朱 瑩，丁順凱，林烈文，劉 松，林小聰，鐘克力，戴 勇，潘 凱

（暨南大學第二臨床醫(yī)學院，深圳市人民醫(yī)院：1臨床醫(yī)學研究中心，2胃腸外科，廣東深圳518020）

0 引言

胃癌（gastric cancer，GC）是消化道常見的惡性腫瘤之一，由于早期癥狀多缺乏特異性，早期病例僅占胃癌手術病例的10%～20%，大約三分之二的患者在確診時已經(jīng)處于中晚期或已出現(xiàn)淋巴結(jié)、血行轉(zhuǎn)移，其五年生存率僅為20%～30%［1－2］。 胃癌的發(fā)病、進展及侵襲機制涉及多種免疫、遺傳、分子機制及細胞生物等因素，研究胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的分子調(diào)控機制，尋找新的生物學靶標對胃癌的診斷、治療、預后及開展個體化治療等都具有重要意義。

免疫組庫（immune repertoire，IR）是指在任何指定時間，某個個體的循環(huán)系統(tǒng)中所有功能多樣性B細胞或者T細胞的多態(tài)性總和。研究［3－4］表明，腫瘤患者局部或者全身處于免疫抑制或者免疫缺陷狀態(tài)，是腫瘤發(fā)揮免疫逃逸的關鍵因素之一。腫瘤浸潤淋巴細胞（tumour?infiltrating lymphocytes， TIL） 作為機體局部免疫狀態(tài)的標志，在腫瘤免疫中起著重要的作用，TIL與腫瘤預后的關系在多種腫瘤中都已經(jīng)得到證實［5－6］。早期的研究技術可以鑒別 TIL中T細胞類型，在群體水平闡明效應、輔助及調(diào)節(jié)性T細胞與臨床結(jié)果的關系。但只有極少量的數(shù)據(jù)研究了TIL種群在空間上是否局限于腫瘤微環(huán)境，并區(qū)分于循環(huán)T細胞庫。近年來，采用高通量測序技術研究個體免疫細胞的多態(tài)性已成為腫瘤免疫學研究的熱點［7－9］。借助于免疫組庫高通量測序技術，直接對腫瘤組織中所有的 T細胞抗原受體（T?cell receptor，TCR）基因進行深度序列測定，可以了解腫瘤內(nèi)TCR的克隆性變化，從整體上研究 TIL 的特性［10－13］。

本研究采用二代測序技術，采集胃癌患者的腫瘤組織、癌旁組織及外周血，提取DNA，經(jīng)多重PCR，對TCR β鏈的CDR3區(qū)進行建庫，采用 Illumina HiSeq 2000系統(tǒng)測序，分析比較胃癌患者不同類型組織TCR CDR3組庫的組成特征。

1 材料和方法

1.1 一般資料 原發(fā)性胃腺癌病例來源于深圳市人民醫(yī)院，收集胃癌患者經(jīng)手術切除的腫瘤組織及癌旁組織，胃癌診斷經(jīng)由組織病理學檢查確認，同時在術前采集患者外周血。7例胃癌病例中，4例男性，3例女性，年齡 26～85 歲，平均年齡（62.4±21.9）歲。

1.2 DNA提取及PCR建庫 血液及組織DNA提取采用Qiagen DNA提取試劑盒，使用Qubit fluorome?ter測定DNA濃度。取500 ng基因組DNA作為模板，采用特異的V區(qū)引物和J區(qū)引物，用QIAGEN Multiplex PCR Kit進行多重PCR。電泳檢測并使用QIAquick Gel Extraction kit膠回收100～190 bp的多重PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物中加入End Repair Mix，進行末端修復反應，并用QIAquick PCR Purification Kit進行純化。經(jīng)過末端修復后的DNA片段在其3'端連上“A”堿基，再用 Adapter oligo mix和 DNA ligase進行接頭連接，在DNA片斷上接上接頭（adapter）。通過PCR反應富集經(jīng)過接頭修飾的DNA片段，PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，膠回收（QIAquick Gel Extraction kit）目的片段，完成文庫構建。

