熊慧生 蔣 參 高 瑞 陳麗華

(重慶市腫瘤研究所中醫(yī)腫瘤科,重慶 400030)

肝癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅次于肺癌和胃癌[1,2]。手術(shù)切除是目前治療肝癌的最佳方法，但由于肝癌早期沒有明顯癥狀且具有較高轉(zhuǎn)移率，導(dǎo)致僅有10%～20%的患者適合手術(shù)[3-5]。因此，提高肝癌診斷水平及尋找抑制肝癌細胞轉(zhuǎn)移的藥物是治療肝癌的關(guān)鍵。烏頭堿是烏頭、附子等的主要活性成分，具有較強的抗炎和鎮(zhèn)痛活性，但由于烏頭堿具有較強的毒性而限制了其應(yīng)用[6,7]?，F(xiàn)代研究表明適量的烏頭堿能明顯減輕癌癥患者的疼痛，并且還能減少嗎啡類鎮(zhèn)痛藥的用藥量，延長作用時間，尤其適用于消化系統(tǒng)癌癥[8,9]。此外，烏頭堿還能抑制艾氏癌、黑色素瘤和胰腺癌等癌細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡[7,10，11]。川烏水提物還能降低肝癌細胞活性[12]。但烏頭堿對肝癌細胞生長及侵襲遷移能力的影響及作用機制還未見報道。本文將以人肝癌細胞株MHCC97為對象，探討不同濃度烏頭堿對肝癌細胞生長、侵襲和遷移的作用，并初步探究其作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗藥物 烏頭堿購自北納創(chuàng)聯(lián)研究院，分子式為C34H47NO11，分子量為645.74，純度≥98%。使用時用DMSO助溶，臨用前用細胞培養(yǎng)液稀釋為實驗所需濃度，DMSO濃度不超過0.1%。

1.1.2細胞 人肝癌細胞系MHCC97購自美國ATCC公司，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5%CO2，37℃。每兩天換液一次。

1.1.3試劑 特級胎牛血清(貨號：12664025)、DMEM培養(yǎng)液(貨號：12491-015)購自美國Gibco公司。MTT試劑盒、BCA試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司。Matrigel購自美國BD公司。P38、p-P38、p-AMPKAPK和p-HSP27一抗均購自美國Millipore公司。HRP標(biāo)記二抗購自美國Santa Cruz公司。

1.1.4儀器 MK3酶標(biāo)儀購自美國ThermoFisher公司；垂直電泳槽、半干轉(zhuǎn)膜儀和凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1MTT檢測細胞增殖 將細胞傳代培養(yǎng)于96孔板中，培養(yǎng)24 h后，分別用0.1、0.2、0.4、0.8、 2、5、10、20、40、80、200和400 μg/ml的烏頭堿處理細胞24 h，每組3個復(fù)孔。24 h后根據(jù)MTT試劑盒說明書檢測細胞活性。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，將細胞分為MHCC97組、烏頭堿5 μg/ml組、10 μg/ml組和20 μg/ml組，每組6個復(fù)孔。烏頭堿 5 μg/ml組、10 μg/ml組和20 μg/ml組分別用5 μg/ml、10 μg/ml和20 μg/ml烏頭堿處理細胞，MHCC97組加入等量溶媒，于第0、1、2、3和4天用MTT法檢測細胞增殖情況。

1.2.2Transwell檢測細胞侵襲能力 實驗前1天用Matrigel包被Transwell小室。將預(yù)冷的Matrigel取出后，迅速加入到Transwell小室底部，避免氣泡產(chǎn)生，于37℃放置30 min，待Matrigel凝固后，放置于無菌環(huán)境備用。第2天將細胞接種于小室上層，用含有不同濃度烏頭堿的無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，小室下層加入正常培養(yǎng)液，24 h后刮去上層細胞，下層細胞用結(jié)晶紫染色并計數(shù)統(tǒng)計。

1.2.3劃痕實驗檢測細胞遷移能力 實驗前一天用Marker筆于12孔板背面劃五條平行直線，消毒滅菌后置于超凈工作臺備用。將細胞以5×105個/ml的密度傳代培養(yǎng)于預(yù)先準(zhǔn)備的12孔板中，培養(yǎng)24 h后，用10 μl槍頭垂直于培養(yǎng)板背面的五條橫線劃痕，用預(yù)冷的PBS洗滌4次后，加入含不同濃度烏頭堿(5、10、20 μg/ml)的無血清培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，每組3個復(fù)孔。分別于處理后的第0 h和24 h拍照記錄，每孔隨機選取5個視野進行統(tǒng)計。

