丁元平 孫 麗 郝妮妮 遠(yuǎn) 洋 趙立民

(濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科，濰坊 261031)

鼻咽癌多發(fā)生于我國(guó)南方，是一種從鼻黏膜起源的惡性腫瘤，目前手術(shù)治療、放化療及綜合治療是其主要治療方法，但由于鼻咽癌發(fā)展速度快，惡性程度高，中晚期患者經(jīng)過(guò)治療后5年內(nèi)的生存率低于70%[1,2]。近年來(lái)隨著研究的不斷深入，基因靶向治療已經(jīng)成為研究的重點(diǎn)，其具有靶向性高，副作用小等優(yōu)點(diǎn)，尋找有效的靶基因?qū)τ谔岣弑茄拾┗颊叩纳媛示哂兄匾饬x[3]。丙酮酸激酶M2亞型(Pyruvate kinase M2 isoform,PKM2)是糖酵解途徑中的關(guān)鍵限速酶，而腫瘤細(xì)胞以糖酵解為主要功能方式[4]。研究表明，PKM2在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞糖酵解，加快腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[5]。本研究為了明確PKM2在鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡中的作用，通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法下調(diào)CNE-1細(xì)胞中PKM2水平，以期為探討鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制和尋找有效的靶基因治療鼻咽癌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 鼻咽癌細(xì)胞CNE-1購(gòu)自上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞蛋白提取試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；RNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo；熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自大連TaKaRa；活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma；PKM2小干擾RNA(PKM2 siRNA1和PKM2 siRNA2)和陰性對(duì)照(siRNA control)均購(gòu)自上海吉瑪公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceral-dehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)和PKM2引物由上海生工合成；p38MAPK一抗、磷酸化的p38MAPK(p-p38MAPK)一抗、C-myc一抗購(gòu)自美國(guó)Abcam；活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Cleaved Caspase-3)一抗、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)一抗購(gòu)自美國(guó)CTS。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞分組 CNE-1細(xì)胞培養(yǎng)用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2培養(yǎng)箱。培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的CNE-1細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染PKM2 siRNA1和PKM2 siRNA2，命名為PKM2 Si1、PKM2 Si2，同時(shí)以轉(zhuǎn)染siRNA control的CNE-1細(xì)胞為Si-NC，以不做轉(zhuǎn)染的Si-NC細(xì)胞為Con，轉(zhuǎn)染步驟參照Lipofectamine2000。

