曲光剛，王長(zhǎng)江，李書(shū)光，李茂峰，武曰星，金婷婷，韓文瑜，沈志強(qiáng)1,*

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院博士后科研工作站, 山東濱州 256600；2. 吉林大學(xué)博士后科研流動(dòng)站,長(zhǎng)春 130062；3. 山東綠都生物科技有限公司，山東濱州 256600；4. 山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600；5. 陽(yáng)信縣綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東濱州 251800)

豬鏈球菌(Streptococcosissuis，S.suis)感染豬可引起腦膜炎、關(guān)節(jié)炎和敗血癥等疾病，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。根據(jù)莢膜多糖抗原性的差異，豬鏈球菌可以分為35個(gè)血清型。研究表明，不同血清型的豬鏈球菌及同一血清型中不同菌株之間的致病力各有差異[4]。其中豬鏈球菌2型是從病豬體內(nèi)最常分離出的血清型，致病力最強(qiáng)，同時(shí)它也是一種重要的人畜共患病病原體，可導(dǎo)致生豬從業(yè)人員的感染和死亡[5-6]。有關(guān)豬鏈球菌的致病機(jī)制及其預(yù)防研究已經(jīng)成為公共衛(wèi)生領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[7]。

天然免疫球蛋白M(IgM)含有C1q結(jié)合基序，它可以結(jié)合到病原體表面而引發(fā)經(jīng)典的補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)[8]，在抵抗不同病原體及關(guān)聯(lián)先天免疫和獲得性免疫過(guò)程中起重要作用[9]。由于單體膜表面IgM是豬主要的B細(xì)胞受體[9-10]，并且豬體內(nèi)缺少I(mǎi)gD，因此IgM對(duì)豬尤為重要。研究發(fā)現(xiàn)豬感染鏈球菌后體內(nèi)會(huì)有IgM發(fā)生降解[11]，在此過(guò)程中豬鏈球菌IgM降解酶(Immunoglobulin M-degrading enzyme ofS.suis, IdeSsuis)發(fā)揮了重要作用[11]，這提示IdeSsuis蛋白可能是一種有效的豬鏈球菌抗原。此外，J Seele等的研究結(jié)果表明，IdeSsuis蛋白的氨基酸序列截短至第432個(gè)氨基酸時(shí)仍具有IgM降解活性[12]。

研究通過(guò)克隆IdeSsuis基因截短片段TrIde序列，分別構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a-TrIde、pET32a-TrIde和pET-sumo-TrIde，轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)后通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，為豬鏈球菌通用亞單位疫苗的開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 豬鏈球菌2型強(qiáng)毒株JZLQ為實(shí)驗(yàn)室分離保存。載體pET28a、pET32a、pET-sumo購(gòu)自Invitrogen公司；宿主菌E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)、 rTaq DNA聚合酶，限制性?xún)?nèi)切酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ，T4 DNA連接酶均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒：Plasmid Mini Kit I (200)、膠回收試劑盒：Gel Extraction Kit (200)均購(gòu)自美國(guó)OMEGA公司；氨芐青霉素(Ampicillin)與卡那霉素(Kanamycin)購(gòu)自SIGMA公司。

1.2 方法

1.2.1 豬鏈球菌2型TrIde基因擴(kuò)增 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中豬鏈球菌2型IdeSsuis基因序列設(shè)計(jì)合成1對(duì)上、下游分別含有BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)的特異性引物。上游引物：5'-CGGGATCCATGGATACAGTTGTTACAGGAGTGAATGA-3'，下游引物：5'-CCAAGCTTTGTCTGACTAGCTGTTTCT￣TTGG-3'(下劃線(xiàn)分別為BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn))。引物由上海生工生物工程有限公司合成。提取豬鏈球菌2型強(qiáng)毒株JZLQ全基因組DNA，以此為模板經(jīng)PCR方法擴(kuò)增出TrIde基因片段，預(yù)期大小為1200 bp左右。TrIde基因擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)為98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)片段大小。

