鄧程偉 吳進盛 何淑波 羅 超

(儋州市人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，儋州 571700)

乳腺癌是常見的女性惡性腫瘤之一，近些年的發(fā)病率呈上升趨勢。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移是一個多基因、多階段參與的復雜過程，已有大量研究表明抑癌基因失活、癌基因啟動等參與了其發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程[1-3]?；|(zhì)相互作用蛋白分子(Stromal interaction molecules1，STIM1)定位于11p15.5人染色體，是細胞內(nèi)鈣庫Ca2+傳感器，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上主要以二聚體形式分布，可通過感受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中的Ca2+水平對腫瘤的增殖、遷移、侵襲等生命活動進行調(diào)節(jié)，從而影響多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，因此是一個致癌基因[4,5]。研究顯示，STIM1在結(jié)直腸癌、前列腺癌、頭頸鱗癌等多種腫瘤中呈現(xiàn)高表達，與腫瘤預后呈現(xiàn)負相關(guān)。通過小分子抑制劑或RNA干擾機制抑制其表達后可減緩腫瘤的生長[6-8]。在乳腺癌中的研究發(fā)現(xiàn)STIM1的高表達，其表達與患者腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小呈現(xiàn)正相關(guān)，ERα表達和預后呈負相關(guān)，可能是判斷乳腺癌不良預后的一個指標，沉默乳腺癌細胞STIM1表達可降低癌細胞遷移[9,10]。但關(guān)于STIM1對乳腺癌生物學特性及機制研究尚未清楚。因此，本研究首先檢測了不同乳腺癌細胞系表達，通過RNA干擾技術(shù)抑制STIM1表達，觀察細胞增殖凋亡情況，并進一步研究相關(guān)的分子機制，為乳腺癌的臨床防治及藥物開發(fā)提供一定理論依據(jù)及新的靶標。

1 材料與方法

1.1材料 正常乳腺上皮細胞MCF-10A及乳腺癌 MCF7、HCC1569、MDA-MB-231、 BT549細胞均購自中科院上海細胞庫；胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶均購自美國Gibco；LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)細胞凋亡試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)研究所；細胞增殖核抗原(Proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Caspase3)、B細胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、STAT3和磷酸化的信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄因子3(Phosphorylated signal transducers and activators of transcription 3,p-STAT3)抗體均購自美國Cell signal公司；酶標儀、流式細胞儀均購自美國Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1細胞及其培養(yǎng) 取出保存在液氮罐中的細胞，37℃解凍后將細胞置于37℃，體積分數(shù)為5% CO2，95%飽和濕度的培養(yǎng)箱中用RPMI1640培養(yǎng)液(含有10%胎牛血清)培養(yǎng)。

1.2.2乳腺癌細胞STIM1的表達檢測 采用Western blot檢測各乳腺癌細胞中STIM1的蛋白表達。簡要步驟如下：提取MCF-10A、MCF7、HCC1569、MDA-MB-231、BT549 5種細胞中的總蛋白，BCA測定蛋白濃度，取等量50 μg蛋白樣品行SDS-PAGE電泳(分離膠及濃縮膠的濃度分別為10%和5%，電壓為110 V，電泳1.5 h)，電泳分離后轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜(NC膜)，明膠室溫封閉1 h，4℃水平搖床孵育均按照1∶1 000 稀釋的STIM1和內(nèi)參GAPDH抗體過夜，次日TBST洗滌細胞(5 min×3次)，加入1∶10 000稀釋的HRP標記的羊抗兔IgG，洗膜，化學發(fā)光法在紫外凝膠成像儀上進行拍照分析。