1.3 文庫檢測及測序 使用Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent DNA 1000 Reagents）檢測文庫的插入片段范圍；并使用 ABI StepOnePlus Real?Time PCR System（TaqMan Probe）對文庫進行濃度的定量。

將檢測合格的文庫加入NaOH變性成單鏈，并稀釋，加入到FlowCell內(nèi)，與FlowCell上的接頭雜交，然后在簇生成平臺cBot上完成橋式PCR擴增。最后將制備好的FlowCell采用Illumina HiSeq 2000測序系統(tǒng)測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析 原始數(shù)據(jù)經(jīng)過過濾、拼接得到合并序列，用miTCR軟件自動校正序列錯誤。比對完成后，統(tǒng)計TCRβ鏈CDR3克隆的表達及插入缺失情況，并統(tǒng)計CDR3序列的長度分布。

根據(jù)比對分析得到的結(jié)果，統(tǒng)計每一個克隆的表達情況，分別統(tǒng)計DNA序列、氨基酸序列、V?J組合的表達情況。采用方差分析評價三組樣品的VJ基因取用及氨基酸取用差異。同時統(tǒng)計每一個樣品中每個克隆的表達情況，進行樣品多樣性差異分析和克隆表達差異分析。

2 結(jié)果

2.1 測序數(shù)據(jù)匯總 統(tǒng)計腫瘤組織（TIL組）、癌旁組織（adjacent normal tissues， ADJ）、外周血（periph?eral blood mononuclear cell，PBMC）三組標本的測序數(shù)據(jù)產(chǎn)出情況，其中，ADJ獲得的克隆數(shù)為（41 188±29 417）、PBMC 組的克隆數(shù)為（32 184±16 054），TIL 組則為（36 038±18 999）。可以看出，癌旁組樣品的平均克隆類型最高，其次是腫瘤組，最少的是外周血（無顯著差異）。

2.2 VJ基因取用差異分析 通過統(tǒng)計分析在每個分組里面有不少于3個樣品有表達的VJ基因，采用方差分析（Aov）比較了 TIL、ADJ、PBMC三組的 VJ基因取用差異，得到了23種具有顯著差異（P＜0.05）的VJ基因（表 1）。

2.3 CDR3的氨基酸（aa）差異分析 根據(jù)測序得到的CDR3區(qū)氨基酸序列，將每個樣品的總克隆型（total clonotype）均一到1M總量，此外，至少有一個分組里面有3個樣品有表達的克隆型才會用于檢驗。統(tǒng)計得到TIL、ADJ、PBMC3組標本的CDR3的氨基酸差異取用情況。其中41種氨基酸序列具有顯著差異（P＜0.05，表 2）。

表1 三組樣品間23種差異取用的VJ基因

2.4 組間差異及高表達克?。╤yper express clono?type，HEC）分析 每個樣品中表達比例高于1%的克隆型被認為是超高表達的克隆，用方差分析及成對T檢驗統(tǒng)計分析三組樣品的總克隆型（total clono?type）、單一克隆型（uniq clonotype）、高表達克隆、D50等數(shù)據(jù)。統(tǒng)計結(jié)果顯示，除了外周血與腫瘤組織的香儂多態(tài)性差異顯著（P＝0.029）之外，三組之間的統(tǒng)計值無顯著差異（P＞0.05），表明胃癌患者不同組織間的TCR克隆多態(tài)性及分布頻率差異不明顯。

2.5 組間共有克隆（shared clonotype）分析 將每個樣品的克隆型總表達量歸一到1 M，其中平均表達量不小于1的克隆型視為高質(zhì)量的克隆型，統(tǒng)計分析三組樣品中共有的總克隆型（圖1）及高質(zhì)量克隆型（圖2）。圖1可見，ADJ的總克隆型種類數(shù)最高，TIL其次。與圖1比較，圖2中顯示癌旁組的高質(zhì)量的克隆型并未明顯增多，表明癌旁組克隆型多數(shù)為低表達，此外，在組間共有的高質(zhì)量克隆型種類上，癌旁組織與腫瘤組織（12 842）明顯多于癌旁組織與外周血（1211）及腫瘤組織與外周血（1925）。