1.2.2 原核重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后用膠回收試劑盒切膠回收，純化后與pET28a、pET32a和pET-sumo載體分別用限制性?xún)?nèi)切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ進(jìn)行雙酶切，而后分別用膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化；回收產(chǎn)物在T4 DNA連接酶作用下連接1 h后轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，分別涂布相應(yīng)抗性L(fǎng)B篩選平板，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)；分別挑取篩選平板上的單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，并將陽(yáng)性質(zhì)粒送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 TrIde蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析 將測(cè)序正確的重組表達(dá)載體pET28a-TrIde、pET32a-TrIde、pET-sumo-TrIde分別轉(zhuǎn)化E.coliBL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂布抗性平板后挑取單菌落過(guò)夜培養(yǎng)，次日按1%比例將過(guò)夜培養(yǎng)物接種于新鮮LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，至OD600達(dá)到0.5左右時(shí)，分別加入IPTG至終濃度為0.1 mmol/L、1 mmol/L，分別在25 ℃、37 ℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)8 h。誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體細(xì)胞經(jīng)超聲波破碎后高速離心分離上清和沉淀，分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.4 TrIde蛋白純化及陽(yáng)性血清制備 采用優(yōu)化后的最佳條件對(duì)TrIde目的蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)鎳親和層析柱純化，純化后的蛋白溶液采用BCA法微量蛋白濃度測(cè)量試劑盒測(cè)定濃度，蛋白分裝后放置-80 ℃保存。

將純化好的目的蛋白制成疫苗免疫清潔級(jí)新西蘭兔，400 μg/只。免疫方式為皮下注射，第1次免疫時(shí)采用抗原與等體積的弗氏完全佐劑充分混勻后免疫；第2次免疫于首次免疫14 d后進(jìn)行，抗原與等體積的弗氏不完全佐劑充分混勻乳化后進(jìn)行免疫。第3次免疫在首次免疫28 d后進(jìn)行，免疫條件同前一次。第3次免疫一周后采血，用ELISA方法測(cè)定血清抗體效價(jià)。

1.2.5 Western blotting分析 目的蛋白及空白菌變性后經(jīng)SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后將凝膠放置在轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡20 min，采用半干法轉(zhuǎn)印蛋白到硝酸纖維素膜上，磷酸鹽緩沖液漂洗后用體積分?jǐn)?shù)為10%的TBST 4 ℃封閉過(guò)夜。再加入體積分?jǐn)?shù)5%的TBST稀釋的兔陽(yáng)性血清，37 ℃振蕩孵育1 h，TBST漂洗3次，加入按1∶2000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗，37 ℃振蕩孵育30 min，TBST漂洗3次后進(jìn)行DAB顯色觀察結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 TrIde目的基因的擴(kuò)增 經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小約為1200 bp，與預(yù)期目的片段大小相符，且未見(jiàn)非特異性擴(kuò)增條帶(圖1)。

2.2 重組表達(dá)載體鑒定 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，三種重組表達(dá)載體分別用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切后均得到一條大小約為1200 bp的條帶，另一條條帶位置在2000 bp以上(圖2)，為切開(kāi)的載體片段。測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步表明重組表達(dá)載體構(gòu)建正確。

M：DL2000 Marker；1：TrIde基因片段PCR產(chǎn)物M: DL2000 Marker; 1: PCR product of TrIde圖1 TrIde基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig 1 PCR product of TrIde detected by 1% agarose gel electrophoresis

M：DL2000 Marker；1：pET32a-TrIde雙酶切結(jié)果；2：pET-sumo-TrIde雙酶切結(jié)果；3：pET28a-TrIde雙酶切結(jié)果M: DL2000 Marker; 1: Double digestion products of pET32a-TrIde;2: Double digestion products of pET-sumo-TrIde;3: Double digestion products of pET28a-TrIde圖2 重組表達(dá)質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig 2 Double digestion assay of recombinant expression vectors

