魯歡，湯水福，陳剛毅，蘇保林，詹冬香，吳興波，王超，羅月中

特發(fā)性膜性腎?。↖MN）是原發(fā)性腎小球腎炎的常見病理類型，也是原發(fā)性腎病綜合征（NS）最常見的原因，占原發(fā)性NS的30%～40%［1］。病理診斷為膜性腎?。∕N）后，應(yīng)首先排除繼發(fā)因素，才可以診斷為IMN［2］。IMN發(fā)病率高、影響范圍廣，可累及不同年齡段、任何種族人群［1，3］。IMN的主要臨床表現(xiàn)為NS，自然病程差異較大，雖然30%左右的患者可自發(fā)緩解，但30%～50%的患者會(huì)進(jìn)展至腎衰竭［4-5］?；颊叱Ｒ蚋叨人[影響工作和生活，出現(xiàn)各種嚴(yán)重致殘、致死并發(fā)癥，需進(jìn)行腎臟替代治療，給社會(huì)、家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)。IMN在組織學(xué)方面與腎小球足細(xì)胞受損直接相關(guān)。然而，至今仍未發(fā)現(xiàn)治療本病的特效藥。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)IMN與脾腎陽虛密切相關(guān)，應(yīng)用溫陽利水方治療IMN取得較好效果［6］。足細(xì)胞M型磷脂酶A2受體（PLA2R）是成人IMN的靶抗原之一［7-9］，血清抗PLA2R（anti-PLA2R）水平與脾腎陽虛IMN存在一定關(guān)聯(lián)［10］，為進(jìn)一步探討溫陽利水方的作用機(jī)制，本研究擬采用首次確診為IMN、血清anti-PLA2R陽性、脾腎陽虛患者的血清，與小鼠永生化足細(xì)胞（以下統(tǒng)稱足細(xì)胞）共孵育，制備足細(xì)胞損傷的脾腎陽虛IMN體外模型，觀察溫陽利水方水提物對(duì)損傷小鼠足細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.1.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.1.1.1 MN的診斷標(biāo)準(zhǔn) MN是以腎小球基底膜（GBM）上皮細(xì)胞下免疫復(fù)合物沉積伴GBM彌漫增厚為特征的一組疾病，腎組織免疫熒光特點(diǎn)是以IgG、C3為主沿毛細(xì)血管壁顆粒樣沉積，可伴有其他免疫球蛋白沉積，但強(qiáng)度較弱［2］。

1.1.1.2 IMN的診斷標(biāo)準(zhǔn) 符合上述MN的診斷標(biāo)準(zhǔn)，且臨床上排除系統(tǒng)性紅斑狼瘡、感染、腫瘤及藥物等繼發(fā)性膜性腎?。⊿MN）。

1.1.2 中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照2006年中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)腎病分會(huì)《原發(fā)性腎病綜合征的診斷、辨證分型及療效評(píng)定（試行方案）》［11］的辨證標(biāo)準(zhǔn)，主癥：神疲乏力、或有面浮肢腫、或有畏寒；次癥：少氣懶言、腰酸身重、或自汗、易感冒；舌：胖、或舌邊有齒痕；脈：虛無力（弱、濡、軟）；符合2項(xiàng)主癥和2項(xiàng)次癥，參照舌脈，可診斷為脾腎陽虛。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 MPC5小鼠足細(xì)胞系由美國Baylor醫(yī)學(xué)院Danesh教授惠贈(zèng)，廣東省人民醫(yī)院史偉教授轉(zhuǎn)贈(zèng)。

1.2.2 中藥 根據(jù)《傷寒論》和《中國藥典》，溫陽利水方由制附子15 g、白術(shù)45 g、白芍30 g、茯苓30 g、生姜15 g、黃芪30 g組成，以上藥物均購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房。