1.2.3細胞轉(zhuǎn)染 以5×105密度將生長至對數(shù)期的MDA-MB-231細胞接種于6孔板，細胞生長達70%～80%培養(yǎng)板底面時，按照脂質(zhì)體Lipofecta-mineTM2000轉(zhuǎn)染說明將陰性對照組(NC組，轉(zhuǎn)染無義的siRNA序列)和STIM1-siRNA組(轉(zhuǎn)染STIM1的靶向siRNA序列)轉(zhuǎn)染細胞，并設(shè)置僅加入脂質(zhì)體的為空白對照組(Blank組)，收集轉(zhuǎn)染48 h的細胞，參照1.2.2方法檢測各組細胞中STIM1的蛋白表達。

1.2.4MTT法檢測細胞增殖 以每孔5 000個細胞密度將3組細胞接種于96孔板，每組設(shè)置6個復孔，并設(shè)置空白對照孔，只加入培養(yǎng)液，分別在轉(zhuǎn)染后的24、48和72 h，每孔細胞加入10 μl配置好的MTT溶液，置于培養(yǎng)箱內(nèi)4 h，棄掉上清液，加入150 μl 的DMSO，置于水平搖床中搖15 min，利用空白對照孔調(diào)零，酶標儀于490 nm波長測定光密度值(OD)，以此反映細胞活力，間接反映出細胞的增殖情況。實驗重復3次。

1.2.5流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 取轉(zhuǎn)染48 h的細胞，制備成單細胞懸液，預冷的磷酸鹽緩沖液洗滌細胞，離心，棄掉上清，冷卻的結(jié)合緩沖液將細胞濃度調(diào)整為5×105個/ml，避光冰上加入5 μl的Annexin V-FITC和5 μl的PI稀釋液，繼續(xù)避光條件培養(yǎng)10 min，加入冷卻的400 μl結(jié)合緩沖液，30 min內(nèi)上流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。實驗重復3次。

1.2.6免疫因子檢測 參照總RNA提取試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明提取轉(zhuǎn)染48 h的細胞中RNA及反轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA。所有引物序列如下：IL-6 F：5′-AGTTGTGCAATGGCAATTCTG-3′，R：5′-AGGAC-TCTGGCTTTGTCTTTC-3′；TNF-α F：5′-ACTGGCGTGTTCATCCGTTCT-3′，R：5′-CGCAATCCAGGCCAC-TACTTC-3′；內(nèi)參GAPDH 的引物為F：5′-GTCACCAGGGCTGCTTTTAACTC-3′，R：5′-CAGCATCGCCCCACTTGATTTTG-3′。所有引物由上海生工合成。以cDNA為模板，按照試劑盒說明進行擴增，目的基因的相對表達量采用2-ΔΔCt法進行統(tǒng)計。實驗重復3次。

1.2.7增殖凋亡相關(guān)蛋白及STAT3信號蛋白表達檢測 參照1.2.2方法檢測增殖相關(guān)蛋白PCNA、凋亡蛋白Bcl-2、Bax、Caspase3及STAT3和磷酸化的STAT3的蛋白表達。

2 結(jié)果

2.1STIM1基因在乳腺癌細胞表達 STIM1基因在正常乳腺上皮細胞MCF-10A及乳腺癌BT549、HCC1569、MDA-MB-231、MCF7細胞的蛋白表達分別為(0.062±0.008)、(0.537±0.048)、(0.395±0.036)、(0.747±0.063)、(0.512±0.052)，5組的蛋白表達比較差異有統(tǒng)計學意義(F=91.851,P=0.000),乳腺癌中STIM1的蛋白表達顯著高于在正常乳腺上皮細胞MCF-10A表達(t1=12.795，P1=0.000；t2=8.970，P2=0.000；t3=18.451，P3=0.000；t4=12.121，P4=0.000)。見圖1。

2.2STIM1的siRNA轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細胞效果 空白對照組、陰性對照組和STIM1-siRNA組STIM1的蛋白表達分別為(0.557±0.054)、(0.524±0.046)、(0.155±0.013)，STIM1的蛋白在3組中表達比較有統(tǒng)計學意義(F=86.191,P=0.000)，STIM1-siRNA組STIM1的蛋白表達顯著低于空白對照組(t=11.825，P=0.000)，在陰性對照組表達與空白對照組差異無統(tǒng)計學意義(t=0.971，P=0.369)。見圖2。

圖1 STIM1基因在乳腺癌細胞表達Fig.1 Expression of STIM1 gene in breast cancer cellsNote:A.The expression of STIM1 protein in breast cancer cells was detected by Western blot;B.The relative expression of STIM1 protein.Compared with MCF-10A cells,*.P<0.05.

