張玉星，張 響，2，陳文杰，張麗果

（鄭州大學(xué)：1力學(xué)與工程科學(xué)學(xué)院，2國家級微納成型技術(shù)國際聯(lián)合研究中心，河南 鄭州450001；3鄭州大學(xué)醫(yī)藥科學(xué)研究院，河南 鄭州 450052）

0 引言

作為一種納米級的膜性囊泡，外泌體（exosomes）在1983年首次被Johnstone等［1］在羊的網(wǎng)織紅細(xì)胞培養(yǎng)液上清中發(fā)現(xiàn)并于1989年正式命名［2］。在這之后三十年間，外泌體研究進(jìn)展較為緩慢。一直到2013年，諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予美國科學(xué)家James E.Rothman、Randy W.Schekman和德國科學(xué)家Thomas C.Südhof，以表彰他們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)部囊泡運(yùn)輸調(diào)控機(jī)制。從此，外泌體研究領(lǐng)域進(jìn)入全新的、高速的發(fā)展階段，相關(guān)論文發(fā)表量相較于2013年以前有了大幅度提升（圖1）。

圖1 近20年外泌體相關(guān)領(lǐng)域論文發(fā)表增長曲線

外泌體是細(xì)胞外囊泡大家庭中的一員。細(xì)胞外囊泡一般包括外泌體（30～150 nm）、微泡（100～350 nm）及凋亡小體（500 ～ 1000 nm）［3－5］。 外泌體來源于晚期胞內(nèi)體（又稱多泡體，multivesicular bodys，MVBs），電鏡下觀察形狀呈杯狀結(jié)構(gòu)，直徑為30～150 nm［5］。外泌體可以由體內(nèi)或體外培養(yǎng)的細(xì)胞分泌，如小膠質(zhì)細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等，同時(shí)也存在于精液、尿液、腹水、乳汁、血清［6－9］等人體體液中。作為一個(gè)納米級的膜性小囊泡，外泌體具有獨(dú)立且完整的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，并借此封裝了母細(xì)胞的一部分，包括蛋白質(zhì)、microRNA等。研究發(fā)現(xiàn)，部分外泌體甚至含有來源細(xì)胞的絕大多數(shù)蛋白質(zhì)種類，更有學(xué)者報(bào)道當(dāng)疾病發(fā)生時(shí)外泌體的組成會(huì)發(fā)生變化，例如卵巢癌患者分泌的外泌體中，Claudin4等腫瘤標(biāo)志物含量上升，并且隨著腫瘤的發(fā)展而逐漸增加［10］。因此通過分析患者體液中的外泌體成分與變化可以進(jìn)行有效的醫(yī)療診斷、預(yù)測。近年來，外泌體被認(rèn)為是潛在的新興的臨床診療的生物標(biāo)志物，可以揭示來源細(xì)胞的生理信息，為臨床診斷提供新方法?；诖耍芯块_發(fā)一種能夠獲得高濃度、高純度的外泌體分離方法顯得尤為重要。

2 外泌體的臨床應(yīng)用

早期人們認(rèn)為外泌體是細(xì)胞內(nèi)的“清道夫”，負(fù)責(zé)搬運(yùn)細(xì)胞產(chǎn)生的廢物［6］。后來，人們逐漸了解到外泌體還具有其他的生物學(xué)功能，如細(xì)胞通訊、運(yùn)輸載體等。反映到不同的細(xì)胞上，外泌體具有相應(yīng)的特異性功能，如抗原呈遞，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)免疫反應(yīng)等。