1.2.3 脾腎陽虛IMN患者和正常人血清 2015年2—3月，選取在廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎病科住院，首次腎穿刺活檢確診為IMN、血清anti-PLA2R陽性、脾腎陽虛的患者28例，采集清晨空腹靜脈血。同時(shí)間段，采集30例健康志愿者清晨空腹靜脈血。本研究遵循倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，受試者均簽署知情同意書，本研究方案通過廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核，完成臨床試驗(yàn)透明化注冊(cè)（ChiCTROCH-14005137）。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 RPMI-1640、Ⅰ型鼠尾膠原（美國Corning Incorporated），澳洲胎牛血清（FBS）、0.05%胰蛋白酶（美國Gibco公司），重組小鼠干擾素γ（INF-γ）（以色列ProSpec），PBS緩沖液（美國Hyclone公司），CCK-8試劑盒（日本Dojindo），多聚甲醛、氫氧化鈉、Triton X-100（廣州化學(xué)試劑廠），Rhodamine Phalloidin（美國 Cytoskeleton），RNA Extraction Kit、PrimeScriptTM RT Master Mix、SYBR? Premix Ex TaqTM Ⅱ（ 日 本 Takara），PCR Forward Prime、PCR Reverse Prime（美國 Invitrogen），多通道移液器（德國Eppendorf），高速冷凍離心機(jī)（美國SIGMA），CO2培養(yǎng)箱（美國Shellab），加熱磁力攪拌器（德國IKA），精密天平、pH計(jì)（德國Sartorius），量筒（中國BOMEX公司），多功能酶標(biāo)儀、微量檢測(cè)板（美國Thermo Scientific），倒置熒光顯微鏡（德國Leica），超純水系統(tǒng)（美國Millipore），電子細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、T-100 regular PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 P22足細(xì)胞培養(yǎng) MPC5小鼠足細(xì)胞復(fù)蘇后，用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，1 U/ml重組小鼠INF-γ在5%CO2、33 ℃培養(yǎng)箱誘導(dǎo)增殖4～5 d。提前用Ⅰ型鼠尾膠原包被培養(yǎng)皿。待細(xì)胞生長融合至80%～85%，用0.05%胰蛋白酶消化，傳代至Ⅰ型鼠尾膠原預(yù)包被的培養(yǎng)皿，轉(zhuǎn)入5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱。含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化8～14 d，分化成熟后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 脾腎陽虛IMN患者和健康志愿者血清制備 具體制備方法見文獻(xiàn)［12］。

1.3.3 溫陽利水方水提物制備 加6倍量超純水分別浸泡制附子及其余藥物30 min，先煎制附子1 h，后加入其余藥物及浸泡液一起煎煮，煮沸后再煎煮40 min，過濾，收集濾液；加4倍量超純水于上述藥渣中再次煎煮，煮沸后再煎煮30 min，過濾，收集濾液。合并濾液，過濾，8 000 r/min離心5 min（離心半徑10 cm），過濾，80 ℃下減壓，濾液濃縮至浸膏，用超純水定容至165 ml，即終濃度為1 g/ml。依次過0.45 μm和0.22 μm針頭濾器，除顆粒雜質(zhì)、滅菌。-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 CCK-8試劑盒檢測(cè)溫陽利水方水提物的氧化還原性取96孔板，設(shè)RPMI-1640培養(yǎng)基組和RPMI-1640培養(yǎng)基加溫陽利水方水提物組，前者每孔添加RPMI-1640培養(yǎng)基100 μl，后者每孔添加RPMI-1640培養(yǎng)基100 μl和溫陽利水方水提物10 μl，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱孵育20 h后，每孔加CCK-8 10 μl，孵育4 h后，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處吸光度（OD值）。

1.3.5 CCK-8試劑盒檢測(cè)溫陽利水方水提物對(duì)足細(xì)胞增殖能力的影響 取分化成熟的P22足細(xì)胞，同步化24 h后，制備細(xì)胞懸液，取10 μl至細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，以8 000個(gè)細(xì)胞/孔的密度將細(xì)胞懸液接種于96孔板，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基補(bǔ)足至100 μl/孔。培養(yǎng)24 h后，每孔加入提前用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋至相應(yīng)濃度的溫陽利水方水提 物 10 μl， 設(shè) 0、1、2、4、8、10、20、40、60、80、100 mg/ml溫陽利水方水提物組共11組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱孵育20 h后，每孔加CCK-8 10 μl，孵育4 h后，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處OD值。不含細(xì)胞的完全培養(yǎng)基空白孔調(diào)零。