2.3STIM1的siRNA轉(zhuǎn)染降低MDA-MB-231細胞增殖 各組細胞增殖檢測結(jié)果如表1所示，3組細胞在24 h的細胞活力差異無統(tǒng)計學意義，在48 h和72 h時STIM1-siRNA 細胞活力顯著低于空白對照組(t48 h=3.116，P48 h=0.021；t72 h=4.042，P72 h=0.007)。

2.4STIM1的siRNA轉(zhuǎn)染誘導MDA-MB-231細胞凋亡 空白對照組、陰性對照組和STIM1-siRNA組細胞凋亡率分別為(2.10±0.65)%、(2.77±0.78)%、(18.15±1.68)%，3組細胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計學意義(F=192.535,P=0.000)，與空白對照組比較，STIM1-siRNA組細胞凋亡率顯著升高(t=17.345，P=0.000)。見圖3。

圖2 STIM1-siRNA轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細胞效果Fig.2 Effect of STIM1-siRNA transfection on MDA-MB-231 cellsNote:A.The protein expression of STIM1 in each group;B.The relative expression of STIM1 protein.Compared with blank group,*.P<0.05.

表1STIM1-siRNA轉(zhuǎn)染對MDA-MB-231細胞活力的影響

Tab.1EffectofSTIM1-siRNAtransfectiononviabilityofMDA-MB-231cells

GroupsOD49024h48h72hBlankgroup0320±00610718±00840957±0156NCgroup0326±00480696±00950912±0131STIM1?siRNAgroup0311±00650510±00631)0522±01031)F005058619884P095200390013

Note：Compared with blank group,1)P<0.05.

2.5STIM1的siRNA轉(zhuǎn)染對MDA-MB-231細胞增殖凋亡蛋白表達的影響 Western blot檢測各組細胞中增殖相關(guān)蛋白PCNA、凋亡蛋白Bcl-2、Bax、Caspase3的蛋白表達，結(jié)果如圖4和表2所示，與空白對照組比較，STIM1-siRNA組PCNA和Bcl-2的蛋白表達均顯著低于空白對照組(tPCNA=7.251，PPCNA=0.000；tBcl-2=7.462，PBcl-2=0.000)，Bax和Caspase3蛋白表達均顯著高于空白對照組(tBax=7.393，PBax=0.000；tCaspase3=10.971，PCaspase3=0.000)。

2.6STIM1的siRNA轉(zhuǎn)染對MDA-MB-231細胞IL-6、TNF-α表達的影響 通過RT-PCR檢測3組細胞IL-6、TNF-α表達，結(jié)果如表3所示，與空白對照組比較，STIM1-siRNA 組IL-6、TNF-α表達均顯著降低(tIL-6=13.680，PIL-6=0.000；tTNF-α=10.304，PTNF-α=0.000)。

圖3 STIM1-siRNA轉(zhuǎn)染對MDA-MB-231細胞凋亡的影響Fig.3 Effect of STIM1-siRNA transfection on apoptosis of MDA-MB-231 cellsNote:A.Flow cytometry results;B.Apoptosis rate of each group.Compared with Blank group,*.P<0.05.