1.2.2轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中PKM2 mRNA水平檢測(cè) Con、Si-NC、PKM2 Si1、PKM2 Si2細(xì)胞分別培養(yǎng)48 h后，提取細(xì)胞中的RNA，取1 μg的RNA用反轉(zhuǎn)錄合成試劑盒合成cDNA，熒光定量PCR分析PKM2水平，以GAPDH為內(nèi)參。反應(yīng)條件為：95℃，10 min，95℃ 15 s；60℃ 1 min;共40個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。GAPDH上游引物為5′-CGGAGTCAACGGA-TTTGGTCGTAT-3′，下游引物5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′。PKM2上游引物為5′-ATTATTTGAGGAACTCCGCCGCCT-3′，下游引物5′-GTTGAAGGTAGTTTCGTGGA-3′。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.2.3轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中PKM2 蛋白水平檢測(cè) Con、Si-NC、PKM2 Si1、PKM2 Si2細(xì)胞分別培養(yǎng)48 h后，提取細(xì)胞總蛋白，二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)法對(duì)蛋白進(jìn)行定量檢測(cè)。用10%分離膠和5%的濃縮膠進(jìn)行電泳，每孔加入50 μg的蛋白樣品，用80 V電壓電泳30 min后，100 V電壓電泳2 h。90 V電壓轉(zhuǎn)膜80 min，用5%牛血清白蛋白封閉60 min后，放在1 000倍稀釋的一抗中，4℃過(guò)夜反應(yīng)。加入3 000倍稀釋的二抗在室溫孵育2 h，ECL發(fā)光，拍照，以GAPDH為內(nèi)參，分析目的蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.2.4細(xì)胞增殖活性檢測(cè) Con、Si-NC、PKM2 Si2細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔中加入200 μl(約為1 000個(gè)細(xì)胞)，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h。每孔中加入20 μl的MTT溶液，放在37℃孵育4 h，將上清液吸除后，加入150 μl的二甲基亞砜溶液，在室溫條件下孵育10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm每孔的光密度值(Optical density,OD值)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.2.5細(xì)胞克隆形成能力檢測(cè) Con、Si-NC、PKM2 Si2細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期以后，用0.25%的胰蛋白酶消化傳代后，用磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline，PBS)洗滌細(xì)胞2次，按照每孔中加入200個(gè)細(xì)胞種植到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，輕輕晃動(dòng)，37℃培養(yǎng)14 d，觀察出現(xiàn)肉眼可見的細(xì)胞克隆后，將培養(yǎng)液吸除以后，干燥，用甲醇固定，滴加結(jié)晶紫染色，將染液沖洗掉以后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞個(gè)數(shù)大于50的克隆數(shù)目，計(jì)算細(xì)胞克隆形成率。克隆形成率=(克隆數(shù)目÷接種細(xì)胞數(shù)目)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.2.6細(xì)胞凋亡檢測(cè) Con、Si-NC、PKM2 Si2細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，用胰蛋白酶消化傳代，用冰預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次后，在細(xì)胞中加入200 μl的結(jié)合緩沖液，加入膜聯(lián)蛋白 V-FITC(Annexin V-FITC)和5 μl碘化丙啶(Propidium iodide，PI)各5 μl，避光反應(yīng)10 min，加入150 μl的緩沖液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.2.7ROS水平檢測(cè) Con、Si-NC、PKM2 Si2細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，用胰蛋白酶消化傳代，用ROS水平檢測(cè)試劑盒(DCFH-DA法)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，以Con為對(duì)照統(tǒng)計(jì)各組細(xì)胞ROS水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.2.8p38MAPK、p-p38MAPK、C-myc、β-catenin、Cleaved Caspase-3水平檢測(cè) Con、Si-NC、PKM2 Si2細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，用胰蛋白酶消化傳代，Western blot法檢測(cè)p38MAPK、p-p38MAPK、C-myc、β-catenin、Cleaved Caspase-3水平，p38MAPK、p-p38MAPK、C-myc、β-catenin、Cleaved Caspase-3一抗分別稀釋1 000、500、800、800、1 000倍，步驟參照1.2.3。

2 結(jié)果

2.1轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中PKM2表達(dá)水平 Con、Si-NC、PKM2 Si1、PKM2 Si2細(xì)胞中PKM2 mRNA和PKM2蛋白表達(dá)水平見圖1和表1。Si-NC細(xì)胞中PKM2 mRNA和蛋白水平與Con相比，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。PKM2 Si1、PKM2 Si2細(xì)胞中PKM2 mRNA和蛋白水平與Con相比明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t1=8.195,t2=11.945,t3=7.517,t4=11.275，P<0.05)。PKM2 Si2細(xì)胞中PKM2 mRNA和蛋白水平與PKM2 Si1相比明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t1=3.750,t2=3.759,P<0.05)。PKM2 siRNA1、PKM2 siRNA2能夠明顯抑制鼻咽癌細(xì)胞中PKM2表達(dá)，并且PKM2 siRNA2抑制效果更好，后續(xù)選用PKM2 Si2細(xì)胞繼續(xù)研究。

2.2細(xì)胞增殖活性和克隆形成能力檢測(cè)結(jié)果 Con、 Si-NC、 PKM2 Si2細(xì)胞OD值和克隆形成率見表2。Si-NC細(xì)胞OD值和克隆形成率與Con相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。PKM2 Si2細(xì)胞OD值和克隆形成率與Con相比明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t1=5.484,t2=4.924,P<0.05)。下調(diào)PKM2表達(dá)可以抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖活性和克隆形成能力，抑制鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)。

圖1 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中PKM2表達(dá)水平Fig.1 Western blot detection of PKM2 expression in transfected cells

GroupsPKM2mRNAPKM2proteinCon100±009108±012Si?NC102±014106±013PKM2Si1041±0051)052±0041)PKM2Si2014±0031)2)024±0021)2)F7419661922P00000000

Note：Compared with Con,1)P<0.05;compared with PKM2 Si1,2)P<0.05.