1.2.4Western blot檢測蛋白表達 用RIPA裂解液提取各組細胞蛋白，用BCA試劑盒對每組細胞總蛋白濃度進行定量分析并調(diào)平。用10%SDS-PAGE分離蛋白并轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜。用5%脫脂牛奶室溫封閉膜2 h，加入適宜濃度一抗(P38,1∶1 500;p-P38,1∶1 000;p-MAPKAPK,1∶1 000;p-HSP27,1∶1 000)4℃封閉過夜，第2天用緩沖液清洗PVDF膜3次，加入HRP標(biāo)記二抗室溫封閉1 h后，滴加化學(xué)發(fā)光液，用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，Image J軟件進行灰度值分析。以GAPDH為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1烏頭堿對肝癌細胞生長的影響 預(yù)實驗結(jié)果表明，當(dāng)烏頭堿濃度達到50 μg/ml及以上時，MHCC97細胞活性明顯被抑制，表明高濃度烏頭堿對MHCC97細胞具有細胞毒性(圖1)，因此選擇5、10和20 μg/ml三個濃度進行后續(xù)實驗。與MHCC97組比較，烏頭堿作用4 d后，10 μg/ml組和20 μg/ml組細胞生長速度均明顯降低(圖2)，提示烏頭堿可抑制肝癌細胞增殖。

2.2烏頭堿對肝癌細胞侵襲能力的影響 Transwell實驗結(jié)果表明，烏頭堿處理細胞24 h后，10 μg/ml組和20 μg/ml組侵襲細胞總數(shù)明顯減少，與MHCC97組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3)，提示烏頭堿能減弱肝癌細胞的侵襲能力。

2.3烏頭堿對肝癌細胞遷移能力的影響 用不同濃度烏頭堿處理細胞24 h后，烏頭堿 5 μg/ml組、10 μg/ml組和20 μg/ml組劃痕愈合率明顯低于MHCC97(圖4)，且具有量效關(guān)系。表明烏頭堿能抑制肝癌細胞遷移。

2.4烏頭堿對P38MAPK信號通路的影響 與MH-CC97組比較，烏頭堿 5 μg/ml組、10 μg/ml組和20 μg/ml組通路蛋白p-P38蛋白表達水平降低，p-P38/P38比值明顯降低；同時，各受試物組P38/MAPK信號通路下游蛋白p-MAPKAPK和p-HSP27的蛋白表達水平與MHCC97組比較也明顯降低(圖5)，且體現(xiàn)出量效關(guān)系。提示烏頭堿能抑制P38/MAPK信號通路激活。

圖1 烏頭堿對肝癌細胞存活率的影響Fig.1 Effect of aconitine on cell viabilityNote:A.Structure of aconitine；B.Treated MHCC97 cells with aconitine at different concentrations for 24 h,and MTT asaay was performed for cell viability.

圖2 烏頭堿對肝癌細胞增殖的影響Fig.2 Effect of aconitine on cell proliferation of hepatoma carcinomaNote:Cells were divided to MHCC97 group,5 μg/ml group,10 μg/ml group and 20 μg/ml and treated with acontinefor 0 d，1 d，2 d，3 d and 4 d respectively,cell viability was detected by MTT assay.n=6.Vs MHCC97 group，*.P<0.05.

圖3 烏頭堿對肝癌細胞侵襲能力的影響Fig.3 Effect of aconitine on invasion of hepatoma carcinoma cellsNote:The invasion viability of hepatoma carcinoma cells were measured by Transwell.The experience was repeated at least three times.n=3.Vs MHCC97 group，*.P<0.05.

圖4 烏頭堿對肝癌細胞遷移能力的影響Fig.4 Effect of aconitine on cell viability of migration of hepatoma carcinoma cellsNote:Wound healing assay was employed for detecting viability of migration of hepatoma carcinoma cells.Vs MHCC97 group，*.P<0.05.

圖5 烏頭堿對P38MAPK信號通路的影響Fig.5 Effect of aconitne on P38 MAPK signaing pathwayNote:The protein levels of p-P38,P38,p-MAPKAPK and p-HSP27.Vs MHCC97 group，*.P<0.05.