外泌體是生命科學(xué)的一個(gè)前沿領(lǐng)域，已有越來越多的學(xué)者關(guān)注外泌體的臨床研究。例如，外泌體可以促進(jìn)血管生成，抗凋亡，增進(jìn)有絲分裂，促進(jìn)生長因子釋放，能夠誘導(dǎo)修復(fù)心肌，減少心臟損傷范圍［11］。并且外泌體被認(rèn)為是腫瘤臨床診療的生物標(biāo)志物，比如食管癌［12］、結(jié)腸癌［13］、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤［14］的潛在標(biāo)志物均來自從血液中分離的外泌體。研究［15］證實(shí)，外泌體在胰腺癌診斷中也具有非常重要的標(biāo)志性價(jià)值。Taylor等［16］首先提出可以通過檢測血液外泌體miR?NA來診斷卵巢癌，并且該研究團(tuán)隊(duì)表示：從血清中分離出的腫瘤來源外泌體中的miRNA與卵巢癌組織中提取出的miRNA具有很好的相關(guān)性。外泌體不僅可以改善腫瘤細(xì)胞生存環(huán)境［17］，并且外泌體中的RNA進(jìn)入靶細(xì)胞后還可以調(diào)控腫瘤的發(fā)展［18］?？梢哉f，外泌體與腫瘤診療有著極其密切的關(guān)系，早期發(fā)現(xiàn)對提高癌癥患者的存活率至關(guān)重要。外泌體不僅在腫瘤醫(yī)療領(lǐng)域具有廣闊的前景，在新型藥物投遞策略領(lǐng)域中被認(rèn)為是一種天然的藥物運(yùn)輸載體［19］。此外，間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體（MSC?Exosomes）被一部分學(xué)者認(rèn)為是未來生物療法的理想載體［19－20］。

3 外泌體的分離方法

外泌體分離方法一般基于外泌體的物理化學(xué)特性，如尺寸、密度、質(zhì)量、表面蛋白等。本研究認(rèn)為高效的外泌體分離方法是利用外泌體在醫(yī)療診斷、預(yù)測及制藥領(lǐng)域能否有實(shí)質(zhì)性突破的前提。下面，本文將綜述幾種常見的外泌體分離方法，并重點(diǎn)討論基于微流控技術(shù)的外泌體分離方法。

3.1 超速離心法 超速離心法分離外泌體是目前最普遍的一種方法。據(jù)估計(jì)，采用超速離心法的研究者占所有外泌體分離方法的56%［21］。超速離心法的步驟［22］如圖2所示。最后用PBS洗滌，獲得外泌體。

該法不需要對外泌體進(jìn)行標(biāo)記或者使用其他分離試劑，不易被污染，適用于大劑量樣品分離。但是在分離過程中，由于超高速離心，外泌體的結(jié)構(gòu)、功能很容易遭到破壞，并且易聚集成塊，下游分析不利。此外，

該法較為耗時(shí)且需要專門的技術(shù)人員。

圖2 超速離心法分離外泌體步驟示意圖

3.2 蔗糖密度梯度離心法 蔗糖密度梯度離心法是基于超速離心法的一種外泌體分離方法，是對超速離心法的改進(jìn)與優(yōu)化。這種方法是在超速離心力的作用下，使蔗糖溶液從低到高形成連續(xù)分布的密度梯度層，通過形成的不同區(qū)域的條帶對外泌體進(jìn)行分離，外泌體將在 1.13～1.19 g/mL 的密度區(qū)域富集［23］。

3.3 商品化試劑盒沉淀法 商品化試劑盒沉淀法具有操作簡便、不需要特殊設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)。然而，市面上的商品化試劑盒，往往價(jià)格較為昂貴，不利于大批量地提取外泌體。黃依瑤等［24］對超速離心法、EXO?Quick試劑盒、TEI試劑盒三種方法針對分離獲得的外泌體標(biāo)志物特異性表達(dá)情況進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，差速離心法所獲得的外泌體對 CD9、CD63、TSG101均表達(dá)，而試劑盒法提取到的外泌體僅表達(dá)TSG101。目前，用于外泌體分離的比較常用的商品化試劑盒有 EXOQuick（美國 System Biosciences公司）、TEI（美國 Invitrogen 公司）。

