張 旭 溫桂平 唐自閩 王思令 陳佳昕 應(yīng) 東 劉 暢 鄭子崢 夏寧邵

(廈門大學(xué)分子疫苗學(xué)與分子診斷學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廈門大學(xué)國(guó)家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心，廈門大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廈門 361102)

戊型肝炎(Hepatitis E,HE)是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)所引起的病毒性肝炎。HEV是單股正鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)7.2 kb，包含3個(gè)開放閱讀框(Open reading frame,ORF)，其中ORF2編碼戊型肝炎病毒唯一的衣殼蛋白，共包含660個(gè)氨基酸，該蛋白參與了病毒組裝、免疫及病毒細(xì)胞相互作用[1]。ORF2包含3個(gè)結(jié)構(gòu)域(Structural domain)，分別為P、M、S結(jié)構(gòu)域(P domain即等同于E2s domain)。E2s是宿主識(shí)別病毒所必需的結(jié)構(gòu)域，同時(shí)也含有免疫優(yōu)勢(shì)表位[2]。類病毒顆粒p239(a.a.368-606)是本實(shí)驗(yàn)室對(duì)E2s(a.a.457-602)進(jìn)行改造后得到的，并利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了可在體外組裝成顆粒的p239[3]。

近年來(lái)，HEV已逐漸成為全球范圍內(nèi)引發(fā)急性病毒性肝炎的最主要原因之一。戊型肝炎病毒感染在許多發(fā)展中國(guó)家是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。20世紀(jì)以來(lái)在中國(guó)[4-6]、印度[7]等10多個(gè)國(guó)家均發(fā)生過(guò)暴發(fā)流行。同時(shí)，在發(fā)達(dá)國(guó)家報(bào)道的戊肝散發(fā)病例呈逐年增加的趨勢(shì)[8，9]。孕婦與老年人是主要的高危人群。戊型肝炎病例的病死率約為0.2%～4%，孕婦感染HEV的病死率可高達(dá)10%～25%[10]。單克隆抗體治療可能是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中最主要的治療/診斷方法之一。目前單克隆抗體藥物已經(jīng)被批準(zhǔn)用于治療多種疾病[11-14]。傳統(tǒng)的單克隆抗體主要通過(guò)免疫小鼠B細(xì)胞同骨髓瘤細(xì)胞系融合的雜交瘤技術(shù)來(lái)獲得，但將鼠源單抗用于臨床治療有諸多弊端，如人體對(duì)鼠源單抗作為外源蛋白的有害免疫效應(yīng)發(fā)病率較高，同時(shí)人體免疫對(duì)于鼠源抗體缺乏足夠的效能。通過(guò)將抗原結(jié)合所必需的小鼠氨基酸移植到人抗體框架上，再應(yīng)用體外或體內(nèi)抗體生產(chǎn)技術(shù)可以得到人源化抗體[15,16]，但由于小鼠本身的遺傳背景限制，導(dǎo)致所得單抗對(duì)抗原加工及B細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)仍存差異，這種方法仍保留一定的異源性。而全人源抗體有特異性高、親和力強(qiáng)、臨床效果好、不良反應(yīng)少等優(yōu)勢(shì)，成為近年來(lái)抗體研究的熱點(diǎn)。目前，還沒有識(shí)別戊型肝炎病毒衣殼蛋白的全人源抗體研究的相關(guān)報(bào)道。

本研究從接種戊肝疫苗志愿者的外周血中分選得到識(shí)別戊型肝炎病毒類病毒顆粒p239的特異性記憶B細(xì)胞[17]，獲得6株識(shí)別戊型肝炎病毒衣殼蛋白的單克隆抗體，并對(duì)獲得的抗體性質(zhì)進(jìn)行了初步的鑒定。為之后快速生產(chǎn)全人源抗體以及研究疫苗免疫后體內(nèi)抗體演化提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料 獲得一例全程接種戊肝疫苗的35歲健康男性接種者的外周血，以及一名未接種疫苗的且為HEV陰性的25歲男性健康志愿者的外周血，存儲(chǔ)于抗凝管中待用。