2.3 TrIde目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

2.3.1 不同表達(dá)載體表達(dá)效果比較 在E.coliBL21(DE3)中分別對(duì)三種重組表達(dá)載體進(jìn)行TrIde目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果顯示pET28a-TrIde重組表達(dá)載體的表達(dá)效果最佳，目的蛋白表達(dá)量高且可溶率為95%以上(圖3)；pET32a-TrIde重組表達(dá)載體表達(dá)的目的蛋白也具有較好的可溶性，但表達(dá)量比pET28a-TrIde重組表達(dá)載體略低(圖3，第2、5泳道)；pET-sumo-TrIde重組表達(dá)載體表達(dá)的目的蛋白大部分以包涵體形式存在，可溶性目的蛋白的表達(dá)量低于pET28a-TrIde重組表達(dá)載體(圖3，第2、8泳道)。

M：蛋白Marker；1：BL21 (DE3)/pET28a-TrIde未誘導(dǎo)菌；2：BL21 (DE3)/pET28a-TrIde誘導(dǎo)表達(dá)超聲破碎上清；3：BL21 (DE3)/pET28a-TrIde誘導(dǎo)表達(dá)超聲破碎沉淀；4：BL21 (DE3)/pET32a-TrIde未誘導(dǎo)菌;5：BL21 (DE3)/pET32a-TrIde誘導(dǎo)表達(dá)超聲破碎上清；6：BL21 (DE3)/pET28a-TrIde誘導(dǎo)表達(dá)超聲破碎沉淀；7：BL21 (DE3)/pET-sumo-TrIde未誘導(dǎo)菌;8：BL21 (DE3)/pET-sumo-TrIde誘導(dǎo)表達(dá)超聲破碎上清；9：BL21 (DE3)/pET-sumo-TrIde誘導(dǎo)表達(dá)超聲破碎沉淀M: Protein Marker; 1: Non-induced BL21 (DE3)/pET28a-TrIde;2: Supernatant after ultrasonication of BL21 (DE3)/pET28a-TrIde;3: Precipitate after ultrasonication of BL21 (DE3)/pET28a-TrIde;4:Non-induced BL21 (DE3)/pET32a-TrIde;5: Supernatant after ultrasonication of BL21 (DE3)/pET32a-TrIde;6: Precipitate after ultrasonication of BL21 (DE3)/pET32a-TrIde;7: Non-induced BL21 (DE3)/pET-sumo-TrIde;8: Supernatant after ultrasonication of BL21 (DE3)/pET-sumo-TrIde;9: Precipitate after ultrasonication of BL21 (DE3)/pET-sumo-TrIde圖3 三種不同重組表達(dá)載體誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果SDS-PAGE分析Fig 3 SDS-PAGE analysis of TrIde induced by different recombinant bacteria

2.3.2 pET28a-TrIde重組表達(dá)載體表達(dá)條件的優(yōu)化

SDS-PAGE結(jié)果顯示，重組菌BL21 (DE3)/pET28a-TrIde經(jīng)誘導(dǎo)后表達(dá)產(chǎn)物大小約50 kD，條帶位置與預(yù)期目的蛋白分子質(zhì)量大小一致(圖4)；不同溫度條件對(duì)目的蛋白的表達(dá)量具有較大影響，25 ℃條件下目的蛋白的表達(dá)量比37 ℃條件下高，且可溶性較好(圖4，第1、3和5、7泳道)。25 ℃條件下IPTG濃度對(duì)目的蛋白表達(dá)量及可溶性幾乎無(wú)影響(圖4，第1、2和3、4泳道)。

