白雪，寧宏

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科，沈陽 110001）

后發(fā)性白內(nèi)障（posterior capsule opacification，PCO）是晶體破損或晶體摘除術(shù)后，其殘余的皮質(zhì)或上皮細(xì)胞在后囊膜上發(fā)生的病理變化。研究［1］表明，PCO的發(fā)生是由眾多生長因子及細(xì)胞凋亡共同作用的。所以，現(xiàn)階段的重心是如何在促進(jìn)人晶狀體上皮細(xì)胞 （human lens epithelial cells，HLECs） 凋亡的同時抑制其增殖。作為新型的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白 （mammal target of rapamycin，mTOR） 抑制劑PP242，可以影響多種腫瘤細(xì)胞的發(fā)展［2］。既往的研究［3］已經(jīng)證明，PP242對HLECs的生長有抑制作用，同時有減弱促凋亡蛋白Bcl-2的作用。本研究用不同濃度PP242處理HLECs，觀察PP242對其凋亡的影響及凋亡蛋白Bax的變化，揭示 PP242對PCO的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

PP242 （美國Sigma公司） ，人晶狀體上皮細(xì)胞系SRA01/04細(xì)胞株 （中國北京中國科學(xué)院腫瘤研究所） ，胰蛋白酶、胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基 （美國Hyclone公司） ，Annexin V-FITC/PI 雙染流式細(xì)胞檢測試劑盒 （中國碧云天公司） ，細(xì)胞培養(yǎng)耗材 （美國Corning公司） ，兔抗人β-actin單克隆抗體、辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔lgG二抗 （美國Santa Cruz 公司） ，兔抗人Bax抗體 （美國Abcam 公司） ，β-actin mRNA引物、Bax引物 （中國上海生工生物工程有限公司） 。

1.2 細(xì)胞分組

對照組用含濃度為0 nmol/L PP242的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞；實驗組分別用含250、500、750、1 000 nmol/L PP242的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)時間均為48 h。

1.3 Annexin V/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率

用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，將制備的單細(xì)胞懸液加入15 mL離心管中，4 ℃的PBS洗2次。用250 μ L結(jié)合緩沖液將細(xì)胞懸浮，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×106/mL，取100 μ L放入檢測管中，加5 μ L Annexin V/-FITC和10 μ L PI溶液，混勻、室溫避光、孵育15 min。加入400 μ L PBS，上流式細(xì)胞儀檢測。

1.4 Western blotting 檢測經(jīng) PP242處理后SRA01/04的Bax蛋白表達(dá)情況

將各實驗組細(xì)胞低溫加入裂解液，離心（13 000 r/min、4 ℃） 15 min，測蛋白濃度。每孔取50 μ L樣品行10%SDS-PAGE電泳。轉(zhuǎn)膜，封閉2 h，4 ℃封一抗 （兔抗人Bax單克隆抗體） 12 h。TBST洗15 min，3次。室溫封二抗 （辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠抗體） 2 h，TBST洗15 min，3次。用 ECL化學(xué)發(fā)光法曝光膠片。

1.5 實時定量PCR檢測經(jīng)PP242處理后SRA01/04的Bax mRNA表達(dá)情況

用異硫氫酸胍-酚-氯仿法提取總RNA，測A260nm和A280nm，并計算RNA濃度。取濃度為500 ng/μ L RNA 2 μ L，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，行實時定量PCR。β-actin 上游引物序列：5’-GTGGACATCCGCAAAGAC-3’，下游引物 序 列：5’-AAAGGG TGTAACGCAACTAA-3’；Bax上游引物序列：5’-CCGATTCATCTACCCTGCTG-3’，下游引物序列：5’- TGAGCAATTCCAGAGGCAGT-3’。取2 μ L cDNA模板，設(shè)3個復(fù)孔，兩步法擴(kuò)增目的基因，40個循環(huán)行PCR反應(yīng)。計算各組 β-actin和Bax mRNA的相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件行統(tǒng)計分析，組間比較采用單因素方差分析，計量資料用x-±s表示，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Annexin V/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率

如圖1所示，左下區(qū)為Annexin V-FITC和PI均陰性，表示活細(xì)胞；左上區(qū)為PI陽性，表示死亡細(xì)胞；右下區(qū)為Annexin V-FITC陽性、PI陰性，表示早期凋亡細(xì)胞；右上區(qū)為Annexin V-FITC和PI均陽性，表示死亡細(xì)胞及中晚期凋亡細(xì)胞。各實驗組（250、500、750、1 000 nmol/L） 早期凋亡率分別為7.20%±0.36%、13.77%±0.21%、16.31%±0.20%和18.67%±0.49%，與對照組（5.93%±0.61%）比較，實驗細(xì)胞早期凋亡率明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P ＜0.05） 。

2.2 Western blotting法檢測經(jīng)PP242處理后SRA01/04的Bax蛋白表達(dá)情況

如圖2所示，實驗組Bax蛋白表達(dá)水平隨PP242濃度的增加而增加。各實驗組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P ＜ 0.05） 。