1.3.6 制備體外模擬足細(xì)胞損傷的IMN脾腎陽虛模型 取分化成熟的P22足細(xì)胞，同步化24 h后，制備細(xì)胞懸液，取10 μl至細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，以8 000個(gè)細(xì)胞/孔的密度將細(xì)胞懸液接種于96孔板，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基補(bǔ)足至100 μl/孔。培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)液，每孔加入含不同比例的脾腎陽虛IMN患者和/或健康志愿者血清的RPMI-1640培養(yǎng)基100 μl，對(duì)照組：健康志愿者血清10 μl+RPMI-1640培養(yǎng)基90 μl；5% IMN血清組：脾腎陽虛IMN患者血清5 μl+健康志愿者血清5 μl+RPMI-1640培養(yǎng)基90 μl；7.5% IMN血清組：脾腎陽虛IMN患者血清7.5 μl+健康志愿者血清2.5 μl+RPMI-1640培養(yǎng)基90 μl；10%IMN血清組：脾腎陽虛IMN患者血清10 μl+RPMI-1640培養(yǎng)基90 μl；每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱孵育20 h，每孔加CCK-8 10 μl，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處OD值。不含細(xì)胞的完全培養(yǎng)基空白孔調(diào)零。

1.3.7 脾腎陽虛IMN患者血清和或溫陽利水方水提物與足細(xì)胞共孵育

1.3.7.1 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)P22足細(xì)胞骨架蛋白F-actin 取分化成熟的P22足細(xì)胞，同步化24 h后，制備細(xì)胞懸液，取10 μl至細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，以50 000個(gè)細(xì)胞/孔的密度將細(xì)胞懸液接種于6孔板，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基補(bǔ)足至2 ml/孔。設(shè)正常對(duì)照組，模型組，2、4、8 mg/ml溫陽利水方水提物組，共5組，每組3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)液，1×PBS洗2次。按照分組，每孔加入含10%健康志愿者或10%脾腎陽虛IMN患者血清的RPMI-1640培養(yǎng)基和不同濃度溫陽利水方水提物，至總體積2 ml，具體添加方法見表1。5% CO2、37 ℃分別孵育24 h和48 h。棄去培養(yǎng)基，37 ℃預(yù)熱的PBS洗一次，4 ℃預(yù)冷的4%多聚甲醛室溫固定20 min，1×PBS洗滌5 min×3次，0.3%的Triton X-100室溫透化細(xì)胞膜10 min，1×PBS洗滌5 min×2次，每孔添加200 μl的100 nmol/L的羅丹明-鬼筆環(huán)肽，室溫避光孵育30 min后，PBS洗滌5 min×3次，立即上鏡觀察骨架蛋白F-actin。

1.3.7.2 qRT-PCR檢測(cè)各組Caspase-3 mRNA表達(dá)水平 取分化成熟的P22足細(xì)胞，同步化24 h后，制備細(xì)胞懸液，取10 μl至細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，以200 000個(gè)細(xì)胞/孔的密度將細(xì)胞懸液接種于6孔板，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基補(bǔ)足至2 ml/孔。設(shè)空白組，正常對(duì)照組，模型組，2、4、8 mg/ml溫陽利水方水提物組，總共6組。培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)液，1×PBS洗2次。按照分組，空白組加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基2 ml/孔，其余各組，每孔加入含10%健康志愿者或10%脾腎陽虛IMN患者血清的RPMI-1640培養(yǎng)基和不同濃度溫陽利水方水提物，至總體積2 ml，具體添加方法見表1。5% CO2、37 ℃分別孵育24 h和48 h。

表1 各組血清和溫陽利水方水提物添加方法Table 1 Details in adding serum and aqueous extract from Wenyanglishui Decoction

按Takara說明書步驟提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定其在230、260、280、320 nm處的OD值，按公式〔（樣品260 nm處的OD值-空白260 nm處的OD值）×40×20〕計(jì)算總RNA；按公式〔（樣品260 nm處的OD值-空白260 nm處的OD值）（/樣品280 nm處的OD值-空白280 nm處的OD值）〕，估測(cè)總RNA純度，該比值在1.8～2.1為合格。2%瓊脂糖電泳檢測(cè)總RNA完整性。按說明書，配制20 μl體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；配制25 μl體系進(jìn)行擴(kuò)增，qRT-PCR法檢測(cè)Caspase-3基因表達(dá)情況。反應(yīng)條件：95 ℃模板DNA預(yù)變性30 s、95 ℃變性5 s、56 ℃退火30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，65 ℃延伸5 s。內(nèi)參基因GAPDH及目的基因Caspase-3引物序列詳見文獻(xiàn)［12］。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每個(gè)樣本、每個(gè)基因均采用3復(fù)孔，采用雙△Ct的方法計(jì)算目的基因表達(dá)量，結(jié)果以2-??Ct表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以（±s）表示，兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊采用Dunnett T3檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 溫陽利水方水提物的氧化還原性 RPMI-1640培養(yǎng)基組和RPMI-1640培養(yǎng)基加溫陽利水方水提物組OD值分別為（0.22±0.07）、（0.13±0.01）。兩組OD值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.937，P＞0.05）。