M：蛋白Marker；Nc：未誘導(dǎo)重組菌BL21 (DE3)/pET28a-TrIde；1：25 ℃ IPTG 0.1 mmol/L誘導(dǎo)表達(dá)8 h超聲破碎上清；2：25 ℃ IPTG 0.1 mmol/L誘導(dǎo)表達(dá)8 h超聲破碎沉淀；3：25 ℃ IPTG 1 mmol/L誘導(dǎo)表達(dá)8 h超聲破碎上清；4：25 ℃ IPTG 1 mmol/L誘導(dǎo)表達(dá)8 h超聲破碎沉淀；5：37 ℃ IPTG 0.1 mmol/L誘導(dǎo)表達(dá)8 h超聲破碎上清；6：37 ℃ IPTG 0.1 mmol/L誘導(dǎo)表達(dá)8 h超聲破碎沉淀；7：37 ℃ IPTG 1 mmol/L誘導(dǎo)表達(dá)8 h超聲破碎上清；8：37 ℃ IPTG 1 mmol/L誘導(dǎo)表達(dá)8 h超聲破碎沉淀M: Protein Marker; Nc: Non-induced recombinant bacteria;1: Supernatant after ultrasonication of recombinant bacteria induced by 0.1 mmol/L IPTG at 25 ℃ for 8 hours;2: Precipitate after ultrasonication of recombinant bacteria induced by 0.1 mmol/L IPTG at 25 ℃ for 8 hours;3: Supernatant after ultrasonication of recombinant bacteria induced by 1 mmol/L IPTG at 25 ℃ for 8 hours;4: Precipitate after ultrasonication of recombinant bacteria induced by 1 mmol/L IPTG at 25 ℃ for 8 hours; 5: Supernatant after ultrasonication of recombinant bacteria induced by 0.1 mmol/L IPTG at 37 ℃ for 8 hours; 6: Precipitate after ultrasonication of recombinant bacteria induced by 0.1 mmol/L IPTG at 37 ℃ for 8 hours; 7: Supernatant after ultrasonication of recombinant bacteria induced by 1 mmol/L IPTG at 37 ℃ for 8 hours; 8: Precipitate after ultrasonication of recombinant bacteria induced by 1 mmol/L IPTG at 37 ℃ for 8 hours圖4 重組菌BL21 (DE3)/pET28a-TrIde不同誘導(dǎo)條件下表達(dá)結(jié)果SDS-PAGE分析Fig 4 SDS-PAGE analysis of recombinant TrIde induced by different conditions

2.4 TrIde蛋白純化 選擇誘導(dǎo)表達(dá)效果較好的重組菌BL21 (DE3)/pET28a-TrIde以最佳條件進(jìn)行目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，蛋白溶液經(jīng)鎳親和層析柱純化。純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE(圖5)，灰度分析結(jié)果顯示目的蛋白純度可達(dá)95%，BCA法測(cè)定蛋白濃度為1.8 mg/mL。

M：蛋白Marker；1：陰性對(duì)照；2：菌體超聲破碎后離心上清；3：親和層析純化后的蛋白M: protein Marker; 1: Negative control; 2: Supernatant after ultrasonication; 3: Purified TrIde protein圖5 TrIde蛋白純化SDS-PAGE分析Fig 5 SDS-PAGE analysis of purified TrIde protein

2.6 Western blotting分析 免疫印跡結(jié)果顯示，空載體菌及未誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化菌在50 kD處均無(wú)表達(dá)條帶，誘導(dǎo)菌則有明顯條帶(圖6)，提示經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后重組菌表達(dá)了截短的IdeSsuis蛋白TrIde，且TrIde重組蛋白能被抗2型豬鏈球菌陽(yáng)性血清識(shí)別，表明該重組蛋白具有良好的抗原反應(yīng)和免疫原性。

M：預(yù)染Marker；1：空載體表達(dá)產(chǎn)物；2：未誘導(dǎo)菌表達(dá)產(chǎn)物；3：TrIde重組蛋白M: Marker; 1: Expression product of empty vector;2: Non-induced expression product; 3: TrIde recombinant protein圖6 TrIde重組蛋白Western blotting分析Fig 6 Western blotting analysis of TrIde protein

3 討 論

由于豬鏈球菌的致病機(jī)制十分復(fù)雜，目前在豬鏈球菌病預(yù)防過(guò)程中尚未有廣譜、高效的疫苗。一般認(rèn)為豬鏈球菌致病力強(qiáng)弱是由其毒力因子決定的，但由于豬鏈球菌的毒力因子種類(lèi)繁多、結(jié)構(gòu)與功能復(fù)雜多變、各毒力因子之間的聯(lián)系錯(cuò)綜復(fù)雜，因此其致病機(jī)制尚未研究清楚[12-13]。目前研究的較為深入的致病性毒力因子主要包括莢膜多糖、溶菌酶釋放蛋白與豬溶素等[14]。

