楊帆，陳英劍，亓敏，胡成進(jìn)

（1. 青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，山東青島 266033； 2. 濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)診斷科，濟(jì)南 250000 ）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，也是引起女性死亡的重要病因。全球癌癥2012年統(tǒng)計(jì)報(bào)告顯示，乳腺癌新發(fā)病例占女性惡性腫瘤新發(fā)病總數(shù)的25.0%，占惡性腫瘤死亡總數(shù)的15.0%［1］。液體芯片-飛行時(shí)間質(zhì)譜-ClinProt系統(tǒng)是基于質(zhì)譜技術(shù)開發(fā)的蛋白質(zhì)組學(xué)半定量分析系統(tǒng)［2］。目前，ClinProt系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于不同腫瘤的研究，如宮頸上皮內(nèi)瘤變趨勢預(yù)測，食管鱗狀細(xì)胞癌和健康對照的質(zhì)譜表達(dá)譜圖的建立等［3-4］。本研究應(yīng)用液體芯片-基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrixassisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS-ClinProt）系統(tǒng)對乳腺癌患者和健康對照血清蛋白肽譜進(jìn)行采集分析，根據(jù)差異蛋白建立乳腺癌診斷模型，評估該模型對于乳腺癌早期診斷的臨床價(jià)值，同時(shí)尋覓具有乳腺癌表達(dá)特異性的血清蛋白質(zhì)/多肽。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病歷資料：收集2015年1月至2016年7月濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院甲狀腺乳腺外科收治的140例乳腺癌女性患者的血清標(biāo)本作為病例組，年齡29～68歲，平均（43.23±11.89） 歲，所有病例均經(jīng)術(shù)后病理學(xué)金標(biāo)準(zhǔn)確診，術(shù)前均未進(jìn)行臨床治療；收集濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院病例組同期60例健康體檢女性的血清標(biāo)本作為健康對照組，年齡24～62歲，平均 （41.53±14.34）歲，既往無乳腺癌及相關(guān)疾病，體檢未見其他惡性疾病。2組標(biāo)本均來自女性，且年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05） ，將研究對象隨機(jī)分層抽樣分為建模組 （乳腺癌患者120例和健康女性40例） 和驗(yàn)證組（乳腺癌患者20例和健康女性20例） ，見表1。

表1 病例組和健康對照組臨床資料比較Tab.1 Comparison of clinical data between the breast cancer and healthy control groups

1.1.2 標(biāo)本采集和預(yù)處理：用含有分離膠的采血管采集空腹靜脈全血5 mL，室溫靜置30 min后離心，收集血清，將血清按照200 μL/EP管分裝置于-80 ℃冰箱保存，避免反復(fù)凍融。

1.1.3 試劑與儀器：MALDI-TOF-MS儀及原裝進(jìn)口配套的試劑和定標(biāo)品 （autoflex speedTMTOF/TOF，德國BRUKER公司） ；弱陽離子交換磁珠分析試劑盒（MB-WCX） 和標(biāo)準(zhǔn)蛋白/多肽 （德國BRUKER公司） ；三氟乙酸、乙腈、丙酮 （美國Sigma-Aldrich公司） ；全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光分析檢測儀 （combs 6001，瑞士羅氏公司） 。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)：利用MALDI-TOF-MS采集標(biāo)準(zhǔn)品內(nèi)已知分子量化合物的質(zhì)譜圖，反復(fù)疊加5次以上，同時(shí)確保已校準(zhǔn)成分的分辨率達(dá)到ClinProt系統(tǒng)要求的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 重復(fù)性檢測：利用弱陽離子交換磁珠吸附10例樣本 （5例乳腺癌血清、5例健康女性血清） 的低豐度蛋白/多肽，經(jīng)MALDI-TOF-MS和ClinProt Tools v3.0軟件分析后，比較反復(fù)測定質(zhì)譜圖和平均變異系數(shù)（coefficient of variation，CV） ，觀察磁珠對高豐度蛋白去除能力及對目標(biāo)低豐度蛋白的提取效果和譜圖質(zhì)量，從而判斷該方法的重復(fù)性。

