1(V/V)的比例配制成rETXH106P終濃度為50 μg/ml的疫苗，另取滅菌PBS與Montanide ISA 201佐劑以1∶1(V/V)的比例制備對照疫苗，置4 ℃保存?zhèn)溆?。選用體重1.5～2.0 kg健康家兔，測定免疫前每只家兔血清對D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素的中和效價。取8只對D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素的中和效價為0的家兔，其中4只各頸部皮下注射疫苗，2.0 mL/只，免疫后14 d，以相同劑量、相同途徑進行二次免疫。另外4只以相同劑量、相同途徑和相同方法免疫對照疫苗作為對照組。

1.7.2 血清中和抗體效價測定 分別在一免后14 d以及二免后21 d，對實驗組及對照組所有兔經(jīng)耳緣靜脈采血，分離血清備用。按照《中華人民共和國獸藥典》(2015年版)三部中規(guī)定的方法測定血清中和效價[26]。

1.7.3 攻毒試驗 二免后21 d，對免疫組及對照組所有家兔經(jīng)耳緣靜脈各注射1個MLD的天然毒素進行攻毒，觀察5 d，記錄家兔的死亡情況。根據(jù)免疫組及對照組家兔的死亡情況，判定試驗疫苗的免疫保護效力。

2 結(jié) 果

2.1 ETX毒素突變體原核表達載體的構(gòu)建 采用引物GETXH106P-F/GETXH106P-R進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)酶切后克隆至pET-30a(+)載體上。獲得的重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后電泳觀察，結(jié)果如圖1所示。酶切后出現(xiàn)大小約5 kb的載體DNA片段，以及大小約920 bp的目的基因片段，與預(yù)期相符。測序結(jié)果表明，插入的外源基因序列是正確的。將此重組質(zhì)粒命名為pET30a-GETXH106P。

1. DL5000 DNA相對分子質(zhì)量標準; 2.重組質(zhì)粒pET30a-GETXH106P的NdeⅠ和Hind Ⅲ雙酶切鑒定1. DL5000 DNA Marker;2. pET30a-GETXH106P digested with NdeⅠand Hind Ⅲ圖1 原核表達重組質(zhì)粒pET30a-GETXH106P的酶切鑒定Fig 1 Identification of recombinant prokaryotic expression plasmids pET30a-GETXH106P

2.2 ETX毒素突變體的原核表達鑒定 將重組表達質(zhì)粒pET30a-GETXH106P轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細胞并誘導(dǎo)表達。SDS-PAGE和Western blot檢測結(jié)果顯示，表達的目的蛋白分子量約為39 kD，大小與預(yù)期相符。表達的rETXH106P在BL21(DE3)菌體中以可溶性和包涵體兩種形式存在(圖2)。圖2a為重組蛋白表達的SDS-PAGE鑒定結(jié)果，如圖所示，37 ℃、誘導(dǎo)4 h后，通過灰度掃描顯示，可溶性表達的蛋白比例可達30%。綜合考慮重組蛋白的表達量、可溶性及誘導(dǎo)時間等條件，我們確定目的蛋白最適誘導(dǎo)表達條件為37 ℃，誘導(dǎo)表達4 h，收獲細胞裂解上清。圖2 b為重組蛋白的Western blot鑒定結(jié)果，表達的目的蛋白能與抗His標簽抗體發(fā)生反應(yīng)，證明目的蛋白含有His標簽，與預(yù)期相符。