人類(lèi)病原菌釀膿鏈球菌分泌一種針對(duì)IgG特異性的內(nèi)肽酶IdeS，該酶可在IgG鉸鏈區(qū)高效裂解人類(lèi)IgG。有研究表明豬鏈球菌Mac家族基因編碼一種具有IdeS蛋白酶活性的酶(IdeSsuis)[15]，該酶被證明與IdeS同型但不具有IgG裂解活性，而是專(zhuān)一性的裂解IgM，并且裂解效率極高。此外，IdeSsuis蛋白酶氨基酸序列的全長(zhǎng)不是其裂解活性所必需的。Jana Seele等證明IdeSsuis蛋白酶只需從第35號(hào)到第432號(hào)氨基酸長(zhǎng)度的片段就具有較好的IgM裂解活性[11]。

研究對(duì)IdeSsuis開(kāi)放閱讀框基因序列推測(cè)的氨基酸序列進(jìn)行分析后，選取了長(zhǎng)度為1227 bp的具有裂解活性的片段進(jìn)行克隆表達(dá)。利用pET28a、pET32a和pET-sumo載體質(zhì)粒分別構(gòu)建IdeSsuis的重組表達(dá)載體pET28a-TrIde和pET32a-TrIde和pET-sumo-TrIde，利用BL21(DE3)作為宿主菌，通過(guò)不同溫度條件及誘導(dǎo)劑IPTG濃度的優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了該蛋白在大腸埃希菌原核表達(dá)系統(tǒng)中的可溶性表達(dá)。利用pET28a載體質(zhì)粒表達(dá)的蛋白分子量理論值為46 kD，但SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示其表觀分子量略大于46 kD。其表觀分子量偏大的原因可能是與標(biāo)準(zhǔn)蛋白相比其電荷密度較低造成的[16]。

分別把目的基因TrIdeSsuis片段克隆入不同的表達(dá)載體構(gòu)建三種重組表達(dá)質(zhì)粒，并分別比較其表達(dá)效果，結(jié)果顯示pET28a載體質(zhì)粒能夠?qū)崿F(xiàn)該目的基因的可溶性表達(dá)，且目的蛋白表達(dá)量較高，便于該蛋白的后續(xù)純化工作。IdeSsuis蛋白的可溶性表達(dá)為該蛋白的純化及免疫原性分析奠定了基礎(chǔ)。

IgM是體液免疫過(guò)程中的重要參與者，發(fā)生感染后IgM首先出現(xiàn)，它是感染初期的標(biāo)志性物質(zhì)。由于IdeSsuis對(duì)IgM具有非常高效和專(zhuān)一性的裂解作用，這可能是造成豬鏈球菌2型感染后產(chǎn)生免疫逃逸的機(jī)制之一。該酶參與了宿主免疫應(yīng)答早期階段的宿主-病原體相互作用，同時(shí)IdeSsuis在大部分鏈球菌中都有表達(dá)，因此，該蛋白的可溶性表達(dá)為豬鏈球菌通用疫苗的研發(fā)提供了新的方向和思路。后續(xù)需通過(guò)豬鏈球菌攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證該重組蛋白的免疫效果及保護(hù)作用。

參考文獻(xiàn)：

[1] Segura M, Zheng H, De Greeff A,etal. Latest developments onStreptococcussuis: an emerging zoonotic pathogen: part 1[J]. Future Microbiology, 2014, 9(4): 441-444.

[2] Fittipaldi N, Segura M, Grenier D,etal. Virulence factors involved in the pathogenesis of the infection caused by the swine pathogen and zoonotic agentStreptococcussuis[J]. Future Microbiology, 2012, 7(2): 259-279.