3.4 聚合物沉淀法 聚合物沉淀法是一種利用外泌體膜（磷脂雙分子層膜）疏水的特性對外泌體進(jìn)行沉淀富集的方法。渠香云等［25］建立了一種采用PEG8000對血清中的外泌體進(jìn)行富集、分離的方法，并與超速離心法、商品化EXOQuick試劑盒進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PEG8000沉淀法相較于前兩種方法，所獲得的外泌體粒徑較小，粒徑在30～150 nm的比例更高。這一結(jié)果證明PEG8000沉淀法所獲得的外泌體純度較高，夾雜的大囊泡結(jié)構(gòu)較少。聚合物沉淀法具有不需要大型昂貴儀器設(shè)備，可大劑量樣品處理的優(yōu)點(diǎn)。但是，會(huì)受到共沉淀的其他物質(zhì)的污染，影響下游分析。

3.5 超濾法 超濾法是一種依靠超濾膜兩側(cè)的壓力差作為動(dòng)力來分離外泌體的方法。由于超濾過程是在常溫下進(jìn)行的且不需添加化學(xué)試劑，所以對外泌體基本無成分破壞，也不會(huì)造成化學(xué)污染，因此分離出的外泌體純度較高。林韓翡等［26］利用液壓透析濾過法首次對健康成人24 h尿液中所有外泌體進(jìn)行分離、富集并分析。該研究團(tuán)隊(duì)表示此方法對分離健康成人24 h尿液（1～3 L）具有高效（需 20 h）、簡單等特點(diǎn)。胡國文等［27］研發(fā)出的旋轉(zhuǎn)超濾法為以后的外泌體基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究和臨床實(shí)驗(yàn)提供了一種新型的外泌體獲取方法。據(jù)報(bào)道，該方法可以快速、大量地從骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中獲取外泌體。

3.6 免疫磁珠法 免疫磁珠法分選具有特異性強(qiáng)、純度較高、不影響外泌體結(jié)構(gòu)形態(tài)的特點(diǎn)，但是效率低，且磁珠較為昂貴，難以普及。免疫磁珠分選步驟如圖3所示。董寧［28］利用修飾了Glypican?1抗體的免疫磁珠來分離胰腺癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的外泌體。據(jù)該報(bào)道，這種免疫磁珠分選法能夠特異性的識別胰腺癌外泌體，且操作簡便，樣品消耗較少。雖然免疫磁珠法具有、特異性強(qiáng)、純度高的優(yōu)勢，但Batrakova等［29］指出腫瘤的異質(zhì)性可能對特異性識別造成不利影響，并且抗原表位可以被阻斷或掩蔽，同樣不利于特異性識別。

圖3 免疫磁珠法步驟

3.7 微流控芯片法 傳統(tǒng)的外泌體分離方法消耗的樣品量較大，不利于稀缺樣品量的分離，且樣品的分離與檢測是分開進(jìn)行的。從外泌體的分離純化到最后經(jīng)過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，要經(jīng)過多道程序。一種快速簡便集成分離和檢測的方法是必不可少的，因此，近年來利用微流控芯片來分離外泌體得到眾多學(xué)者的關(guān)注［30－31］。 近日，美國杜克大學(xué) Wu 等［32］研發(fā)了一種聲波?微流控技術(shù)，該技術(shù)利用聲壓節(jié)點(diǎn)使不同大小的顆?；蚣?xì)胞偏離中心，從而使在通道末端不同大小的顆?；蚣?xì)胞被分開。這種技術(shù)可在不到25 min的時(shí)間里處理100 μL未稀釋的血液樣本，且樣本回收率及純度分別可達(dá)到82.4%和98.4%。此外，該研究團(tuán)隊(duì)利用納米粒子追蹤分析技術(shù)（NTA），得出分離前后直徑小于140 nm的顆粒分別占總顆粒數(shù)目的23.6%和23.3%的結(jié)論，證明了該技術(shù)在分離過程中外泌體損失極少。美國斯坦福大學(xué)的Liu等［33］研發(fā)出了一種外泌體全分離芯片（以下簡稱EXOTic）。為研究細(xì)胞外囊泡（以下簡稱EVs）尺寸對蛋白質(zhì)表達(dá)譜的影響，研究人員采用兩種不同孔徑濾膜的芯片分離前列腺癌細(xì)胞系的EVs，并與超速離心法對比。研究結(jié)果表明，EXOTic相較于超速離心法分離出的EVs含有更多種類的蛋白質(zhì)。與此同時(shí)，韓國一研究團(tuán)隊(duì)在ACS Nano公布了一種基于尺寸的臺式離心微流體系統(tǒng)（以下簡稱Exodisc）［34］，該技術(shù)通過兩個(gè)集成的納米級濾膜，可在30 min內(nèi)全自動(dòng)富集20～600 nm的EVs。該研究團(tuán)隊(duì)將Exodisc富集細(xì)胞外囊泡的效率同超速離心法對比（表1）。顯然，相較于超速離心法，Exodisc分離、富集EVs的效率更高。

