武 彬，石天虹，劉雪蘭，閻佩佩，井慶川*

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，山東濟南 250023；2.山東職業(yè)學(xué)院生物工程系，山東濟南 250104)

凝乳酶是生產(chǎn)乳酪和干酪素必需的酶制劑，能水解牛奶中κ-酪蛋白的Phe105-Met106肽鍵使牛奶凝結(jié)[1]。凝乳酶與其他酶制劑一樣，易受多種物理化學(xué)因素的影響而變性失活[2]。以海藻糖為代表的糖類、多元醇、聚合物等化合物作為酶的穩(wěn)定劑，具有適用范圍廣、作用效果較好的特點，已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用[3]。四氫嘧啶(1，4，5，6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸，Ectoine)是一種滲透壓補償性溶質(zhì)，與其他穩(wěn)定劑相比，具有性質(zhì)穩(wěn)定、用量小、保護(hù)作用強等特點，是理想的酶保護(hù)劑[4-5]。筆者在研究四氫嘧啶對凝乳酶熱穩(wěn)定性影響的過程中，發(fā)現(xiàn)添加四氫嘧啶的凝乳酶經(jīng)過熱失活處理后，會發(fā)生顯著的復(fù)性作用，這與四氫嘧啶對植酸酶熱穩(wěn)定性的影響完全不同[6]。

蛋白質(zhì)的復(fù)性是變性蛋白質(zhì)在適當(dāng)條件下恢復(fù)其天然構(gòu)象和生物活性的過程。蛋白質(zhì)復(fù)性要求有一定的條件，如pH、溫度、離子強度、蛋白質(zhì)濃度等。多種添加劑能促進(jìn)蛋白質(zhì)復(fù)性，包括：表面活性劑、低濃度變性劑、分子伴侶蛋白等[7]。目前，蛋白質(zhì)從伸展態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂猩砘钚缘奶烊粦B(tài)結(jié)構(gòu)的復(fù)性過程與機理還沒有完全闡明。酶結(jié)構(gòu)的變化是時間和溫度2個因素的復(fù)合作用所致[8]。筆者研究了四氫嘧啶存在條件下，熱處理時間、熱處理溫度和復(fù)性時間等因素對凝乳酶復(fù)性作用的影響。所獲結(jié)果有助于加深對部分失活的凝乳酶復(fù)性作用的了解，還可為熱穩(wěn)定性研究中，部分失活態(tài)凝乳酶的制備提供參考。

1 材料與方法

1.1材料Ectoine購自Sigma公司，純度>98%；凝乳酶，購自Sigma公司；脫脂奶粉購自伊利實業(yè)有限公司；其他試劑均為分析純；水為二次去離子水。

1.2方法

1.2.1凝乳酶測定方法。凝乳酶活力測定采用Arima法[9]：適當(dāng)稀釋凝乳酶0.5 mL，在35 ℃預(yù)熱5 min，加入到5 mL 35 ℃預(yù)熱的pH 6.0，含1%CaCl2的10%脫脂牛乳中，計時至管壁出現(xiàn)顆粒，記錄凝乳時間(T)。以35 ℃ 40 min凝乳1 mL牛乳的酶量為1個酶活力單位(1 U)，凝乳酶活力(A)的計算公式如下(其中n為凝乳酶的稀釋倍數(shù)，該文中均為1)：

(1)

1.2.2含四氫嘧啶的凝乳酶熱失活處理及酶活力測定方法。1.5 mL離心管中加入0.6 mL含有0.75 mmol/L四氫嘧啶的凝乳酶液，放入水浴鍋中立即開始計時，水浴完成后立即轉(zhuǎn)入冰水中快速降溫，然后取0.5 mL酶液測凝乳酶活力。

1.2.3凝乳酶復(fù)性測定方法。將熱失活處理后的凝乳酶轉(zhuǎn)入冰箱4 ℃靜置并計時，到復(fù)性時間后取出，水浴預(yù)熱至35 ℃，測定凝乳酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1復(fù)性時間對凝乳酶復(fù)性效果的影響蛋白質(zhì)的復(fù)性需要一定時間，在較低溫度下，蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)的有序性會逐漸恢復(fù)。含四氫嘧啶的凝乳酶在68 ℃下熱處理一定時間，快速冷卻至4 ℃靜置冷藏，分別在0～42 h每6 h取樣測定凝乳酶殘余活力的變化情況，其結(jié)果如圖1所示。隨著復(fù)性時間的延長，凝乳酶的活力逐漸上升。熱失活處理1 min后立即測定，凝乳酶相對酶活力為61.5%；復(fù)性42 h后再次測定，酶活力則升至83.3%(相對酶活力提高21.8百分點)。另外，在能夠檢測到凝乳酶活力的熱處理時間也顯著延長。熱處理后立即測定，凝乳酶水浴6 min已無法檢測到酶活力(酶活力損失>93.3%)，而復(fù)性36 h和42 h后，熱處理12 min的凝乳酶均能檢測到8.8%的殘余酶活力。

圖1 相同復(fù)性時間下凝乳酶活力隨熱處理時間變化過程Fig.1 Change of rennet activity with heat treatment time at the same renaturation time