1.2.3 MB-WCX吸附血清低豐度蛋白：采用表面積大、吸附能力強(qiáng)的弱陽離子交換磁珠吸附血清標(biāo)本中的低豐度蛋白質(zhì)/多肽。 （1） 磁珠吸附樣本，取10 μL弱陽離子磁珠和同體積的結(jié)合緩沖液混勻，加入5 μL 待測血清，再次混勻；室溫靜置5 min后，利用磁性分離器分離磁珠與上清，棄去上清； （2） 洗滌磁珠，加入100 μL 洗滌緩沖液，在磁性分離器相鄰位置反復(fù)移動(dòng)10次直至磁珠與上清徹底分離，棄去上清，重復(fù)該洗滌步驟2次； （3） 洗脫磁珠，加入5 μL洗脫緩沖液，反復(fù)吹打10次，在磁珠分離器中靜置2 min，使磁珠與上清徹底分離，收集分離后的上清液，向樣品管中加入5 μL穩(wěn)定緩沖液，充分混勻后，24 h內(nèi)利用MALDI-TOF-MS進(jìn)行分析。

1.2.4 MALDI-TOF-MS采集標(biāo)本質(zhì)譜圖：稀釋1 μL多肽樣品溶液于10 μL混合基質(zhì)溶液中，反復(fù)顛倒5次以上，直至充分混合；加1 μL混合溶液點(diǎn)靶，室溫風(fēng)干后激光電離 （激光頻率60 Hz） ，采集每一個(gè)納入血清的蛋白肽表達(dá)譜圖。

1.2.5 生物信息學(xué)及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：將MALDITOF-MS采集的所有標(biāo)本質(zhì)譜圖通過flexAnalysis軟件進(jìn)行標(biāo)峰，并檢查已采集圖譜質(zhì)量。將質(zhì)譜圖信息按照分組調(diào)入ClinProt v3.0軟件進(jìn)行校正和統(tǒng)計(jì)分析，不同質(zhì)荷比分子的峰強(qiáng)度為量化指標(biāo)，獲得2組平均質(zhì)譜圖、準(zhǔn)膠圖、峰統(tǒng)計(jì)列表。根據(jù)不同質(zhì)荷比蛋白/多肽峰強(qiáng)度的表達(dá)差異情況，選擇基因遺傳算法 （genetic algorithm，GA）、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法 （neural network algorithm，SNN） 和快速分類算法 （fast classification algorithm，QC） 分別建立模型，計(jì)算其識別率并進(jìn)行雙盲驗(yàn)證，選取診斷效能最強(qiáng)的模型。

1.2.6 血清癌胚抗原 （carcinoembryonic antigen，CEA） 和癌抗原153 （cancer antigen 153，CA153） 的檢測：使用羅氏combs 6001全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光分析檢測儀檢測血清中CEA和CA153的含量。CEA和CA153的臨界參考值分別為5 ng/mL和25 U/mL。

2 結(jié)果

2.1 重復(fù)性檢測結(jié)果

結(jié)果顯示，5次采集的質(zhì)譜圖基本一致，病例組平均CV為21.5%，對照組為23.5%，2組CV均小于30%，表明該方法重復(fù)性良好［4］，可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 差異蛋白定量分析

圖1 病例組 （紅色） 與對照組 （綠色） 平均總質(zhì)譜圖Fig.1 Average total mass spectrogram for the tumor group （red） and control group （green）

應(yīng)用ClinProt v3.0軟件對病例組和對照組相對分子量（10～100）×103的蛋白質(zhì)譜圖進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到2組的總平均譜圖 （圖1） ，根據(jù)總平均譜圖同一質(zhì)荷比峰強(qiáng)度及峰面積的不同，發(fā)現(xiàn)35個(gè)表達(dá)明顯差異的蛋白質(zhì)/多肽 （P ＜ 0.01） （信噪比S/N＞5） ，其中7個(gè)蛋白質(zhì)/多肽表達(dá)上調(diào)，28個(gè)表達(dá)下調(diào)。其中Mass 5 159.73，Mass 1 865.76，Mass 5 749.51，Mass 6 301.27表達(dá)差異最顯著，可達(dá)到P ＜ 0.000 001（表2） 。

表2 ClinProt差異蛋白峰統(tǒng)計(jì)參數(shù)Tab.2 Statistical parameters of ClinProt differential protein peaks