表1 Exodisc與超速離心法富集效率對比

最近，中科院Liu等［35］研發(fā)了一種基于微流體粘彈性流動(dòng)的無外場外泌體分離技術(shù)，該技術(shù)可以獲得高純度（＞90%）、高回收率（＞80%）的外泌體。該技術(shù)的特點(diǎn)是僅需極少量的（0.1%）PEO（聚環(huán)氧乙烷）就可在無外場的情況下實(shí)現(xiàn)外泌體分離。PEO的加入使得流體產(chǎn)生了較高的粘彈性，因此，在泊肅葉流中懸浮的納米顆粒上產(chǎn)生了可控制粒子橫向位置的彈性升力。此外，外泌體通過微流道的時(shí)間小于0.1 s，大大地減少了分離過程中對外泌體造成的物理破壞。

與傳統(tǒng)方法相比，微流控技術(shù)具有顯著的潛力與廣闊的前景。一方面，微流控技術(shù)能夠分離小體積樣品中的外泌體，有助于臨床前腫瘤小動(dòng)物模型試驗(yàn)的研究。Kong等［36］建立了一種研究腫瘤轉(zhuǎn)移的仿生微流控模型，相較于傳統(tǒng)的小動(dòng)物腫瘤轉(zhuǎn)移模型，該模型為動(dòng)物模型試驗(yàn)提供了一種低成本、省時(shí)、快速的替代方法。另一方面，就臨床潛力來講，微流體技術(shù)自動(dòng)化程度高，所需樣品量小，相較于超速離心法更適合臨床應(yīng)用。

表2 各類外泌體分離方法優(yōu)缺點(diǎn)比較

4 外泌體的鑒定及定量方法

4.1 外泌體表面蛋白鑒定

4.1.1 Western blotting 法 Western blotting 法又稱蛋白質(zhì)印跡法，是一種非常有用的鑒定蛋白質(zhì)的方法。由于外泌體膜表面存在特異蛋白“四跨膜家族”，因此利用WB法可以很好地鑒定外泌體。

4.1.2 BCA 蛋白檢測法 Bicinchoninic acid （BCA）法是近來廣泛應(yīng)用的蛋白定量方法之一。與外泌體分離方法一樣，蛋白質(zhì)定量方法至今還沒有出現(xiàn)一種廣泛適用于任何需求的方法，現(xiàn)在的各種蛋白質(zhì)定量法都各有各的長處與不足。因此，在定量蛋白質(zhì)時(shí)往往采取不只一種方法來排除不相干因素的影響。本文介紹的BCA法靈敏度高，操作簡易，受干擾物質(zhì)的影響小。BCA法的顯著優(yōu)點(diǎn)是不受去垢劑的影響。