[3] 簡(jiǎn)娟娟, 劉 利, 王 維. 豬鏈球菌2型感染的臨床特征和治療[J]. 現(xiàn)代畜牧科技, 2015 (2): 69-69.

Jian J J, Liu L, Wang W. Clinical characteristics and treatment ofStreptococcussuistype 2 infection[J]. Modern Animal Husbandry Science & Technology, 2015 (2): 69-69.

[4] Goyette-Desjardins G, Auger J P, Xu J,etal.Streptococcussuis, an important pig pathogen and emerging zoonotic agent-an update on the worldwide distribution based on serotyping and sequence typing[J]. Emerging Microbes & Infections, 2014, 3(6): e45.

[5] Kerdsin A, Dejsirilert S, Puangpatra P,etal. Genotypic profile ofStreptococcussuisserotype 2 and clinical features of infection in humans, Thailand[J]. Emerging Infectious Diseases, 2011, 17(5): 835-842.

[6] Sriskandan S, Slater J D. Invasive disease and toxic shock due to zoonoticStreptococcussuis: an emerging infection in the East?[J]. PLoS Med, 2006, 3(5): e187.

[7] Lun Z R, Wang Q P, Chen X G,etal.Streptococcussuis: an emerging zoonotic pathogen [J]. The Lancet Infectious Diseases, 2007, 7(3): 201-209.

[8] Butler J E, Zhao Y, Sinkora M,etal. Immunoglobulins, antibody repertoire and B cell development[J]. Developmental & Comparative Immunology, 2009, 33(3): 321-333.

[9] Ochsenbein A F, Zinkernagel R M. Natural antibodies and complement link innate and acquired immunity [J]. Immunology Today, 2000, 21(12): 624-630.

[10] Butler J E, Sun J, Navarro P. The swine Ig heavy chain locus has a single JH and no identifiable IgD[J]. International Immunology, 1996, 8(12): 1897-1904.

[11] Seele J, Singpiel A, Spoerry C,etal. Identification of a novel host-specific IgM protease inStreptococcussuis[J]. Journal of Bacteriology, 2013, 195(5): 930-940.

[12] Seele J, Beineke A, Hillermann L M,etal. The immunoglobulin M-degrading enzyme ofStreptococcussuis, IdeSsuis, is involved in complement evasion[J]. Veterinary Research, 2015, 46(1): 45-59.

[13] 高尚慶, 雷連成, 韓文瑜. 豬鏈球菌 2 型基因工程疫苗研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2007 (2): 33-35.

Gao S Q, Lei L C, Han W Y. Progress in the research of gene￣tically engineering vaccine ofStreptococcussuisserotype 2[J]. Biotechnology Bulletin, 2007 (2): 33-35.

[14] Okura M, Takamatsu D, Maruyama F,etal. Genetic analysis of capsular polysaccharide synthesis gene clusters from all serotypes ofStreptococcussuis: potential mechanisms for generation of capsular variation[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2013, 79(8): 2796-2806.

[15] 馬建華, 魏建忠. 豬鏈球菌毒力因子研究進(jìn)展[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2014, 35(8): 95-99.

Ma J H, Wei J Z. Progress on virulence factors ofStreptococcussuis[J]. Progress in Veterinary Medicine, 2014, 35(8): 95-99.

[16] Lei B, DeLeo F R, Hoe N P,etal. Evasion of human innate and acquired immunity by a bacterial homolog of CD11b that inhibits opsonophagocytosis[J]. Nature Medicine, 2001, 7(12): 1298-1305.

[17] 曲光剛, 楊金芳, 李茂峰, 等. 豬鏈球菌Sao-M和IdeSsuis蛋白的原核表達(dá)與反應(yīng)原性分析[J]. 中國(guó)獸藥雜志, 2016, 50(6): 1-4.

Qu G G, Yang J F, Li M F,etal. Expression and Western blotting analysis ofStreptococcussuisSao-M and IdeSsuis[J]. Chinese Journal of Veterinary Drug, 2016, 50(6): 1-4.