賀 美 徐 艷 姚芳玲 鄒 純 于 潁 黎 明

(中南大學基礎(chǔ)醫(yī)學院免疫學系,長沙 410078)

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化蛋白4(Signal transducer and activator of transcription 4,STAT4)屬于STAT核轉(zhuǎn)錄因子家族，最初是通過與其他STAT基因交叉雜交克隆獲得[1]。

多種細胞因子如IL-12、IFN-α/β、IL-23及IL-17等與細胞膜相應(yīng)受體結(jié)合，使與受體結(jié)合的酪氨酸激酶JAK2和Tyk2活化，后者使STAT4的693位酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，導(dǎo)致STAT4從受體-JAK-STAT4復(fù)合物上脫落，發(fā)生同源二聚化，移位入核，與DNA結(jié)合，發(fā)揮其促轉(zhuǎn)錄活性，啟動下游靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，介導(dǎo)一系列細胞生物學效應(yīng)[2]，包括Th細胞、NK細胞、肥大細胞和樹突狀細胞的分化、IFN-γ分泌等等，也與自身免疫性疾病如類風濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、系統(tǒng)性硬化病的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)[3-9]。研究發(fā)現(xiàn)STAT4在蛋白水平的修飾除開C-端693位發(fā)生酪氨酸磷酸化外，還可以在721位發(fā)生絲氨酸磷酸化[10,11]。因此，以STAT4 C-端多肽為底物，通過體外激酶實驗有可能發(fā)現(xiàn)一些新的蛋白激酶，從而有可能發(fā)現(xiàn)新的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，進一步探討這一新的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的生物學意義，將有助于探討細胞生物學行為，為疾病預(yù)防、診斷、治療提供新的分子靶標。

我們根據(jù)STAT4的功能域結(jié)構(gòu)、通過PCR擴增獲得STAT4 C-端編碼565-748氨基酸(Amino acid,aa)多肽的截短基因片段，將之亞克隆到pET-28a(+)載體中,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21并誘導(dǎo)融合蛋白表達，通過變性和復(fù)性策略，從包涵體中獲得目的蛋白，最后采用親和層析、透析的方法獲得純化蛋白，為后續(xù)體外激酶實驗等研究提供實驗材料。

1 材料與方法

1.1實驗材料、試劑 核酸工具酶購自NEB和Qiagen公司；抗His標簽兔單克隆抗體購自Millipore公司；DNA快速純化/回收試劑盒、Plasmid mini kit質(zhì)粒抽提試劑盒均購自O(shè)mega Bio-Tek公司；His標簽蛋白純化試劑盒來自碧云天公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG購自Santa Cruz Biotechnology；ECL發(fā)光試劑盒來自Pierce Chemical 公司；其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。感受態(tài)大腸桿菌DH5α和感受態(tài)大腸桿菌BL21購自碧云天公司。使用的質(zhì)粒包括：pET-28a(+)、pEGFP-STAT4。pEGFP-STAT4質(zhì)粒已經(jīng)測序驗證[12]。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計 根據(jù)Genbank公布的STAT4的cDNA系列(基因登錄號：NM_003151.3 )，設(shè)計并合成PCR擴增編碼STAT4(565-748aa)肽段的基因的上下游引物，上游引物：5′-CGGGATCCATTC-TTCCCCTTTG-3′,下游引物：5′-CCGCTCGAGTTTC-AGCAGAATAAGG-3′。下劃線部分為BamHⅠ和XhoⅠ酶切接頭。

1.2.2目的基因的獲取 以測序鑒定正確的pEGFP-STAT4[12]為模板，以pfu 為高保真多聚酶，用PCR方法擴增STAT4(565-748aa)基因片段，命名為STAT4-4。PCR擴增條件：98℃ 30 s預(yù)變性，94℃ 30 s，64℃ 30 s，72℃ 60 s，共30個循環(huán)，之后72℃鏈延伸8 min，16℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳。按凝膠DNA回收試劑盒說明書進行切膠回收。