2.7STIM1的siRNA轉(zhuǎn)染對MDA-MB-231細胞STAT3信號的影響 Western blot檢測STAT3及磷酸化的STAT3的蛋白表達，結(jié)果如圖5和表4所示，與空白對照組比較，p-STAT3的蛋白表達顯著降低(t=7.221，P=0.000)，3組間STAT3蛋白表達的差異無統(tǒng)計學意義。

圖4 STIM1-siRNA轉(zhuǎn)染對MDA-MB-231細胞增殖凋亡蛋白表達的影響Fig.4 Effect of STIM1-siRNA transfection on proliferation and apoptosis proteins in MDA-MB-231 cells

表3STIM1-siRNA轉(zhuǎn)染對MDA-MB-231細胞IL-6、TNF-α表達的影響

Tab.3EffectofSTIM1-siRNAtransfectiononexpressionofIL-6andTNF-αinMDA-MB-231cells

GroupsmRNArelativeexpressionIL?6TNF?αBlankgroup10001000NCgroup0968±00861108±0105STIM1?siRNAgroup 0368±00471) 0422±00561)F11875886471P00000000

Note：Compared with blank group,1)P<0.05.

表2各組細胞PCNA、Bcl-2、Bax、Caspase3的蛋白相對表達量

Tab.2RelativeexpressionlevelsofPCNA,Bcl-2,BaxandCaspase3ineachgroupofcells

GroupsRelativeexpressionofproteinPCNABcl?2BaxCaspase3Blankgroup0465±00530311±00350108±00130055±0009NCgroup0472±00580301±00310113±00150043±0008STIM1?siRNAgroup0187±00211)0136±00171)0222±00261)0167±00181)F35960351213490989757P0001000100010000

Note：Compared with blank group,1)P<0.05.

圖5 STIM1-siRNA轉(zhuǎn)染對MDA-MB-231細胞STAT3信號的影響Fig.5 Effect of STIM1-siRNA transfection on STAT3 signaling in MDA-MB-231 cells

表4STIM1-siRNA轉(zhuǎn)染對MDA-MB-231細胞STAT3信號的影響

Tab.4EffectofSTIM1-siRNAtransfectiononSTAT3signalinginMDA-MB-231cells

GroupsRelativeexpressionofproteinSTAT3P?STAT3Blankgroup0392±00440122±0013NCgroup0399±00460139±0016STIM1?siRNAgroup0416±00510044±00101)F020643994P08190000

Note：Compared with blank group,1)P<0.05

3 討論

腫瘤發(fā)生發(fā)展是一個多階段、多因素控制的錯綜復雜過程，細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路的紊亂和異常對于其發(fā)生發(fā)展發(fā)揮重要作用。隨著對乳腺癌研究的深入，乳腺癌與鈣信號通路間的關(guān)系受到廣泛關(guān)注。有研究顯示，乳腺癌細胞中Ca2+代謝出現(xiàn)失調(diào)，與腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移、預后等相關(guān)[11]。作為第二信使，細胞內(nèi)Ca2+對于細胞生長、遷移、分裂及基因轉(zhuǎn)錄等生物學功能均具有調(diào)控作用[12,13]。STIM1定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，是細胞內(nèi)Ca2+濃度變化的感受器，可將胞內(nèi)Ca2+濃度降低信號傳遞至胞膜的鈣池操縱鈣離子通道(Store-operated calcium channel，SOCC)，啟動的SOCC形成鈣釋放啟動鈣通道，最終引起細胞內(nèi)Ca2+濃度升高[14,15]。有研究發(fā)現(xiàn)，STIM1與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[16-18]。對乳腺癌的研究發(fā)現(xiàn)STIM1可影響癌細胞的增殖、轉(zhuǎn)移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等過程，過表達STIM1可增加乳腺癌細胞的遷移及侵襲能力[19，20]。本研究旨在STIM1對乳腺癌增殖凋亡及機制的研究。