2.3 實時定量PCR檢測經(jīng)PP242處理后SRA01/04的Bax mRNA表達(dá)情況

各實驗組 （250、500、750、1 000 nmol/L） Bax mRNA相對表達(dá)量分別為2.157±0.125， 3.733±0.302，5.596±0.261和7.436±0.167，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P ＜ 0.05） 。提示Bax mRNA表達(dá)量隨PP242濃度的增加而增加。

3 討論

圖1 各組HLEC Annexin V+PI 雙染流式細(xì)胞分析散點圖Fig.1 Flow cytometry analysis of apoptosis in HLEC after treatment with PP242

圖2 免疫印跡法檢測經(jīng)PP242處理后SRA01/04的Bax蛋白表達(dá)情況Fig.2 Immunoblotting for Bax protein expression after treatment of cells with PP242

PCO是晶體摘除術(shù)后最常見的并發(fā)癥［4］。目前公認(rèn)的發(fā)病原因是由于手術(shù)中剩余的晶狀體上皮細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、晶狀體上皮細(xì)胞增生和移行造成后囊的皺縮，術(shù)后剩余的晶狀體上皮細(xì)胞移行過程中，形成微小細(xì)胞簇，導(dǎo)致了后囊膜的混濁和囊袋的皺縮和變形［3］。由于晶狀體手術(shù)的改良和人工晶狀體的更新，使PCO較前降低。目前治療PCO的主要方法是后囊膜截開術(shù)，但手術(shù)局限性高，術(shù)后并發(fā)癥嚴(yán)重 （視網(wǎng)膜脫離、黃斑水腫等）［5］。保守治療PCO已經(jīng)成為基礎(chǔ)研究的重點。多種炎性細(xì)胞因子及生長因子可以影響晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡，這跟腫瘤細(xì)胞相似。因此，抗腫瘤藥物是否可以用于PCO的防治是目前研究的熱點。

磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白 （phosphoinositide3-kinases/protein kinase B/mammal target of rapamycin，PI3K/AKT/mTOR） 通 路可以影響腫瘤細(xì)胞的生長［6］。激活mTOR通路對晶狀體上皮細(xì)胞有促進(jìn)增殖誘導(dǎo)凋亡的作用［7］。經(jīng)典的PI3K/AKT/mTOR通路經(jīng)典的抑制劑雷帕霉素，僅影響mTORC1即可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［8］。PP242對mTORC1和mTORC2均有影響，可以抑制mTOR的催化活性及其自身磷酸化［9］。因而，PP242誘導(dǎo)凋亡的作用更加顯著［10］。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡，由多種基因影響控制［11］。促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白共同存在于細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)?shù)蛲鲂盘柊l(fā)出時，2類蛋白的平衡模式被破壞，促調(diào)亡蛋白增多，細(xì)胞凋亡［12］。細(xì)胞凋亡由多種基因及細(xì)胞因子影響，主要有以下2種途徑：死亡受體通路和Bcl-2家族介導(dǎo)的線粒體通路［13］。本研究結(jié)果表明，進(jìn)入早期凋亡的細(xì)胞比例隨PP242濃度的增加而逐漸增加，提示PP242可以誘導(dǎo)HLECs凋亡，并隨著濃度增加而增強。

Bcl-2家族介導(dǎo)的線粒體通路在細(xì)胞凋亡中作用顯著［14］。在線粒體上，Bcl-2家族蛋白通過影響線粒體的穩(wěn)定性，從而影響細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族有2種蛋白：一種是以Bax代表的促凋亡蛋白，一種是以Bcl-2為代表的抗凋亡蛋白［15］。Bax主要在線粒體外膜起破壞膜完整性的作用。細(xì)胞接到凋亡信號后，Bax增加線粒體膜通透性，促凋亡蛋白及細(xì)胞因子進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞發(fā)生凋亡［16］。

本研究結(jié)果表明，HLECs中Bax蛋白及Bax mRNA的表達(dá)隨PP242濃度的增加而逐漸增強。因此，PP242使促凋亡基因Bax的表達(dá)增高，增加了Bax對HLECs凋亡的促進(jìn)作用。提示PP242是通過引起B(yǎng)ax的改變來促進(jìn)HLECs的凋亡，既而表明在PP242誘導(dǎo)的HLECs凋亡過程中有Bcl-2家族介導(dǎo)的線粒體通路的參與。

PP242可以誘導(dǎo)HLECs的凋亡，通過使促凋亡蛋白Bax的表達(dá)增加，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在PP242誘導(dǎo)的HLECs凋亡過程中有Bcl-2家族介導(dǎo)的線粒體通路的參與。然而，在本研究中僅觀察到在HLECs凋亡過程中，PP242使促凋亡蛋白 Bax表達(dá)增加，而在此過程中，PP242是否通過影響其他途徑誘導(dǎo)凋亡仍需要更多的研究來證明。

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