表2 三組樣品間41種差異取用的氨基酸序列

圖1 TIL、ADJ、PBMC中共有的總克隆型分布

圖2 TIL、ADJ、PBMC中共有的高質(zhì)量克隆型分布

3 討論

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，其分子機制的研究及靶向藥物的開發(fā)對于早期診斷、治療及預后具有重要意義。腫瘤浸潤淋巴細胞作為重要的抗腫瘤免疫細胞，能夠直接反映腫瘤微環(huán)境中的免疫狀態(tài)，并與腫瘤預后相關［5－6］。 其中，T淋巴細胞是參與特異性免疫應答的主要效應細胞，其細胞表面的抗原受體是由2條多肽鏈αβ或γδ通過二硫鍵連接而成的異二聚體，其中αβ T細胞占絕大多數(shù)。在個體發(fā)育過程中，TCR β鏈的V、D、J基因片段發(fā)生重排，形成具有高度多樣性的可變區(qū)——互補決定區(qū)3（complementarity?determining region， CDR3），其序列決定了一個獨特的TCR克隆型，因此可通過檢驗CDR3的長度或序列來判斷T細胞的克隆性。

Luo等［14］分析了不同分化程度的胃腸道腫瘤患者外周血中CD4＋/CD8＋T細胞亞群的CDR3譜型，發(fā)現(xiàn)復雜性積分（the complexity scores，反映TCR庫的多樣性）與腫瘤組織分化程度顯著相關。此外，研究［15］證實預后較差的胃癌患者外周血中往往能發(fā)現(xiàn)特異性的T細胞沒有被充分的誘導或者作用被抑制。近年來，采用高通量測序技術直接針對腎癌、卵巢癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌等腫瘤組織中TIL的克隆特性的研究也有報道［10－13］。 在胃癌的研究上，Jia等［16］研究了28例胃癌病例的腫瘤組織、正常粘膜及外周血中T細胞的多樣性，發(fā)現(xiàn)CDR3的氨基酸克隆型分布在不同組織中無顯著差異。Kuang等［17］則檢測了19例不同階段胃癌患者的41個組織樣品，發(fā)現(xiàn)T細胞克隆的多樣性及分布頻率在胃癌發(fā)展過程中沒有變化。但胃損傷及相鄰組織T細胞克隆的重疊隨腫瘤發(fā)生過程降低。

本研究對7例胃癌病例的腫瘤組織、癌旁組織、外周血共20個樣品分別進行了TCR β鏈CDR3區(qū)測序，獲得了一些差異性取用的VJ基因序列及氨基酸序列。而CDR3全部克隆型、單一克隆型、高表達克隆的分布在不同組織間沒有顯著差異。在三組樣品的總克隆型及高質(zhì)量克隆型的重疊情況上，癌旁組織的總克隆型種類數(shù)最高，腫瘤組織其次，推測腫瘤組織內(nèi) TIL可能受到腫瘤相關抗原（tumor?associated antigen，TAA）的影響，其CDR3庫呈現(xiàn)限制性表達的特點。此外，癌旁組織的TIL克隆型多數(shù)為低表達，癌旁組織與腫瘤組織的高質(zhì)量的共有克隆型明顯多于外周血，提示腫瘤組織T細胞向癌旁組織滲透的可能，即這些差異克隆型可能參與了胃癌細胞的遷徙及擴散過程，其具體作用機制仍需進一步研究。

由于個體免疫系統(tǒng)存在龐大的復雜性及個體差異性，不同組織樣品間同樣存在異質(zhì)性，TIL TCR克隆型的表達豐度及克隆型種類水平上的差異均可能受到影響。Jia等［16］指出，胃癌患者的TIL庫及 PB?MC庫均不代表抗腫瘤反應的總體質(zhì)量，因此不能預測疾病結(jié)果，而腫瘤鄰近粘膜組織TCR庫的多樣性指數(shù)（diversity index）則是胃癌預后的生物標志物。同樣的，本研究結(jié)果顯示，雖然不同類型組織樣品的克隆分布特性沒有顯著差異，癌旁組織的總克隆型在三種組織中種類數(shù)最高，多為低表達克隆型，提示癌旁組織的T細胞可能受到腫瘤組織及循環(huán)血液的共同影響，多樣性更高。為了消除個體差異及病例數(shù)的影響，仍需要進一步研究癌旁組織的TCR克隆型特征，以明確胃癌腫瘤微環(huán)境的特性，對胃癌特異性抗原的鑒定可能具有重要意義。