a.重組蛋白表達的SDS-PAGE鑒定；b.重組蛋白與抗His單抗的Western blotM1. 蛋白marker；M2. Western blot marker；PC1. BSA (1 μg)；PC2. BSA (2 μg)；NC.未誘導(dǎo)細胞裂解物；1. 15 ℃、16 h誘導(dǎo)的細胞裂解物；2. 37 ℃、4 h誘導(dǎo)的細胞裂解物；NC1. 未誘導(dǎo)細胞裂解上清；NC2. 未誘導(dǎo)細胞裂解沉淀；3. 15 ℃、16 h誘導(dǎo)的細胞裂解上清；4. 15 ℃、16 h誘導(dǎo)的細胞裂解沉淀；5. 37 ℃、4 h誘導(dǎo)的細胞裂解上清；6. 37 ℃、4 h誘導(dǎo)的細胞裂解沉淀a.The identification of recombinant protein expression by SDS-PAGE; b. The identification of recombinant protein with anti-His monoclonal antibody by Western blotM1. protein Marker; M2. Western blot Marker；PC1. BSA (1 μg) ; PC2. BSA (2 μg); NC. The cell lysates without induction; 1. The cell lysates induced with IPTG for 16 h at 15 ℃; 2. The cell lysates induced with IPTG for 4 h at 37 ℃; NC1. The supernatant of cell lysates without induction; NC2. The precipitation of cell lysates without induction; 3.The supernatant of cell lysates induced with IPTG for 16 h at 15 ℃; 4. The precipitation of cell lysates induced with IPTG for 16 h at 15 ℃;5. The supernatant of cell lysates induced with IPTG for 4 h at 37 ℃; 6. The precipitation of cell lysates induced with IPTG for 4 h at 37 ℃.圖2 rETXH106P的原核表達與鑒定Fig 2 Prokaryotic expression and identification of rETXH106P

2.3 ETX毒素突變體的純化與鑒定 如圖3所示，按照Ni-IDA親和層析介質(zhì)試劑盒說明書對rETXH106P進行純化，收集純度較高的洗脫液(50 mmol/L Imidazole以及300 mmol/L Imidazole的洗脫液)進行透析，最終獲得的蛋白濃度為1.5 mg/mL，純度可達90%以上。將純化后的rETXH106P經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上進行Western blot檢測。結(jié)果顯示，rETXH106P能夠與D型產(chǎn)氣莢膜梭菌抗毒素反應(yīng)(圖4)。

2.4 ETX毒素突變體的毒力測定

2.4.1 對MDCK細胞的毒力測定 MDCK細胞加入各組分后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，顯微鏡下觀察。5000倍稀釋的天然D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素接種細胞組出現(xiàn)了明顯的細胞病變(圖5a)；接種濃度為100 μg/mL、10 μg/mL rETXH106P蛋白的實驗組(圖5b)、接種肉肝胃酶消化湯和洗脫液的陰性對照組及空白對照組細胞均生長良好，未出現(xiàn)細胞病變(圖5c)。

M: 蛋白Marker; 1：誘導(dǎo)的細胞裂解沉淀；2:誘導(dǎo)的細胞裂解物上清；3:上清與Ni-IDA孵育后流出液；4:無Imidazole的洗脫液；5:20 mmol/L Imidazole的洗脫液；6:50 mmol/L Imidazole的洗脫液；7:300 mmol/L Imidazole的洗脫液；8:Ni-IDA介質(zhì)M: protein marker; 1: The precipitation of cell lysates induced with IPTG；2:The supernatant of cell lysates after centrifugation; 3:The flow-through from Ni-IDA resin after incubated with supernatant;4:The elution from Ni-IDA resin washed with elution buffer without Imidazole;5: The elution from Ni-IDA resin washed with elution buffer contain 20 mmol/L Imidazole); 6:The elution from Ni-IDA resin washed with elution buffer(contain 50mmol/L Imidazole); 7:The elution from Ni-IDA resin washed with elution buffer (contain 300mmol/L Imidazole); 8:The elution from Ni-IDA resin圖3 rETXH106P的純化Fig 3 Purification of rETXH106P

M. 蛋白Marker；1.未誘導(dǎo)的細胞裂解物；2. 純化后的rETXH106PM:Protein Marker;1:The cell lysates without induction;2:rETXH106P after purification圖4 rETXH106P與D型產(chǎn)氣莢膜梭菌抗毒素反應(yīng)的Western blot鑒定Fig 4 Interaction of rETXH106P with antitoxin serum of Clostridium perfringens type D

2.4.2 對小鼠的毒力測定 未活化和經(jīng)過胰酶活化的rETXH106P，分別以1、10、100 μg/只的劑量尾靜脈注射小鼠，結(jié)果顯示：注射組以及蛋白溶解液和胰酶消化液兩個陰性對照組小鼠，在注射后24 h均存活，未見任何異常。注射1個MLD天然毒素的小鼠，在注射后24 h內(nèi)全部死亡。以上結(jié)果說明rETXH106P已成功減毒，即使經(jīng)過胰酶活化后，本實驗注射劑量對小鼠依然是無毒的。