1.2.3pET-28a-STAT4-4表達載體的構(gòu)建及鑒定 使用BamHⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶將載體pET-28a(+)和STAT4-4基因PCR產(chǎn)物分別進行雙酶切，電泳后膠回收，用T4 DNA 連接酶連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α，挑取細菌克隆擴增，提取質(zhì)粒進行雙酶切鑒定并送華大基因公司測序。序列正確的質(zhì)粒即為原核表達質(zhì)粒pET-28a-STAT4-4。

1.2.4融合蛋白His-tagged-STAT4(565-748aa)的誘導(dǎo)表達 將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌BL21中，挑取單克隆菌至5 ml含有10 μg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，置于搖床上220 r/min，37℃過夜。以1∶50的比例轉(zhuǎn)接細菌至50 ml含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至A600達到0.5～0.7之間，加入不同濃度的IPTG，放置搖床上25℃或37℃、220 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h，取菌液沉淀加5×上樣緩沖液，100℃煮沸5 min，行SDS-PAGE凝膠電泳，考馬斯亮藍染色檢測融合蛋白的表達。

1.2.5目的蛋白誘導(dǎo)條件的選擇 將表達菌pET-28a-STAT4-4 37℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，次日以1∶50轉(zhuǎn)接，振蕩培養(yǎng)至A600為0.5左右，取培養(yǎng)的菌液15 ml，加入不同濃度的IPTG，37℃或25℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，4℃ 10 000 r/min離心5 min，收集菌液，200 μl PBS重懸細菌，加入50 μl 5×上樣緩沖液，超聲粉碎，超聲功率為30%～40%，每次超聲10 s，間隔10 s，共超聲處理10次。加熱煮沸5 min，10 000 g離心5 min,取上清和沉淀各10 μl進行10%SDS-PAGE凝膠電泳，考馬斯亮藍染色并脫色。

1.2.6包涵體的復(fù)性及純化 將表達菌以1∶50轉(zhuǎn)接500 ml LB培養(yǎng)液，200 r/min振蕩培養(yǎng)至A600為0.5左右，加入IPTG至終濃度為0.1 mmol/L，25℃ 下誘導(dǎo)表達4 h。離心收集IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)的細菌，用預(yù)冷PBS洗2遍，去上清，在沉淀中加入非變性裂解液(50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，pH8.0)3 ml，充分重懸菌體，再加入溶菌酶至終濃度為1 mg/ml，冰上放置30 min。冰上超聲裂解細菌。超聲功率為30%～40%，每次超聲10 s，間隔10 s，共超聲處理10次。4℃、10 000 g離心10 min，去上清，沉淀即為包涵體蛋白。加入2 ml變性緩沖液(pH8.0、50 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L尿素)，37℃搖床振蕩過夜后,4℃ 8 800 r/min×30 min離心，留上清。采用逐級稀釋法復(fù)性：將上清逐滴加入復(fù)性液(pH8.0、50 mmol/L Tris-HCl，0.5 mmol/L EDTA，50 mmol/L NaCl)中，邊加邊緩慢攪拌，10 min 后再加第二滴，如此反復(fù)滴加，滴加完畢后繼續(xù)攪拌4 h以充分復(fù)性，此即復(fù)性混合液。整個操作4℃進行。

將復(fù)性的融合蛋白進行純化。步驟為：取0.5 ml 50% BeyoGoldTM-His-tag純化凝膠，平衡后加入上述復(fù)性混合液，4℃在搖床上緩慢搖過夜。將搖過夜的混合物裝入親和層析柱管中，將純化柱底部蓋子打開，在重力的作用下使柱內(nèi)的液體流出，加入0.5 ml非變性洗滌液，洗柱5次,用0.5 ml非變性洗脫液(50 mmol/L NaH2PO4、300 mmol/L NaCl、50 mmol/L 咪唑)洗脫目的蛋白，洗脫6～10次。將每次的洗脫液分別收集到不同的離心管中，以備后續(xù)分析用，最后將洗脫液合并裝入透析袋，用透析液(pH8.0 50 mmol/L Tris-HCl)4℃透析過夜，收集透析后的洗脫液即為純化的His-tagged-STAT4(565-748aa)蛋白樣品，最后進行SDS-PAGE電泳、考馬斯亮蘭染色和免疫印跡分析鑒定。