4.2 外泌體尺寸特征鑒定

4.2.1 透射電子顯微鏡 1933年，德國科學(xué)家Ruska和Knoll研制出了世界上第一臺透射電鏡（transmis?sion electron microscope，TEM），其分辨能力是光學(xué)顯微鏡的20倍。到現(xiàn)在，透射電子顯微鏡已經(jīng)誕生了80多年，其分辨能力也比1933年時(shí)提高了超過100倍，目前TEM的分辨力可達(dá)0.2 nm。研究者可以利用TEM觀測納米顆粒的直徑、形狀、結(jié)構(gòu)等，如外泌體、病毒、抗體疫苗等顆粒。但是，由于透射電鏡視野的局限性，TEM無法為研究者提供可靠、相對準(zhǔn)確的外泌體濃度。

4.2.2 納米粒子追蹤分析法 納米粒子追蹤分析技術(shù)（nanoparticle tracking analysis，NTA）是近年來納米級別測量領(lǐng)域的一顆冉冉升起的新星，它是一種能夠表征納米顆粒分布的動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)。納米粒子追蹤分析法獨(dú)特的測量技術(shù)可以為研究者提供可靠的外泌體實(shí)時(shí)濃度信息，可以對外泌體進(jìn)行定量檢測。電子顯微鏡的樣本在使用前通常需要經(jīng)過干燥、固定等有可能損壞外泌體的結(jié)構(gòu)與功能。與此不同，納米顆粒追蹤分析儀具備的溶液狀態(tài)可以使外泌體在被測量時(shí)更接近其原始狀態(tài)，不僅能夠保證其結(jié)構(gòu)與功能的完好性，而且使研究結(jié)果更加真實(shí)有效。

4.2.3 原子力顯微鏡 原子力顯微鏡（automic force microscopy，AFM）具有非常廣泛的適用性，并且具有諸多優(yōu)點(diǎn)。與電子顯微鏡不同，AFM能夠提供真正的三維表面圖。其次，AFM不需要對樣品進(jìn)行預(yù)處理。此外，AFM對工作環(huán)境、樣品制備的要求比電鏡低得多，因此得到了廣泛的應(yīng)用［37］。

5 結(jié)論與展望

越來越多的研究已經(jīng)證實(shí)外泌體對疾病體外診斷具有重要的標(biāo)志性價(jià)值，因此外泌體的分離和富集技術(shù)的可靠性尤為重要。外泌體分離技術(shù)種類較多，每一種分離方法都是基于外泌體某一獨(dú)特的性質(zhì)，如尺寸、密度、可壓縮率，表面蛋白等。但是，這些分離技術(shù)尚存在回收率低、純度低、可能會(huì)受到污染等問題，嚴(yán)重影響下游結(jié)果的分析?？傮w來說，外泌體分離還沒有形成一種高效的、大家共同認(rèn)可的技術(shù)方法。

微流控技術(shù)在微觀領(lǐng)域良好的性能在外泌體分離上得到了發(fā)揮，已有學(xué)者在微流控芯片上對外泌體進(jìn)行分離、檢測和量化，甚至對外泌體表面多種標(biāo)志物進(jìn)行檢測。利用微流控技術(shù)分離方法和傳統(tǒng)方法相比，分離和富集效率更高，對外泌體造成的物理損害大大減小，并且分離速度更快。雖然該方法還不是特別完善，尚未得到大家統(tǒng)一共識，但是其良好的性能已經(jīng)在目前的研究中得到了驗(yàn)證。因此，還需要學(xué)者們對微流控技術(shù)分離外泌體方法的可靠性進(jìn)行大量的驗(yàn)證。只有研究開發(fā)出高效可靠的外泌體分離和檢測方法，外泌體在醫(yī)療診斷、檢測上的獨(dú)特性能才能得到有效的發(fā)揮。體外檢測技術(shù)在疾病診斷中的應(yīng)用也將因此達(dá)到新的高度。

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