［1］Stadtl?nder CT， Waterbor JW.Molecular epidemiology， pathogenesis and prevention of gastric cancer［J］.Carcinogenesis，1999，20（12）：2195－2208.

［2］Baniak N， Senger JL， Ahmed S， et al.Gastric biomarkers： a global review［J］.World J Surg Oncol，2016，14（1）：212.

［3］Koebel CM， Vermi W， Swann JB， et al.Adaptive immunity maintains occult cancer in an equilibrium state［J］.Nature，2007，450（7171）：903－907.

［4］Lee K， Hwang H， Nam KT.Immune response and the tumor micro?environment： how they communicate to regulate gastric cancer［J］.Gut Liver，2014，8（2）：131－139.

［5］Gooden MJ， de Bock GH， Leffers N， et al.The prognostic influence of tumour?infiltrating lymphocytes in cancer： a systematic review with meta?analysis［J］.Br J Cancer，2011，105（1）：93－103.

［6］Pagès F.Tumor?associated immune parameters for personalized patient care［J］.Sci Transl Med，2013，5（214）：214fs42.

［7］Calis JJ， Rosenberg BR.Characterizing immune repertoires by high throughput sequencing： strategies and applications［J］.Trends Immunol，2014，35（12）：581－590.

［8］Friedensohn S， Khan TA， Reddy ST.Advanced Methodologies in High?Throughput Sequencing of Immune Repertoires［J］.Trends Biotechnol，2017，35（3）：203－214.

［9］Hou XL， Wang L， Ding YL， et al.Current status and recent advances of next generation sequencing techniques in immunological repertoire［J］.Genes Immun，2016，17（3）：153－164.

［10］Gerlinger M， Quezada SA， Peggs KS， et al.Ultra?deep T cell recep?tor sequencing reveals the complexity and intratumour heterogeneity of T cell clones in renal cell carcinomas［J］.J Pathol，2013，231（4）：424－432.

［11］Emerson RO， Sherwood AM， Rieder MJ， et al.High?throughput sequencing of T?cell receptors reveals a homogeneous repertoire of tumour?infiltrating lymphocytes in ovarian cancer［ J］.J Pathol，2013，231（4）：433－440.

［12］Sherwood AM， Emerson RO， Scherer D， et al.Tumor?infiltrating lymphocytes in colorectal tumors display a diversity of T cell receptor sequences that differ from the T cells in adjacent mucosal tissue［J］.Cancer Immunol Immunother，2013，62（9）：1453－1461.

［13］Bai X， Zhang Q， Wu S， et al.Characteristics of tumor infiltrating lymphocyte and circulating lymphocyte repertoires in pancreatic cancer by the sequencing of T cell receptors［J］.Sci Rep，2015，5：13664.

［14］Luo W， Liao WJ， Huang YT， et al.Cancer of the gastrointestinal tract results in a restricted T?cell repertoire dependent upon tumor differentiation［J］.Cell Immunol，2011，270（1）：47－52.

［15］Zhang XY， Chan WY， Whitney BM， et al.T cell receptor Vbeta repertoire expression reflects gastric carcinoma progression［J］.Clin Immunol，2001，101（1）：3－7.

［16］Jia Q， Zhou J， Chen G， et al.Diversity index of mucosal resident T lymphocyte repertoire predicts clinical prognosis in gastric cancer［J］.Oncoimmunology，2015，4（4）：e1001230.

［17］Kuang M， Cheng J， Zhang C， et al.A novel signature for stratifying the molecular heterogeneity of the tissue?infiltrating T?cell receptor repertoire reflects gastric cancer prognosis［J］.Sci Rep，2017，7（1）：7762.