通過Western blot檢測不同乳腺癌細胞系中STIM1的表達，發(fā)現(xiàn)其表達均高于在正常乳腺上皮細胞表達，此結(jié)果與前人的研究一致，這提示STIM1在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用。RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)是近些年來研究基因功能的一種有效手段，能特異、高效地抑制目的基因表達，在生物學領(lǐng)域已得到廣泛應用[21,22]。有研究發(fā)現(xiàn)，通過RNA干擾技術(shù)沉默STIM1的表達可降低胃癌、喉癌等腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移能力，并誘導癌細胞的凋亡[23,24]。本研究結(jié)果顯示，STIM1表達的抑制可降低乳腺癌細胞增殖，誘導細胞凋亡。細胞的增殖及凋亡處于動態(tài)平衡，平衡打破將導致腫瘤的發(fā)生。PCNA是一個分子量為36 kD的非組蛋白，是合成DNA不可缺少的因子，在細胞增殖過程中起重要作用[25,26]。誘導腫瘤細胞凋亡是腫瘤治療的一個方法，凋亡過程受到Caspase、Bcl-2、細胞色素C、Survivin等多種癌基因和抑癌基因的調(diào)節(jié)，其中Caspase和Bcl-2家族在細胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用[27,28]。Bcl-2家族包括抑凋亡基因和促凋亡基因，Bcl-2為抑凋亡基因，Bax為促凋亡基因，細胞凋亡受到兩者比率的影響，Bcl-2/Bax比率降低促進凋亡，升高抑制凋亡[29-31]。Caspase家族是細胞凋亡過程中起到關(guān)鍵作用的一類半胱氨酸蛋白酶，Caspase3是該家族級聯(lián)反應下游的關(guān)鍵酶，在細胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用，因此也被稱為死亡蛋白酶，生理條件下Caspase3在哺乳動物組織及細胞中以無活性的酶原形成存在，當有凋亡刺激時被啟動，從而使細胞走向凋亡[32-34]。目前乳腺癌中常用Caspase3活性檢測是否發(fā)生凋亡。本研究結(jié)果顯示，STIM1表達的抑制可降低PCNA和Bcl-2表達，上調(diào)Bax和Caspase3表達。這提示抑制STIM1表達可通過下調(diào)PCNA表達降低乳腺癌細胞增殖，下調(diào)Bcl-2、上調(diào)Bax和Caspase3表達誘導細胞凋亡。

抑制STIM1表達后通過RT-PCR檢測炎癥免疫因子IL-6、TNF-α表達，發(fā)現(xiàn)其表達均顯著降低，這提示STIM1可通過免疫調(diào)節(jié)對乳腺癌起保護作用。STAT3屬于轉(zhuǎn)錄因子STATs家族中的一員，是多種致癌信號的匯集點，在多種實體腫瘤中出現(xiàn)異常啟動，持續(xù)啟動的STAT3可促進腫瘤的形成和發(fā)展，目前是惡性腫瘤信號通路研究中的熱點[35-38]。研究發(fā)現(xiàn)，STAT3的活化水平與乳腺癌患者預后直接相關(guān)，磷酸化的STAT3水平越高，患者預后越差[39]；乳腺癌細胞中抑制STAT3信號通路表達可降低其發(fā)生發(fā)展過程[40]。本研究結(jié)果顯示，抑制STIM1表達可降低磷酸化的STAT3的表達。

綜上所述，STIM1基因在乳腺癌細胞高表達，通過RNA干擾抑制其表達可降低癌細胞活力，誘導細胞凋亡、提高免疫及下調(diào)STAT3信號。其中對細胞增殖的影響是通過下調(diào)PCNA表達，對凋亡的影響是下調(diào)Bcl-2、上調(diào)Bax和Caspase3表達。本研究可能為乳腺癌的分子診斷及靶向性治療提供了一定的理論依據(jù)。但本研究僅僅在細胞水平檢測了細胞的增殖凋亡情況，其他多種生物學特性及機制還未明確，體內(nèi)實驗如何也未可知。這些也將是后續(xù)實驗研究的重點。

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