2.2 溫陽利水方水提物對(duì)足細(xì)胞增殖能力的影響 0、1、2、4、8、10、20、40、60、80、100 mg/ml溫陽利水方水提物組OD值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。20、40、60、80、100 mg/ml溫陽利水方水提物組OD值低于0 mg/ml溫陽利水方水提物組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。1、2、4、8、10 mg/ml溫陽利水方水提物組OD值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見表2）。為便于觀察藥物濃度梯度作用，遂選取2、4、8 mg/ml作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)溫陽利水方水提物干預(yù)濃度。

表2 溫陽利水方水提物對(duì)足細(xì)胞增殖能力的影響（x±s）Table 2 Influence of aqueous extract from Wenyanglishui Decoction on the proliferation ability of mouse podocytes

2.3 不同濃度脾腎陽虛IMN患者血清對(duì)足細(xì)胞增殖能力的影響 對(duì)照組、5% IMN血清組、7.5% IMN血清組和10% IMN血清組OD值依次為（0.76±0.05）、（0.75±0.02）、（0.82±0.04）、（0.66±0.07）。4組OD值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5.85，P=0.02）。10% IMN血清組OD值低于對(duì)照組、5% IMN血清組、7.5% IMN血清組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.035、0.048、0.003）。遂選取10%脾腎陽虛IMN患者血清作為體外模擬足細(xì)胞損傷的血清濃度。

2.4 溫陽利水方水提物對(duì)脾腎陽虛IMN患者血清干預(yù)足細(xì)胞形態(tài)的影響 孵育24 h后，熒光顯微鏡下觀察示，正常對(duì)照組足細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白F-actin表達(dá)豐富，與細(xì)胞軸方向一致呈束狀分布，纖維稠密、強(qiáng)勁有力。模型組F-actin表達(dá)減少，與細(xì)胞軸方向不一致，部分?jǐn)嗔眩帕形蓙y。2 mg/ml溫陽利水方水提物組F-actin表達(dá)較模型組稍多，但較正常對(duì)照組仍明顯減少，與細(xì)胞軸方向不一致，部分?jǐn)嗔?，排列紊亂。4 mg/ml溫陽利水方水提物組F-actin表達(dá)較模型組增加，與細(xì)胞軸方向一致，但密度仍不及正常對(duì)照組。8 mg/ml溫陽利水方水提物組F-actin表達(dá)較模型組明顯增加，與細(xì)胞軸方向一致呈束狀分布（見圖1）。

孵育48 h后，熒光顯微鏡下觀察示，正常對(duì)照組足細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白F-actin表達(dá)尚可，與細(xì)胞軸方向一致呈束狀分布，未見纖維斷裂。模型組F-actin表達(dá)明顯減少，與細(xì)胞軸方向不一致，大部分纖維斷裂，排列雜亂。2 mg/ml溫陽利水方水提物組F-actin表達(dá)較模型組稍多，與細(xì)胞軸方向不一致，纖維斷裂，排列紊亂。4 mg/ml溫陽利水方水提物組F-actin表達(dá)較模型組增加，束狀與斷裂纖維并見，排列紊亂。8 mg/ml溫陽利水方水提物組F-actin表達(dá)較模型組明顯增加，可見較多呈束狀，與細(xì)胞軸方向一致（見圖1）。

圖1 溫陽利水方水提物與脾腎陽虛IMN患者血清共孵育24 h和48 h后對(duì)足細(xì)胞骨架蛋白F-actin的影響（×400）Figure 1 Immunofluorescence microscopy of F-actin cytoskeleton of podocytes of the 5 groups at 24 h and 48 h after incubation

2.5 溫陽利水方水提物對(duì)脾腎陽虛IMN患者血清干預(yù)足細(xì)胞Caspase-3 mRNA的影響 孵育24、48 h，5組Caspase-3 mRNA比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。孵育24 h，模型組Caspase-3 mRNA高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。孵育48 h，模型組Caspase-3 mRNA高于正常對(duì)照組、2 mg/ml溫陽利水方水提物組、8 mg/ml溫陽利水方水提物組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；孵育48 h，8 mg/ml溫陽利水方水提物組Caspase-3 mRNA低于2、4 mg/ml溫陽利水方水提物組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表3）。