1.2.7免疫印跡法鑒定融合蛋白 純化的蛋白產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE膠電泳分離后，將融合蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶-TBST(pH7.6,0.02 mol/L Tris-HCl,0.14 mol/L NaCl,0.1% 吐溫 20，5%脫脂牛奶)室溫封閉1 h，加入兔抗HisG抗體，4℃孵育過夜，0.1% 吐溫 20-TBS (pH7.6,0.02 mol/L Tris-HCl,0.14 mol/L NaCl,0.1% 吐溫20)洗膜4次，每次5 min，再加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG，室溫孵育2 h，0.1% 吐溫20-TBS洗膜3次，TBS洗膜1次后ECL化學發(fā)光顯色。

2 結(jié)果

2.1原核表達質(zhì)粒pET-28a-STAT4-4的構(gòu)建 結(jié)合STAT4功能域,設(shè)計引物，以pEGFP-STAT4為模板[12]，采用PCR方法獲得編碼STAT4 565-748氨基酸肽段的基因片段，命名為STAT4-4，將之亞克隆到pET-28a(+)載體中，獲得的重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，在1.0%瓊脂糖凝膠電泳，可見大小約550 bp插入片段及5.3 kb的載體條帶(圖1A)，與理論值相符，將質(zhì)粒進行DNA序列測定(圖1B )，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，將其命名為pET-STAT4-4。

2.2His-tagged-STAT4(565-748aa)融合蛋白誘導(dǎo)表達條件摸索 誘導(dǎo)融合蛋白表達的條件為：誘導(dǎo)時間為4 h、誘導(dǎo)溫度分別為25℃和37℃、誘導(dǎo)劑IPTG濃度分別為0.1 mmol/L和0.8 mmol/L。將細菌裂解液進行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍染色，結(jié)合STAT4-4分子量大小，結(jié)果發(fā)現(xiàn)融合蛋白的分子量約為21 kD，符合理論值大?。贿€發(fā)現(xiàn)目的蛋白表達量在上述條件下，被誘導(dǎo)高表達(圖2)。

2.3融合蛋白His-tagged-STAT4(565-748aa)的誘導(dǎo)表達 將IPTG誘導(dǎo)前后的菌液進行超聲粉碎，收集上清和沉淀，進行SDS-PAGE凝膠電泳和考馬斯亮藍染色檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在溫度為25℃和37℃、IPTG濃度為0.1 mmol/L和0.8 mmol/L，誘導(dǎo)時間為4 h的誘導(dǎo)條件下所表達His-tagged-STAT4(565-748aa)融合蛋白以包涵體的形式存在于菌體沉淀中(圖3)。最終選擇IPTG為0.1 mmol/L、誘導(dǎo)溫度25℃、誘導(dǎo)時間4 h作為融合蛋白誘導(dǎo)表達條件進行后續(xù)實驗。

2.4重組包涵體蛋白的復(fù)性和純化 將包涵體變性和復(fù)性、用BeyoGoldTM-His-tag純化樹脂對復(fù)性蛋白進行純化，進行SDS-PAGE電泳及考馬斯亮藍染色，結(jié)果顯示獲得了融合蛋白，純度尚可(圖4A)。將洗脫蛋白合并，用透過分子量35 kD以上分子的透析膜將洗脫液進行透析，再行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍染，結(jié)果顯示獲得了純化的融合蛋白，純度大于90%(圖4B)。

2.5His-tagged-STAT4(565-748aa)融合蛋白的免疫印跡分析鑒定 將透析純化的融合蛋白最后進行SDS-PAGE電泳，以抗HisG多克隆抗體為一抗進行免疫印跡分析。結(jié)果證實融合蛋白為His-tagged-STAT4(565-748aa)(圖4C)。

圖1 pET-STAT4-4質(zhì)粒鑒定分析Fig.1 Identification of pET-STAT4-4 plasmidNote:A.Electrophoresis map of recombinant plasmids of pET-STAT4-4 digested by XhoⅠ and BamHⅠ.1.DNA marker:1 kD DNA ladder；2.Recombinant plasmids pET-STAT4-4 digested by XhoⅠ and BamHⅠ.Vector is 5.3 kb long.Inserted fragment is 0.55 kb long;3.DNA marker:DL1000 DNA marker;B.Map of DNA sequencing of STAT4-4.The red box shows the BamHⅠ and XhoⅠ cleavage joints.