2.3 建立乳腺癌診斷模型

不同分析方法建立診斷模型的診斷效能均不同，GA、SNN和QC對乳腺癌的的識別準(zhǔn)確率分別為95.0%、90.0%、90.8%。選擇最優(yōu)的GA以4個(gè)差異蛋白質(zhì) （Mass 1 569、3 934、5 750、7 765） 建立乳腺癌診斷模型，建立模型的4個(gè)蛋白質(zhì)曲線下面積依次為0.75、0.76、0.83、0.86 （圖2） 。雙盲驗(yàn)證結(jié)果顯示其對乳腺癌識別率為85%。診斷乳腺癌的靈敏度為95.0%，特異度為92.5%，Youden 指數(shù)為0.875。

2.4 診斷模型與CEA、CA153聯(lián)合診斷比較

圖2 差異蛋白診斷乳腺癌的受試者工作特征曲線圖Fig.2 The ROC curve of differential protein in the diagnosis of breast cancer

將建立成功的診斷模型與納入樣本CEA、CA153的聯(lián)合診斷結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，該模型對乳腺癌的診斷靈敏度、準(zhǔn)確率以及Youden指數(shù)均優(yōu)于現(xiàn)臨床血清標(biāo)志物CEA、CA153聯(lián)合診斷 （表3） ，其中靈敏度最為顯著，證明該診斷模型對乳腺癌的早期篩查具有更高的效能。

表3 診斷模型與乳腺癌常用血清學(xué)標(biāo)志物評價(jià)指標(biāo)的比較（%）Tab.3 Comparison between the parameters for the diagnostic model and common breast cancer markers（%）

3 討論

乳腺癌患者早期無典型臨床癥狀和體征，缺乏高靈敏度特異性的腫瘤標(biāo)志物，因此對高危人群常常無法進(jìn)行高效篩查和早期診斷，導(dǎo)致中后期就診，生存率降低［5-6］。目前國內(nèi)乳腺癌診斷主要以影像學(xué)檢查和病理金標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)，但兩者費(fèi)用較高，且病理采樣對患者身體存在危害。相比之下，腫瘤的血清學(xué)檢測則具有操作簡便、費(fèi)用低的優(yōu)點(diǎn)，可用于疾病篩查、早期診斷、復(fù)發(fā)及預(yù)后監(jiān)測等。目前，CEA和CA153等已作為乳腺癌血清標(biāo)志物開始應(yīng)用于臨床乳腺癌患者的輔助診斷和預(yù)后判斷，但多項(xiàng)研究表明兩者靈敏度以及早期篩查準(zhǔn)確率都不夠理想［7-8］。因此，尋找乳腺癌新型標(biāo)志物的問題亟待解決。

乳腺癌的發(fā)生發(fā)展是受多因素影響的多通路級聯(lián)反應(yīng)，過程復(fù)雜且伴隨著體內(nèi)多種蛋白的變化。利用液體蛋白芯片-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)能夠做到對臨床血清標(biāo)本蛋白肽進(jìn)行快速直接的檢測，去除血清中的高豐度蛋白，對低豐度表達(dá)蛋白進(jìn)行高通量分析，篩選高靈敏度特異性的生物標(biāo)志物，并根據(jù)血清差異蛋白肽信息建立診斷模型，可以為乳腺癌早期診斷提供新的思路。

本研究應(yīng)用液體蛋白芯片-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)分析了120例乳腺癌患者和40例健康女性的血清蛋白質(zhì)譜，發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者和健康女性血清中蛋白成分差異較大，多種蛋白質(zhì)/多肽顯示出了腫瘤特異性，經(jīng)后續(xù)鑒定認(rèn)為極有可能成為乳腺癌新型生物標(biāo)志物。根據(jù)比較結(jié)果選擇診斷效能最佳的GA建立乳腺癌診斷模型，結(jié)果證實(shí)該模型診斷識別率較高，能夠有效區(qū)分乳腺癌和健康女性標(biāo)本，且診斷靈敏度、準(zhǔn)確率和Youden指數(shù)均高于CEA和CA153的單獨(dú)或聯(lián)合診斷效能。

本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，擴(kuò)大樣本量對應(yīng)用液體蛋白芯片-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)建立的乳腺癌診斷模型進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。證明利用該方法建立的乳腺癌診斷模型有潛力成為切實(shí)可行并值得臨床廣泛推廣的新型診斷方法。但本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)2次研究中得到的差異蛋白表達(dá)情況存在波動(dòng)，未能達(dá)到一致，懷疑可能與患者病情發(fā)展程度有關(guān)，需要通過進(jìn)一步研究找到差異源頭，對明顯差異蛋白在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)作用進(jìn)行進(jìn)一步探討。

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