3 討論

生物醫(yī)學(xué)研究和生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展需要依賴疾病模型的構(gòu)建，以探究疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制、篩選治療藥物和評(píng)價(jià)治療效果［13］。由于足細(xì)胞為終末分化細(xì)胞，原代培養(yǎng)成功率低，不能直接將腎病患者足細(xì)胞分離后體外培養(yǎng)以研究足細(xì)胞損傷的機(jī)制。從最開始的Heymman腎炎模型，到人類和小鼠永生化足細(xì)胞系的建立，經(jīng)歷了漫長的摸索過程，使得足細(xì)胞的體外研究成為可能。目前，對(duì)多種腎臟疾病發(fā)病機(jī)制的探索，多使用相應(yīng)疾病患者血清與足細(xì)胞體外共孵育，尋找此類患者血清中的致病因子。陳朝紅等［14］體外培養(yǎng)永生化小鼠足細(xì)胞，將含10%局灶節(jié)段性腎小球硬化（FSGS）患者血清的培養(yǎng)液與足細(xì)胞共孵育24 h，發(fā)現(xiàn)FSGS患者血清中存在循環(huán)因子直接導(dǎo)致足細(xì)胞損傷。

本研究構(gòu)建的脾腎陽虛IMN足細(xì)胞損傷模型，造模血清存在下述特殊之處：首先，必須是經(jīng)腎活檢和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)確診的IMN患者；其次，中醫(yī)辨證符合脾腎陽虛；最后，患者血清anti-PLA2R陽性。該模型可排除不同致病因素和發(fā)病過程的干擾，直接作用于IMN的靶細(xì)胞，較好的體現(xiàn)了中醫(yī)“病”“證”結(jié)合的特點(diǎn)，是建立脾腎陽虛IMN足細(xì)胞損傷的合適模型。本研究結(jié)果顯示，10% IMN血清組足細(xì)胞增殖能力較其他組明顯減弱，因此選用濃度為10%的脾腎陽虛IMN患者血清構(gòu)建足細(xì)胞損傷IMN脾腎陽虛模型。

足突是足細(xì)胞最重要的結(jié)構(gòu)和功能單位，內(nèi)含豐富的actin纖維，聚合為F-actin后形成微絲。足細(xì)胞病的共同特點(diǎn)是面對(duì)損傷應(yīng)激時(shí)，足突回縮和固有結(jié)構(gòu)弱化。目前，關(guān)于足細(xì)胞病最基本的分子表現(xiàn)形式，業(yè)內(nèi)廣泛認(rèn)可的是足細(xì)胞Factin骨架蛋白結(jié)構(gòu)的改變［15］。且已有學(xué)者證實(shí)，穩(wěn)定足細(xì)胞Factin骨架蛋白具有重要的治療作用［16］。本研究通過熒光顯微鏡觀察示，正常對(duì)照組F-actin表達(dá)豐富，與細(xì)胞軸方向一致呈束狀分布，纖維稠密、強(qiáng)勁有力；而模型組F-actin表達(dá)減少，與細(xì)胞軸方向不一致，部分?jǐn)嗔?，排列紊亂。在模型組基礎(chǔ)上，添加不同濃度溫陽利水方水提物后，F(xiàn)-actin表達(dá)較模型組增多，纖維斷裂和排列紊亂情況均有所改善。由此可見，脾腎陽虛IMN患者血清與足細(xì)胞共孵育后，可導(dǎo)致骨架蛋白F-actin正常結(jié)構(gòu)破壞；添加溫陽利水方水提物共孵育后，F(xiàn)-actin表達(dá)、纖維斷裂和重排現(xiàn)象均有所改善，提示溫陽利水方可緩解脾腎陽虛IMN患者血清致足細(xì)胞損傷。

F-actin骨架蛋白重排，可使局灶黏附激酶磷酸化，導(dǎo)致細(xì)胞核NF-κB上調(diào)［17］，促進(jìn)p53表達(dá)，后者可轉(zhuǎn)錄激活凋亡相關(guān)蛋白，在線粒體外膜形成小孔，導(dǎo)致細(xì)胞色素C等促凋亡蛋白從線粒體中釋放，其中，線粒體內(nèi)部釋放的pro-caspase-3直接參與凋亡信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)［18-19］。研究發(fā)現(xiàn)，Caspase-3的表達(dá)水平與各種腎臟固有細(xì)胞的凋亡、炎癥、纖維化密切相關(guān)［20］。張弢等［21］檢測(cè)不同腎小球腎炎患者腎活檢組織中Caspase-3的表達(dá)量，觀察到其主要表達(dá)在腎小球和腎小管細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，且與正常對(duì)照組、系膜增生性腎小球腎炎組相比，MN組Caspase-3表達(dá)量最高。本研究觀察到，孵育24 h和48 h后，模型組Caspase-3 mRNA均較正常對(duì)照組增加；提示IMN脾腎陽虛患者血清可誘導(dǎo)足細(xì)胞發(fā)生凋亡反應(yīng)。此外，與模型組比較，孵育48 h，2、8 mg/ml溫陽利水方水提物組Caspase-3 mRNA均降低，提示溫陽利水方水提物可通過下調(diào)Caspase-3 mRNA表達(dá)，緩解脾腎陽虛IMN患者血清導(dǎo)致的足細(xì)胞損傷反應(yīng)。