2.5 ETX毒素突變體的免疫原性分析

2.5.1 血清毒素中和抗體效價的測定 結(jié)果如表1所示，經(jīng)血清中和法測定，以rETXH106P制備疫苗免疫家兔后，每毫升一免抗血清可中和450～700個MLD的D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素；每毫升的二免抗血清可中和3000～4000個MLD的D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素，而佐劑對照組的兔血清對D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素無中和作用。以上結(jié)果表明，rETXH106P的免疫效力遠高于現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》的規(guī)定(30個MLD/mL)，是優(yōu)良的制苗用候選抗原。

a: 加入5000倍稀釋的天然毒素培養(yǎng)液后培養(yǎng)24 h的細胞；b1-b2:分別加入濃度為100 μg/mL及10 μg/mL的rETXH106P培養(yǎng)液后培養(yǎng)24 h的細胞；c1:蛋白洗脫液對照；c2:用于培養(yǎng)D型產(chǎn)期莢膜梭菌的肉肝胃酶消化湯對照；c3: 細胞培養(yǎng)基對照a: MDCK cell cultured with the toxin-containing medium of Clostridium perfringens type D with dilution 5000 for 24h；b1-b2:MDCK cell cultured with rETXH106P-containing medium with concentrate of 100μg/mL and 10μg/mL, respectively, for 24h; c1:MDCK cell cultured with elution buffer control; c2: MDCK cell cultured with anaerobic beef, liver and stomach digestive enzyme soup used by Clostridium perfringens type D; c3: Cell culture control圖5 rETXH106P對MDCK細胞的影響Fig 5 The influence of rETXH106P to MDCK cell

2.5.2 攻毒保護實驗 表1結(jié)果顯示，在二免后21 d，對所有rETXH106P免疫組和佐劑免疫對照組的家兔，經(jīng)耳緣靜脈注射1個MLD劑量的天然毒素進行攻毒，結(jié)果表明，佐劑免疫對照組家兔在攻毒后5 d內(nèi)全部死亡，rETXH106P免疫組家兔全部健活，未見任何不良反應(yīng)。

表1 rETXH106P的免疫保護和免疫兔血清的中和效價結(jié)果Tab 1 Immunoprotection of rETXH106P and neutralizing titers of rabbit antiserum

“S”代表存活；“D”代表死亡

"S" means survived; "D" means died

3 討 論

隨著研究的深入，與產(chǎn)氣莢膜梭菌密切相關(guān)的主要致死性外毒素的結(jié)構(gòu)和致病機理越來越清晰，致死性外毒素的部分無毒區(qū)域(CPA、CPB以及CPI的C末端[13-14])或者無毒突變體(ETX和PFO[27])作為亞單位疫苗抗原已經(jīng)被證實能夠有效預(yù)防相應(yīng)的毒血癥。在無毒重組ETX亞單位疫苗的研究中，經(jīng)典的無細胞毒性突變體為第106位組氨酸突變?yōu)楦彼岬闹亟METX蛋白，其安全性和免疫原性已經(jīng)得到大量驗證[15-17]。研究制備的rETXH106P可溶性表達量較高，可溶性比例可達30%，這可能是由于研究按照大腸桿菌偏愛的密碼子，對rETXH106P進行了優(yōu)化，從而為后續(xù)的大量生產(chǎn)以及純化提供便利。根據(jù)已有的文獻報道，50 ng/mL的天然ETX即可引起小鼠死亡，而研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)6.25×106ng/kg的rETXH106P對ICR小鼠尾靜脈注射，仍無致死性，證明該重組蛋白具有良好的安全性。

自然環(huán)境中對動物致病的梭菌種類較多，且?；旌细腥?，因而梭菌病的預(yù)防多采用聯(lián)苗，以達到一針多防的目的。目前我國商品化的該類疫苗均為天然毒素經(jīng)甲醛脫毒后制備的類毒素疫苗，其生產(chǎn)過程復(fù)雜，易導(dǎo)致產(chǎn)毒不穩(wěn)定。此外，該類疫苗有效抗原含量較低，制備聯(lián)苗后免疫劑量過大，容易引起動物的應(yīng)激反應(yīng)。彭小兵等對該類疫苗2006-2015年間的檢驗結(jié)果進行了統(tǒng)計分析，結(jié)果表明：以血清中和法檢驗，效力不符合規(guī)定的產(chǎn)品共有33批，其中β毒素組分效力不符合規(guī)定(低于1 MLD)的比例最高，約為72.7%[28]。然而，鑒于此類聯(lián)苗免疫劑量的限制，無法再大幅度增加β類毒素的比例。為此，產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素亞單位疫苗的研制顯得極為重要。在一定范圍內(nèi)，可以最大限度增大免疫原性較差的毒素抗原，從而提高聯(lián)苗的總體免疫保護作用。而研究中制備的rETXH106P，一免兔血清每毫升可中和450 MLD以上，二免兔血清每毫升可中和3000 MLD以上，效果明顯優(yōu)于目前的商品化疫苗。這說明ETX的第106位氨基酸突變后，毒力基本消失，但仍保留了良好的免疫原性，是我國現(xiàn)行D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素疫苗升級換代的理想候選疫苗抗原。