2.3細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果 Con、Si-NC、PKM2 Si2細(xì)胞凋亡率見圖2和表3。Si-NC細(xì)胞凋亡率與Con相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。PKM2 Si2細(xì)胞凋亡率與Con相比明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=15.172,P<0.05)。下調(diào)PKM2表達(dá)可以促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞凋亡。

2.4ROS水平檢測(cè)結(jié)果 Con、Si-NC、PKM2 Si2細(xì)胞ROS水平見表4。Si-NC細(xì)胞ROS水平與Con相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。PKM2 Si2細(xì)胞ROS水平與Con相比明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.896,P<0.05)。下調(diào)PKM2表達(dá)可以提高鼻咽癌細(xì)胞中ROS水平。

2.5p38MAPK、p-p38MAPK、C-myc、β-catenin、Cleaved Caspase-3水平檢測(cè)結(jié)果 表5顯示Si-NC細(xì)胞p-p38MAPK、C-myc、β-catenin、Cleaved Caspase-3蛋白水平與Con相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。PKM2 Si2細(xì)胞p-p38MAPK、Cleaved Caspase-3水平與Con相比明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t1=12.975,t2=24.546,P<0.05)。 PKM2Si2細(xì)胞C-myc、β-catenin水平與Con相比明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t1=12.329,t2=11.243,P<0.05)。下調(diào)PKM2表達(dá)可以提高鼻咽癌細(xì)胞中p-p38MAPK、Cleaved Caspase-3水平，降低細(xì)胞中C-myc、β-catenin水平，見圖3。

GroupsODCellcloneformationrate(%)Con086±0117548±825Si?NC089±0067395±893PKM2Si2052±0041)4615±3471)F2197115347P00020004

Note：Compared with Con,1)P<0.05.

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況Fig.2 Flow cytometry to detect cell apoptosis

GroupsApoptosisrate(%)Con936±104Si?NC1005±093PKM2Si24842±5281)F150801P0000

Note：Compared with Con,1)P<0.05.

GroupsROSlevelCon100±008Si?NC098±007PKM2Si2182±0141)F66913P0000

Note：Compared with Con,1)P<0.05

圖3 Western blot檢測(cè)p38MAPK、p-p38MAPK、C-myc、β-catenin、Cleaved Caspase-3蛋白水平Fig.3 p38MAPK,p-p38MAPK,C-myc,β-catenin,Cleav-ed Caspase-3 levels detected by Western blot

Groupsp38MAPKp?p38MAPKC?mycβ?cateninCleavedCaspase?3Con115±013036±004076±006063±007014±003Si?NC113±012037±002074±005065±006015±001PKM2Si2114±014103±0101)025±0041)013±0021)073±0041)F00181105759752087775394962P09830000000000000000

Note：Compared with Con,1)P<0.05.