1.1.2主要試劑及耗材 戊肝疫苗Hecolin?為北京萬(wàn)泰公司產(chǎn)品，主要成分為p239類病毒顆粒。常用質(zhì)粒pTT5購(gòu)自Invitrogen公司。常用菌株DH5α、Top10均為本實(shí)驗(yàn)室保存。細(xì)胞株HEK293T、293Expi購(gòu)自ATCC。PCR擴(kuò)增及分子克隆試劑購(gòu)自Promega公司。細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen公司。質(zhì)粒及樣品核酸提取試劑購(gòu)自QIAGEN公司?？乖?、抗體、酶標(biāo)記抗體及顯色底物主要購(gòu)自Sigma公司及北京萬(wàn)泰。Anti-Human IgG(Fab specific)、羊抗人IgG購(gòu)自PIERCE公司，4#抗體-HRP購(gòu)自北京萬(wàn)泰。CD20-FITC、CD27-PE、IgG-BV421等熒光抗體購(gòu)自BD公司。其他常規(guī)試劑如抗體純化介質(zhì)購(gòu)自GE公司，DNA、Protein Marker購(gòu)自Thermo公司，各種常規(guī)化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3巢式PCR引物 本研究所涉及的引物均由Invitrogen公司合成。具體引物設(shè)計(jì)方案參照已報(bào)道的方法[18]。

1.2方法

1.2.1單細(xì)胞分選 從選出的接種志愿者和非接種志愿者體內(nèi)分別抽取10 ml的外周血，采用常規(guī)Ficoll-Paque密度梯度離心，獲得外周血單核細(xì)胞(PBMC)。采用CD20+、CD27+、IgG+和抗原這四個(gè)指標(biāo)對(duì)抗原特異的記憶B細(xì)胞進(jìn)行特異性標(biāo)記并分選，用96孔U底細(xì)胞板進(jìn)行細(xì)胞收集。

1.2.2反轉(zhuǎn)錄PCR 使用Random Hexamers進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄操作。按照每孔1 μl Random Hexamers(50 ng/μl)和1 μl dNTPs(10 mmol/L)進(jìn)行溶液配置。每孔加入2 μl上述溶液，65℃ 5 min，然后迅速將PCR板置于冰上5 min；配置cDNA合成Mixture:每孔加入2 μl 10×RT buffer，4 μl 25 mmol/L MgCl2，2 μl 0.1 mol/L DTT，1 μl RNase OUT，1 μl SuperScripeⅢRT，25℃ 10 min；50℃ 60 min；85℃ 5 min。逆轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，將PCR板保存于-80℃冰箱。采用的反應(yīng)體系為Temp(cDNA)2 μl，F(xiàn)P (10 μm) 1 μl，RP (10 μm) 1 μl，2×HiFi PCR MixⅡ 20 μl，DEPC H2O 16 μl。反應(yīng)條件為94℃ 5 min，(94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min)30 cycles，72℃ 7 min。

1.2.3Nested-PCR 第一輪 PCR：以 2 μl cDNA 為模版，實(shí)驗(yàn)過(guò)程冰上操作且整個(gè)過(guò)程需要滿足DNase & RNAase free 條件，反應(yīng)體系為Temp(cDNA) 2 μl，F(xiàn)P (10 μm) 2 μl，RP(10 μm)2 μl，2×HiFi PCR MixⅡ 12.5 μl，DEPC H2O 6.5 μl，反應(yīng)條件為：94℃ 5 min，(94℃ 30 s，55℃30 s，72℃ 1 min)50 cycles，72℃ 10 min；第二輪 PCR：以 4 μl第一輪PCR 產(chǎn)物為模板，再次進(jìn)行 PCR，反應(yīng)體系為DNA 5 μl，F(xiàn)P (10 μm) 2 μl，RP(10 μm)2 μl，2×HiFi PCR MixⅡ 25 μl，DEPC H2O 16 μl，反應(yīng)條件為：94℃ 5 min，(94℃ 30 s，57℃30 s，72℃45 s)50 cycles，72℃10 min；第二輪PCR 產(chǎn)物取5 μl進(jìn)行 1.5%瓊脂糖核酸電泳，判斷 PCR 是否成功；若條帶大小正確，則電泳割膠回收。