3 討論

肝癌是臨床常見的惡性腫瘤，具有高死亡率和高轉(zhuǎn)移率的特點[13]。臨床數(shù)據(jù)表明，肝癌患者確診后的生存期僅有6～20個月，肝癌每年的新發(fā)病例超過500 000人[14,15]。目前，對于肝癌的治療方法主要包括手術(shù)切除、肝移植及化療等，但由于化療藥物具有較大的副作用而限制了其應(yīng)用[16]。因此尋找新的抗肝癌藥物及方法成為國內(nèi)外研究的熱點。

烏頭堿是一類烏頭類生物堿，能夠調(diào)控細胞膜上的電壓依賴性鈉離子通道的開放，興奮迷走神經(jīng)，還可通過誘導(dǎo)神經(jīng)毒素的釋放，對周圍神經(jīng)造成損傷[17-19]。但其也具有多種藥理學(xué)活性，如抗炎、免疫抑制及鎮(zhèn)痛等[20]。目前，烏頭堿常被應(yīng)用于緩解晚期癌癥患者的疼痛，以改善癌癥患者的生活質(zhì)量[8]。研究表明，烏頭堿對一些癌細胞的生長具有一定的抑制作用。Ji等[7]的研究表明，烏頭堿可通過抑制NF-κB信號通路的激活抑制胰腺癌細胞增殖并誘導(dǎo)癌細胞凋亡，還可通過調(diào)控PI3K/AKT通路抑制黑色素瘤細胞的增殖。此外，烏頭堿還可增強二氯乙酸鹽的抗癌活性[10]。本文研究結(jié)果表明，烏頭堿能明顯抑制肝癌細胞MHCC97的細胞活性，降低MHCC97細胞的生長速度，提示其具有一定的抗肝癌活性。

研究表明，90%的癌癥死亡都是由癌細胞轉(zhuǎn)移引起的[21]。因此，有效抑制癌細胞的侵襲和遷移能力是降低癌癥死亡率的關(guān)鍵。Guo等[22]研究發(fā)現(xiàn)，烏頭堿可降低乳腺癌細胞的侵襲活性。但目前還沒有研究報道表明烏頭堿能明顯影響肝癌細胞的侵襲遷移能力。本文研究發(fā)現(xiàn)，烏頭堿能明顯減少侵襲的肝癌細胞總數(shù)、減緩肝癌細胞遷移速度，并體現(xiàn)出量效關(guān)系，表明烏頭堿能通過降低肝癌細胞侵襲和遷移活性降低肝癌細胞的運動能力。

MAPK是一類絲氨酸-蘇氨酸激酶，能被多種分裂素激活而使細胞進入分裂周期[23]。MAPK由三個成員組成，包括ERK、P38 MAPK和JNK[24]。研究表明，P38 MAPK信號通路參與了細胞增殖、遷移和凋亡的調(diào)控[25,26]。MAPKAPK是P38 MAPK的最重要的下游靶標(biāo)，MAPKAPK可直接誘導(dǎo)HSP27磷酸化，從而調(diào)控細胞遷移、增殖和凋亡[27,28]。大量研究表明，P38 MAPK信號通路在調(diào)控癌細胞的增殖過程中也起到了重要作用，P38 MAPK可通過調(diào)控癌組織血管新生促進癌細胞轉(zhuǎn)移，抑制P38 MAPK表達可抑制新血管的形成[28,29]。人參皂苷Rh2可通過下調(diào)P38 MAPK信號通路抑制肝癌細胞侵襲和遷移[30]。Zhu等[31]研究發(fā)現(xiàn)，磷脂酸促進肝癌細胞侵襲和遷移的作用與調(diào)控P38 MAPK信號通路有關(guān)。S100A9促進肝癌細胞增殖和遷移也與MAPK通路有關(guān)[32]。本文研究發(fā)現(xiàn)，烏頭堿能顯著降低肝癌細胞p-P38/P38的比值，并能顯著抑制MAPKAPK和HSP27磷酸化，且具有量效關(guān)系，表明烏頭堿能抑制MHCC97細胞P38 MAPK信號通路激活。

綜上所述，烏頭堿能抑制肝癌細胞增殖并降低其侵襲、遷移能力，并且其機制可能與抑制P38 MAPK信號通路激活有關(guān)。本研究初步探討了烏頭堿對肝癌細胞增殖、侵襲和遷移的影響及其作用機制，對于其具體的分子機制還有待進一步研究。

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