進(jìn)行相同時間熱處理后，凝乳酶活力隨復(fù)性時間變化的結(jié)果能更清楚地反映凝乳酶復(fù)性的作用過程。熱處理1～7 min的酶活力隨復(fù)性時間變化的結(jié)果如圖2所示。熱處理時間越短，復(fù)性效果越好。隨著復(fù)性時間延長，凝乳酶活力上升的趨勢越來越平緩，36 h后凝乳酶活力基本保持穩(wěn)定。因此，選定36 h為測定凝乳酶復(fù)性作用的最佳時間。

圖2中相對酶活力數(shù)據(jù)對復(fù)性時間求導(dǎo)，可得到復(fù)性反應(yīng)的瞬時速率dU/dt。圖3所示為復(fù)性反應(yīng)速率的時間過程

圖2 相同熱處理時間下凝乳酶活力隨復(fù)性時間的變化過程曲線Fig.2 Change curve of rennet activity with renaturation time at the same heat treatment time

曲線表面，大部分復(fù)性反應(yīng)都發(fā)生在前24 h，24 h后復(fù)性反應(yīng)速率逐漸降低。另外，熱處理時間越短，凝乳酶復(fù)性作用越明顯，熱處理1 min和2 min的凝乳酶復(fù)性反應(yīng)速率顯著高于其他組。

圖3 不同熱處理時間凝乳酶復(fù)性反應(yīng)速率的時間過程曲線Fig.3 Time curve of renaturation reaction rate of rennet at different heat treatment time

2.2熱處理溫度對凝乳酶復(fù)性效果的影響高溫下，凝乳酶分子震動加大，導(dǎo)致凝乳酶變性失活。熱處理時間相同時，不同溫度下蛋白質(zhì)部分變性，肽鏈仍可保持一定的空間結(jié)構(gòu)；在高溫下蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆變性，肽鏈伸展形成無規(guī)則的卷曲。凝乳酶在61、63、65、67、68、69和70 ℃下熱失活處理，復(fù)性前凝乳酶活力隨熱處理時間變化的情況見圖4。

圖4 含四氫嘧啶凝乳酶的熱失活時間過程曲線Fig.4 The inactivation time process containing four hydrogen pyrimidine chymosin thermal curve

將熱處理后的含四氫嘧啶的凝乳酶復(fù)性36 h，復(fù)性后凝乳酶隨熱處理時間變化的情況見圖5。

圖6為含四氫嘧啶凝乳酶在復(fù)性前后酶活力在不同溫度下的差值。在較高溫度和較短的熱處理時間下，凝乳酶復(fù)性效果最好，低于67 ℃，隨著熱處理時間的延長，凝乳酶復(fù)性作用逐漸降低。

圖5 含四氫嘧啶凝乳酶復(fù)性后酶活力隨熱處理時間變化的情況Fig.5 The change of enzyme activity with the time of heat treatment after renaturation of milk clotting enzyme containing four hydrogen pyrimidine

圖6 含四氫嘧啶凝乳酶復(fù)性前后相對酶活力的差值Fig.6 D-value of relative enzyme activity before and after renaturation of milk clotting enzyme containing four hydrogen pyrimidine

3 結(jié)論與討論

四氫嘧啶能和生物大分子發(fā)生相互作用，能夠改變分子界面和分子內(nèi)部的氫鍵，增加β-折疊結(jié)構(gòu)，并維持分子構(gòu)象來提高其制劑熱穩(wěn)定性[4，10]。然而，Meyer等[11]則發(fā)現(xiàn)，四氫嘧啶促進(jìn)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的開環(huán)，降低了DNA的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。研究也發(fā)現(xiàn)，加入四氫嘧啶后，凝乳酶分子熱穩(wěn)定性下降，但凝乳酶熱失活后，存在顯著的復(fù)性作用。該試驗研究了熱失活處理的時間、溫度，以及熱處理后復(fù)性時間對含四氫嘧啶的凝乳酶復(fù)性作用的影響。結(jié)果表明，熱失活處理后，凝乳酶的復(fù)性主要發(fā)生在前24 h。在4 ℃靜置復(fù)性36 h后，凝乳酶活力基本不再升高，因此，將凝乳酶最佳復(fù)性時間確定為36 h。

四氫嘧啶存在下，熱失活處理的溫度對凝乳酶分子結(jié)構(gòu)的作用不及熱失活處理的時間。在酶活力損失相近時，含四氫嘧啶的凝乳酶在較高溫度下(68～70 ℃)保溫較短時間(1～5 min)，凝乳酶復(fù)性所致的相對酶活力提升顯著高于在較低溫度下(61～65 ℃)長時間保溫(30～180 min)。該結(jié)果表明，雖然酶的熱失活是溫度和時間復(fù)合作用引起的，但二者對酶分子結(jié)構(gòu)的影響并不相同，較長時間的熱失活處理比高溫對酶結(jié)構(gòu)的破壞更加徹底。這可能是由于四氫嘧啶能夠促進(jìn)凝乳酶二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，在較高溫度下，熱處理時間較短時，凝乳酶二級結(jié)構(gòu)的破壞程度較低，因此，凝乳酶分子更加容易復(fù)性；隨著熱處理時間的延長，二級結(jié)構(gòu)逐漸破壞，導(dǎo)致能恢復(fù)催化活力的凝乳酶分子的比例越來越少。采用色譜學(xué)、光譜學(xué)與滴定量熱等手段有望進(jìn)一步驗證上述猜想。

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