溫陽利水法是治療脾腎陽虛水濕泛濫水腫的中醫(yī)經(jīng)典療法，溫陽利水代表方“真武湯”自“醫(yī)圣”張仲景創(chuàng)制以來就被歷代醫(yī)家沿用至今。本研究所用溫陽利水方是在“真武湯”基礎(chǔ)上，羅月中教授結(jié)合多年臨床實(shí)踐觀察，調(diào)整藥材劑量、增加藥味制定而成。近年來，大量臨床和基礎(chǔ)研究均證實(shí)，黃芪具有較好的腎臟保護(hù)作用。如黃芪水提物可上調(diào)足細(xì)胞與基底膜之間黏附分子的表達(dá)［22］；黃芪甲苷抑制系膜細(xì)胞增殖，減輕體外培養(yǎng)足細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平［23］，通過抑制JNK和ERK1/2的活化，緩解補(bǔ)體膜攻擊復(fù)合物C5b-9對(duì)體外培養(yǎng)小鼠足細(xì)胞骨架蛋白和線粒體活化蛋白激酶的損傷［24］。亦有研究發(fā)現(xiàn)，真武湯水提物高效液相色譜（HPLC）特征圖譜大部分色譜峰來自白芍（占66.7%）［25］。本研究采用同樣的煎藥方法，提示水提液主要成分之一為白芍活性成分。體內(nèi)研究證實(shí)，白芍總苷具有促進(jìn)Bcl-2表達(dá)、下調(diào)Bax、Caspase-3 表達(dá)的作用［26］。

綜上所述，本研究構(gòu)建了脾腎陽虛IMN足細(xì)胞損傷模型，并予溫陽利水方水提物共孵育，直接模擬溫陽利水方對(duì)IMN脾腎陽虛足細(xì)胞病變的治療作用。借助細(xì)胞分子生物學(xué)方法，從細(xì)胞、分子、基因等不同層面，探討脾腎陽虛IMN患者血清對(duì)足細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響以及溫陽利水法干預(yù)的效應(yīng)及機(jī)制。結(jié)果提示溫陽利水方水提物可改善脾腎陽虛IMN患者血清致小鼠足細(xì)胞骨架蛋白F-actin重排，可能通過抑制Caspase-3 mRNA的表達(dá)發(fā)揮抗凋亡效應(yīng)。由于課題組未能成功獲得人永生化足細(xì)胞，無法探討IMN患者血清anti-PLA2R與足細(xì)胞PLA2R特異性結(jié)合后對(duì)足細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生的影響及作用機(jī)制，實(shí)屬遺憾。期待我國能早日自主構(gòu)建人永生化足細(xì)胞系，為明確IMN具體發(fā)病機(jī)制及過程、探索中藥作用環(huán)節(jié)提供新的途徑。

志謝：衷心感謝廣東省人民醫(yī)院史偉教授、章斌教授和張麗主治醫(yī)師及腎病科實(shí)驗(yàn)室的師弟師妹們！感謝廣州中醫(yī)藥大學(xué)嶺南醫(yī)學(xué)研究中心中醫(yī)骨傷科學(xué)實(shí)驗(yàn)室何偉教授、王海彬教授、詹冬香老師提供良好的實(shí)驗(yàn)環(huán)境。

作者貢獻(xiàn)：魯歡進(jìn)行文章的構(gòu)思和設(shè)計(jì)，文章的可行性分析，撰寫論文；魯歡、羅月中進(jìn)行論文的修訂，英文的修訂；魯歡、詹冬香進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作；魯歡、蘇保林、吳興波進(jìn)行資料整理、數(shù)據(jù)分析；蘇保林、王超進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；湯水福、陳剛毅、羅月中進(jìn)行質(zhì)量控制及審校，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。

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