1.2.4PCR產(chǎn)物純化和克隆鑒定 取2 μl擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，目的片段約500 bp。將余下產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物回收試劑盒純化，克隆至pTT5載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂板，每個(gè)平板挑選5個(gè)菌斑進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，將陽(yáng)性重組質(zhì)粒搖菌，送上海生工測(cè)序。

1.2.5抗體基因序列分析 將測(cè)序結(jié)果用MEGA7讀取，并將測(cè)序結(jié)果正確的序列在IMGT數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行重鏈以及輕鏈的家系分析。

1.2.6抗體的表達(dá)及純化 表達(dá)所用的載體為pTT5，采用AgeⅠ及SalⅠ對(duì)重鏈載體進(jìn)行酶切，采用AgeⅠ及BsiWⅠ對(duì)輕鏈載體進(jìn)行酶切，采用Gibson裝配的方式將抗體基因構(gòu)建到表達(dá)載體上。將克隆至pTT5載體的陽(yáng)性重組質(zhì)粒采用脂質(zhì)體法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 HEK293T 細(xì)胞，進(jìn)行識(shí)別戊型肝炎病毒衣殼蛋白的人源抗體的小量表達(dá)。應(yīng)用商品化HEV-IgG檢測(cè)試劑盒(北京萬(wàn)泰)以及自制的包被Anti-Human IgG的酶標(biāo)板，按照說(shuō)明書對(duì)小量表達(dá)上清進(jìn)行驗(yàn)證。將小量表達(dá)驗(yàn)證陽(yáng)性的質(zhì)粒采用PEI法轉(zhuǎn)染293Expi細(xì)胞，進(jìn)行識(shí)別戊型肝炎病毒衣殼蛋白的人源抗體的大量表達(dá)。收集細(xì)胞上清，5 000 g 離心10 min，回收上清；用0.22 μm濾器過(guò)濾上清；使用AKTA儀器以及Protein A柱子對(duì)細(xì)胞上清進(jìn)行純化，純化得到穿透峰和洗脫峰樣品經(jīng)過(guò)沸水煮5 min后進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。純化的單克隆抗體用20 mmol/L PBS(pH7.0)緩沖液透析過(guò)夜，并分裝至1.5 ml管中，存放于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7抗體結(jié)合活性測(cè)定 利用ELISA檢測(cè)抗體與類病毒顆粒p239的結(jié)合活性，通過(guò)包被p239，制成抗原板，隨后進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)。在抗原板中加入得到的抗體0.02 μg/μl，37℃孵育30 min，加入羊抗人IgG 10 μg/孔，37℃孵育30 min，加入顯色底物，37℃顯色15 min；終止并讀取吸光度參數(shù)。根據(jù)讀值，計(jì)算其抗體與抗原的結(jié)合活性。

1.2.8抗體中和活性測(cè)定 通過(guò)p239類病毒顆粒HepG2細(xì)胞吸附模型對(duì)抗體的中和能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。在96孔細(xì)胞板接種5×104細(xì)胞/孔，12 h后貼壁用于檢測(cè)；抗體應(yīng)用PBS進(jìn)行兩倍梯度稀釋；將PBS緩沖液稀釋的抗體和類病毒顆粒在37℃下孵育30 min，將混合液加入到HepG2細(xì)胞板中，37℃孵育 30 min，用PBS清洗細(xì)胞3次；加入0.5%戊二醛，室溫，10 min，固定細(xì)胞，用PBS清洗細(xì)胞3次；加入4#抗體-HRP 10 μg/孔，37℃孵育30 min，用PBS清洗細(xì)胞3次；加入顯色底物，37℃顯色15 min；終止并讀取吸光度參數(shù)。

2 結(jié)果

2.1HEV特異性記憶B細(xì)胞分選 在本研究中，我們選擇記憶B細(xì)胞作為獲得抗原特異性單克隆抗體基因的來(lái)源。結(jié)果如圖1所示，在接種了疫苗的志愿者的外周血中CD20+、CD27+、IgG+及Ag+的比例為0.32%。從10 ml外周血中共分選得到43個(gè)單細(xì)胞，用于后續(xù)的單細(xì)胞PCR。