參考文獻：

[1] Novak J S, Juneja V K.Clostridiumperfringens: hazards in new generation foods [J]. Innov Food Sci Emerg Technol, 2002, 3(2):127-132.

[2] Uzal F A, Freedman J C, Shrestha A,etal. Towards an understanding of the role ofClostridiumperfringenstoxins in human and animal disease [J]. Future Microbiol, 2014, 9(3):361-377.

[3] Decker M, Gomes G D, Galv?倞o A C,etal. Evaluation of a new mathematical model to describeClostridiumperfringensgrowth during the cooling of cooked ground beef [J]. Food Sci Technol, 2013, 33(3):507-512.

[4] 鄭曉麗, 竇賢明, 胡道俊, 等. 產(chǎn)氣莢膜梭菌對養(yǎng)牛業(yè)的危害及其防制[J]. 中國畜牧獸醫(yī), 2010, 37(8):211-214.

Zheng X L, Dou X M, Hu D G,etal. The threat, prevention and control ofClostridiumperfringensin cattle industry [J]. China Animal Husbandry and Veterinary Medicine, 2010, 37(8):211-214.

[5] 釧有科, 肖 嘯, 濮永華，等. 努比亞山羊產(chǎn)氣莢膜梭菌病的診治[J]. 中國獸醫(yī)雜志, 2014, 50(12):42-43.

Chuan Y K, Xiao X, Pu Y H,etal. Diagnosis and treatment ofClostridiumperfringensinfection in Nubian goats[J]. Chinese Journal of Veterinary Medicine, 2014, 50(12):42-43.

[6] Van I F, De B J, Pasmans F,etal.Clostridiumperfringensin poultry: an emerging threat for animal and public health [J]. Avian Pathol, 2004, 33(6):537-549.

[7] 鄭曉麗, 宋振銀, 倪學(xué)勤. 產(chǎn)氣莢膜梭菌對家禽業(yè)的危害及其預(yù)防[J].中國家禽, 2008, 30(24):69-71.

Zheng X L, Song Z Y, Ni X Q. Hazards and prevention ofClostridiumperfringensto poultry industry [J]. China Poultry, 2008, 30(24):69-71.

[8] Revittmills S A, Rood J I, Adams V.Clostridiumperfringensextracellular toxins and enzymes: 20 and counting [J]. Microbiol Aus, 2015, 36(3)114-117.

[9] Niilo L.Clostridiumperfringensin animal disease: a review of current knowledge [J]. Can Vet J, 1980, 21(5):141-148.

[10] Sayeed S, Li J, Mcclane B A. Virulence plasmid diversity inClostridiumperfringenstype D isolates [J]. Infect Immun, 2007, 75(5):2391-2398.

[11] Sakurai J. Toxins ofClostridiumperfringens[J]. Rev Med Microbiol, 1995, 6(3):175-185.

[12] Cole A R, Gibert M, Popoff M,etal.Clostridiumperfringensepsilon-toxin shows structural similarity to the pore-forming toxin aerolysin [J]. Nat Struct Mol Biol, 2004, 11(8):797-798.

[13] Nagahama M, Oda M, Kobayashi K,etal. A recombinant carboxy-terminal domain of alpha-toxin protects mice againstClostridiumperfringens[J]. Microbiol Immunol, 2013, 57(5):340-345.

[14] Das S, Majumder S, Kingston J J,etal. Generation and characterization of recombinant bivalent fusion protein r-Cpib for immuno￣therapy againstClostridiumperfringensbeta and iota toxemia [J]. Mol Immunol, 2016, 70:140-148.