圖2 不同條件誘導(dǎo)融合蛋白表達的SDS-PAGE電泳分析Fig.2 SDS-PAGE electrophoresis map of fusion protein induced under different conditionsNote:0.The lysate without induction by IPTG.*.Fusion protein.

圖3 His-tagged-STAT4(565-748aa)融合蛋白的表達定位分析Fig.3 Localization of His-tagged-STAT4(565-748aa) fusion protein expressed in E.coliNote:*.His-tagged-STAT4(565-748aa) fusion protein.

圖4 融合蛋白純化及免疫印跡分析Fig.4 Purification and identification of fusion proteinNote:A.Electrophoresis map of the purified fusion protein.Marker:protein molecular weight marker.1-8.The collected elusion buffer at the 1st-8th time to elute the refolding fusion protein.*:Fusion protein;B.Electrophorsis map of the dialyzed fusion protein;C.Western blot analysis of dialyzed His-tagged-STAT4(565-748aa) fusion protein by using anti-HisG as the primary antibody.

3 討論

研究報道通過經(jīng)典的JAK/STAT途徑，在細胞因子刺激下，STAT4的C-端693位酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化而被活化；進一步研究發(fā)現(xiàn)IL-12刺激的T細胞，還可以通過MKK6/p38途徑活化STAT4，使STAT4發(fā)生693位酪氨酸磷酸化同時發(fā)生721位絲氨酸磷酸化，Ser721磷酸化能增強STAT4的轉(zhuǎn)錄活性[10，11]。在HTLV-1轉(zhuǎn)化的T細胞系MT-2、MT-4及HUT102中STAT4也可同時發(fā)生Ser721和Tyr693磷酸化，并與STAT3形成異二聚體，反式激活高親和力順式可誘導(dǎo)原件(high-affinity sis-inducible element,hSIE)[13]。上述發(fā)現(xiàn)提示在STAT4蛋白C-端的絲氨酸或蘇氨酸位點的磷酸化與STAT4活性高度相關(guān)。

對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究有助于探討細胞生物學行為機制、為疾病的發(fā)生、預(yù)防及治療提供分子靶標。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的常見方式是蛋白激酶介導(dǎo)的酶促級聯(lián)反應(yīng)，因此研究蛋白與蛋白間的相互作用，尤其研究酪氨酸激酶或絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶與下游靶分子的相互作用是發(fā)現(xiàn)新的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的有效策略。Grossmann采用酵母雙雜交系統(tǒng)，以蛋白-蛋白相互作用啟動核轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄功能為原理，以含有SH2功能域和磷酸化的酪氨酸殘基為釣餌，篩選能與之結(jié)合的可能的蛋白激酶。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了一系列新的潛在的酪氨酸激酶[14]。本研究旨在通過原核表達系統(tǒng)獲得STAT4 C-端包含SH2和含有Ser721和Tyr693的TAD功能域的肽段，擬以之為底物，通過體外激酶實驗，探討活化STAT4的潛在蛋白激酶，以進一步探討STAT4活化的新的可能機制和潛在的生物學意義。

本研究采用基因克隆的方法克隆了STAT4編碼565-748氨基酸肽段的基因片段，將之亞克隆到原核表達載體中，將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，誘導(dǎo)融合蛋白表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)融合蛋白被表達在包涵體中，利用尿素變性溶解包涵體、逐級稀釋復(fù)性、BeyoGoldTM-His-tag純化樹脂親和層析結(jié)合低溫透析四個步驟在大腸桿菌包涵體中成功純化純度達到90%以上的目的蛋白。本研究為STAT4潛在的新的功能研究準備了實驗材料。

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