2.2單細(xì)胞PCR抗體基因分析 對(duì)得到的43個(gè)B細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞PCR調(diào)取抗體輕重鏈基因。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，共得到6株抗體輕重鏈基因配對(duì)。

以單細(xì)胞PCR的第二輪反向引物作為測(cè)序引物對(duì)成功調(diào)取的6株抗體的輕重鏈基因進(jìn)行測(cè)序，并通過(guò)IMGT網(wǎng)站進(jìn)行序列比對(duì)分析。調(diào)取的抗體輕重鏈V區(qū)與人源抗體原始家系同源性均達(dá)到90%以上，說(shuō)明調(diào)取的均為人源抗體的基因序列，未受到其他物種抗體基因序列的污染?？贵w重鏈來(lái)源家系廣泛，包括了IGHV1-69、4-61、4-59、3-30家系,具體信息如表1。

2.3克隆及抗體的表達(dá) 采用通用引物將載體酶切位點(diǎn)兩端的序列構(gòu)建到抗體輕重鏈兩端。之后采用Gibson裝配方法將抗體輕重鏈可變區(qū)序列構(gòu)建到含有輕重鏈恒定區(qū)的pTT5表達(dá)載體上。挑取克隆后，通過(guò)菌液PCR鑒定，測(cè)序結(jié)果與原始序列比對(duì)，最終成功構(gòu)建6株抗體的表達(dá)克隆。將獲得質(zhì)粒采用293T細(xì)胞系瞬時(shí)轉(zhuǎn)染抗體輕重鏈，3 d后收集細(xì)胞上清，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)總IgG與HEV特異IgG。結(jié)果顯示，6株抗體均可以正常表達(dá)，且均為HEV特異性抗體。為了獲得足夠的抗體量完成抗體結(jié)合活性、中和活性分析，應(yīng)用懸浮細(xì)胞293Expi對(duì)于小量表達(dá)為陽(yáng)性的6株抗體進(jìn)行大量表達(dá)。通過(guò)Protein A介質(zhì)對(duì)抗體進(jìn)行純化。對(duì)純化濃縮后的抗體進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，結(jié)果如圖2所示：顯示各抗體的輕重鏈均可很好表達(dá)，重鏈分子量大小為50 kD左右，輕鏈分子量大小為25 kD左右。

圖1 HEV特異記憶B細(xì)胞群分析Fig.1 Analysis of HEV-specific memory B cells

表1不同抗體的輕重鏈VDJ基因家系分析

Tab.1AnalysisofVDJgenefamilyoflightandheavychainswithdifferentantibodies,whichwasaccessiblefromIMGT

IDHeavychainVHDHJHCDR3(aa)LengthLightchainVLJLCDR3(aa)LengthZ3G74?61?015?12?016?03ARVEVSGGYEYDYYYMDV183?15?014?01QQYSDWPALT10Z3D74?61?015?12?016?03ARVEVSGGYEYDYYYMDV181?39?014?01QQGYSTALS9Z5B31?69?013?10?014?02ARIRGGGVTMTSYYFDS173?20?014?01QLYGRSPLT9Z4B41?69?013?10?013?02ARGMSQKLWFEESDAFDI181?44?013?02AAWDDSLNGPWV12Z4C103?30?042?15?014?02ARARGSCSGGSPKLISCYFDY211?51?013?02VTWDSTLWGV10Z4G114?59?011?1?016?02AREPYNWNDGYPYGMDV174?1?011?01QHYYSTPRT9

圖2 SDS-PAGE凝膠電泳分析抗體輕重鏈表達(dá)Fig.2 Antibodies were characterized using SDS-PAGE

圖3 基于p239類病毒顆粒對(duì)抗體反應(yīng)性進(jìn)行檢測(cè)Fig.3 Reactivity test of HEV-specific antibodies