3 討論

腫瘤細(xì)胞以有氧糖酵解為主要供能方式，有氧糖酵解速率較快，能夠在短時(shí)間內(nèi)使腫瘤細(xì)胞獲得大量的能量，為腫瘤的生長(zhǎng)提供條件，而PKM2作為糖酵解中的關(guān)鍵酶參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[6,7]。研究表明，PKM2除了能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞糖酵解外，還可以通過(guò)調(diào)控細(xì)胞代謝過(guò)程中的產(chǎn)物和相關(guān)細(xì)胞因子影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[8]。研究顯示，PKM2在膀胱尿路上皮癌中表達(dá)上調(diào)，不僅可以影響膀胱癌細(xì)胞能量代謝途徑，還能夠影響癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[9]。本研究細(xì)胞轉(zhuǎn)染了PKM2 siRNA，并通過(guò)PCR和Western blot篩選了干擾水平更為明顯的PKM2 siRNA2繼續(xù)研究，通過(guò)MTT和細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，下調(diào)PKM2表達(dá)后的鼻咽癌細(xì)胞增殖活性和克隆形成能力下降，說(shuō)明PKM2下調(diào)可以抑制鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)，這與之前的研究結(jié)果一致，均說(shuō)明下調(diào)PKM2能夠抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)。

細(xì)胞凋亡與細(xì)胞內(nèi)的多種基因調(diào)控有關(guān)，是細(xì)胞維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的一個(gè)重要方式，細(xì)胞凋亡的發(fā)生與細(xì)胞內(nèi)多種因子的調(diào)控有關(guān)，目前對(duì)于細(xì)胞凋亡的具體作用機(jī)制尚不清楚[9,10]。Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，是目前研究較多與細(xì)胞凋亡有關(guān)的蛋白家族，其含有多個(gè)成員，根據(jù)其在細(xì)胞凋亡中的作用可以分為凋亡啟動(dòng)子、執(zhí)行因子等，Caspase-3是凋亡執(zhí)行因子，正常情況下以酶原的形式存在，當(dāng)其活化后形成Cleaved Caspase-3后標(biāo)志著細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆的階段[11,12]。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)PKM2表達(dá)后的鼻咽癌細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞中Cleaved Caspase-3水平升高，說(shuō)明PKM2下調(diào)能夠促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞生物學(xué)特性的維持與細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和細(xì)胞氧化平衡狀態(tài)有關(guān)，正常情況下，細(xì)胞內(nèi)存在一定濃度的ROS，這些ROS不僅與細(xì)胞氧化平衡穩(wěn)定有關(guān)，還參與細(xì)胞內(nèi)正常的信號(hào)傳導(dǎo)，細(xì)胞中ROS水平升高后導(dǎo)致細(xì)胞中氧化平衡狀態(tài)被打破，引起氧化損傷，促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生[13-15]。p38MAPK、Wnt/β-catenin是廣泛存在于細(xì)胞中的信號(hào)通路，與細(xì)胞的生長(zhǎng)凋亡等有關(guān)，p38MAPK在腫瘤組織中磷酸化水平降低，而Wnt/β-catenin信號(hào)通路異常激活，C-myc、β-catenin是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的關(guān)鍵組成部分[16,17]。研究表明，PKM2能夠通過(guò)作用于腫瘤細(xì)胞糖酵解途徑影響腫瘤細(xì)胞中氧化平衡狀態(tài)，并且對(duì)于細(xì)胞內(nèi)p38MAPK、Wnt/β-catenin信號(hào)通路也具有調(diào)控作用[18-21]。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)PKM2后的鼻咽癌細(xì)胞中ROS水平升高，細(xì)胞中p38MAPK磷酸化水平也升高，而細(xì)胞中C-myc、β-catenin水平降低，說(shuō)明下調(diào)PKM2促進(jìn)p38MAPK信號(hào)通路激活，抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路。

綜上所述，下調(diào)PKM2抑制鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞凋亡，影響鼻咽癌細(xì)胞中ROS水平，其作用機(jī)制可能與p38MAPK信號(hào)通路激活和Wnt/β-catenin信號(hào)通路被抑制有關(guān)，而對(duì)于其具體的作用機(jī)制仍然需要在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中通過(guò)p38MAPK或者Wnt/β-catenin信號(hào)通路進(jìn)行驗(yàn)證。本研究為探討鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，為靶向PKM2治療鼻咽癌提供了理論基礎(chǔ)，本研究沒(méi)有在多種鼻咽癌細(xì)胞中進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)也沒(méi)有在體內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中會(huì)對(duì)上述部分進(jìn)行深入探討。

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