[15] Alimolaei M, Golchin M, Daneshvar H. Oral immunization of mice againstClostridiumperfringens, epsilon toxin with aLacto￣bacilluscasei, vector vaccine expressing epsilon toxoid [J]. Infect Genet Evol, 2016, 40:282-287.

[16] Li Q, Xin W, Gao S,etal. A low-toxic site-directed mutant ofClostridiumperfringenserfringens low-toxic site-directed mutant of Closenterotoxemia [J]. Hum Vaccin Immunother, 2013, 9(11):2386-2392.

[17] Dorca-Arévalo J, Pauillac S, Dlaz-Hidalgo L,etal. Correlation betweeninvitrocytotoxicity andinvivolethal activity in mice of epsilon toxin mutants fromClostridiumperfringens[J]. PLoS One, 2014, 9(7):e102417.

[18] 李 箐. 產(chǎn)氣莢膜梭菌α、ε毒素突變體構(gòu)建及應(yīng)用[D]. 安徽醫(yī)科大學(xué), 2013.

Li Q. Construction of mutants ofClostridiumperfringensAlpha, epsilon toxin and it's application [D]. Anhui Medical University, 2013.

[19] Oyston P C, Payne D W, Havard H L,etal. Production of a non-toxic site-directed mutant ofClostridiumperfringensepsilon-toxin which induces protective immunity in mice [J]. Microbiology, 1998, 144 (2):333-341.

[20] 羅維佳, 鄧 晨, 李衍常, 等. 串聯(lián)雜種泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白(ThUBD)在大腸桿菌中的可溶性高效表達[J]. 軍事醫(yī)學(xué), 2016, 40(10):795-800.

Luo W J, Dong C, Li Y C,etal. Soluble expression of tandem hybrid ubiquitin-binding domains(ThUBD)In prokaryotic cytoplasm of Escherichia coli BL21(DE3) [J]. Military Medical Sciences, 2016, 40(10):795-800.

[21] 于 蕊, 王 雙, 余云舟, 等. B型肉毒毒素保護性抗原He在大腸桿菌中的可溶性高表達[J]. 生物技術(shù)通訊, 2008, 19(3):365-367.

Yu R, Wang S, Yu Y Z,etal. High-level and soluble expression of Botulinum Neurotoxin serotype B protective antigen HC domain in Escherichia coli[J]. Letter in Biotechnology, 2008, 19(3):365-367.

[22] Hunter S E, Clarke I N, Kelly D C,etal. Cloning and nucleotide sequencing of theClostridiumperfringensepsilon-toxin gene and its expression inEscherichiacoli[J]. Infect Immun, 1992, 60(1):102-110.

[23] Minami J, Katayama S, Matsushita O,etal. Lambda-toxin ofClostridiumperfringensactivates the precursor of epsilon-toxin by releasing its N- and C-terminal peptides [J]. Microbiol Immunol, 1997, 41(7):527-535.

[24] Freedman J C, McClane, B A, Uzal, F A. New insights intoClostridiumperfringensepsilon toxin activation and action on the brain during enterotoxemia [J]. Anaerobe , 2016, 41: 27-31.

[25] Bokori-Brown M, Savva C G, Sp F D C,etal. Molecular basis of toxicity ofClostridiumperfringensepsilon toxin [J]. FEBS J, 2011, 278(23):4589.

[26] 中國獸藥典委員會. 中華人民共和國獸藥典2015年版三部[S]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2016:45-46.

Commission of Chinese Veterinary Pharmacopoeia.Veterinary Pharmacopoeia of the People's Repubilc of China Volume Ⅲ 2015 Edition[S]. Beijing: China Agricultural Press, 2016:45-46.

[27] Verherstraeten S, Goossens E, Valgaeren B,etal. Non-toxic perfringolysin O and α-toxin derivatives as potential vaccine candidates against bovine necrohaemorrhagic enteritis[J]. Veteri￣nary Journal, 2016, 217:89.

[28] 彭小兵, 田冬青, 彭國瑞, 等. 產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素的表達及其抗血清的制備[J]. 畜牧與獸醫(yī), 2015, 47(10): 93-96.

Peng X B, Tian D Q, Peng G R,etal. Expression ofClostridiumperfringenserfringensm perfringension of 33antiserum[J]. Animal Husbandry and Veterinary Medicine, 2015, 47(10):93-96.