2.4抗體結(jié)合活性檢測(cè) 采用間接ELISA方法對(duì)抗體與p239類病毒顆粒結(jié)合活性進(jìn)行了檢測(cè)，對(duì)EC50進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如圖3所示：Z4G11結(jié)合活性明顯優(yōu)于其他抗體，EC50為8.165 ng/ml。Z3D7、Z3G7反應(yīng)性較差，EC50均大于100 ng/ml。

圖4 基于p239類病毒顆粒對(duì)抗體中和活性進(jìn)行檢測(cè)Fig.4 Neutralization test of HEV-specific antibodies

2.5抗體中和活性檢測(cè) 通過(guò)檢測(cè)不同抗體加入量下p239類病毒顆粒吸附HepG2細(xì)胞量的變化，對(duì)抗體中和能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。圖4表明除Z3D7、Z3G7外，隨著抗體加入量的增加p239吸附細(xì)胞的量逐漸降低。其中Z3D7和Z3G7無(wú)中和能力，其他抗體均具有中和能力，Z5B3具有最強(qiáng)的中和能力。

3 討論

本研究主要通過(guò)應(yīng)用抗原特異IgG+記憶B細(xì)胞流式篩選平臺(tái)，對(duì)HEV疫苗接種者PBMC中的HEV特異IgG+記憶B 細(xì)胞進(jìn)行分選。通過(guò)單細(xì)胞PCR共得到6對(duì)輕重鏈配對(duì)抗體基因，應(yīng)用293T細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)，經(jīng)鑒定該6株單克隆抗體為識(shí)別戊型肝炎病毒衣殼蛋白的人源抗體。綜合以上結(jié)果表明人源抗體篩選平臺(tái)建立成功并初步應(yīng)用到識(shí)別HEV衣殼蛋白的特異人源抗體的篩選當(dāng)中。得到6株識(shí)別戊型肝炎病毒衣殼蛋白的人源單克隆抗體，中和能力較強(qiáng)的Z5B3以及Z4B4抗體重鏈VH區(qū)來(lái)源于1-69家系，無(wú)中和能力的Z3G7以及Z3D7來(lái)源于4-61家系。重鏈CDR3區(qū)氨基酸數(shù)目多為17-18，其中Z4C10可達(dá)21，與其他研究中的人源抗體CDR3區(qū)氨基酸數(shù)目相類似[19]。得到6株抗體中，結(jié)合能力強(qiáng)的都具有較強(qiáng)的中和能力。

本次研究制備的人源單克隆抗體具有很好的科研價(jià)值和應(yīng)用前景，可用于識(shí)別表位分析，通過(guò)獲得更多的人源抗體，可確定HEV的免疫優(yōu)勢(shì)表位，以彌補(bǔ)利用鼠源單克隆抗體尋找表位的缺陷，從而更深入準(zhǔn)確地了解疫苗的免疫進(jìn)程及抗體在人體內(nèi)的演化情況。同時(shí)這些抗體不僅能夠很好地滿足科研需求，也可作為診斷試劑和臨床藥物研發(fā)的重要原料，隨著科研水平的提高與制備工藝的完善，治療性單克隆抗體藥物逐漸發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。在過(guò)去二十多年中，已有超過(guò)30種IgG抗體及其衍生物獲批應(yīng)用于臨床，多種人源化和人源抗體也進(jìn)一步豐富了治療靶點(diǎn)。同樣也可將其應(yīng)用于反向指導(dǎo)疫苗結(jié)構(gòu)的合理設(shè)計(jì)中。人源抗體在臨床上也有多方面的應(yīng)用，如感染性疾病和腫瘤的治療、體內(nèi)定位診斷、免疫調(diào)節(jié)等。隨著腫瘤免疫治療研究的逐漸深入，人源單克隆抗體應(yīng)用范圍不斷拓展，市場(chǎng)需求也不斷增加。而通過(guò)建立基于流式細(xì)胞分選和單細(xì)胞PCR技術(shù)的人源抗體篩選平臺(tái)，能夠高效地獲得抗原特異性的人源抗體。因此，基于流式細(xì)胞分選及單細(xì)胞PCR技術(shù)的人源抗體篩選方法具有相當(dāng)廣闊的發(fā)展前景和開發(fā)價(jià)值。

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