吳小清，陳鴻策，芮 雯，游思遠(yuǎn)，李嬋藝，陳宏遠(yuǎn)，3，4

（廣東藥科大學(xué)：1基礎(chǔ)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)系，2中心實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510006；3廣東省局部精準(zhǔn)藥物遞藥制劑工程技術(shù)研究中心，4國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥數(shù)字化質(zhì)量評(píng)價(jià)技術(shù)重點(diǎn)研究室，廣東廣州510006）

0 引言

腫瘤免疫原性細(xì)胞死亡（immunogenic cell death，ICD）是細(xì)胞在發(fā)生凋亡（如放化療）的同時(shí)由非免疫原性的細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂忻庖咴缘哪[瘤細(xì)胞，繼而誘發(fā)免疫系統(tǒng)的抗腫瘤免疫效應(yīng)［1］。ICD是由細(xì)胞表面多種信號(hào)分子和細(xì)胞因子參與的復(fù)雜過(guò)程，其細(xì)胞定位及表達(dá)量水平的改變直接影細(xì)胞免疫的命運(yùn)［2］?，F(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)研究成果表明，香菇［lentinus edodes（Berk.）sing］具有增強(qiáng)免疫力，抗腫瘤，降血脂，抗血栓，健胃保肝，預(yù)防佝僂病和防治貧血等功能。香菇多糖（lentinus edodes polysaccharide）分離于香菇子實(shí)體，是香菇中的主要活性成分之一［3］?？刹捎盟峄驂A提后再醇沉的方法進(jìn)行提取，其分子量在幾千到幾十萬(wàn)道爾頓不等。香菇多糖分子主要由甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖及阿拉伯糖等組成。天然香菇多糖絕大多數(shù)具有 β?（1→3）?D?吡喃葡萄糖的基本骨架，空間結(jié)構(gòu)為β?三股繩狀螺旋立體結(jié)構(gòu)，具有生物活性，但其在抗腫瘤當(dāng)中的構(gòu)效關(guān)系還未得到闡明［4］。

已有香菇多糖在晚期肺癌治療中的應(yīng)用報(bào)道［5］，但未見(jiàn)其通過(guò)影響ICD抗腫瘤的報(bào)道。本研究主要采用人肺腺癌細(xì)胞A549為模型，考察香菇多糖體外對(duì)A549細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期及ICD相關(guān)分子、免疫檢測(cè)點(diǎn)分子和抗原呈遞分子等表達(dá)量的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 香菇多糖由廣東藥科大學(xué)范華鈞教授課題組經(jīng)水提再醇沉而分離，純度＞95%；人肺腺癌細(xì)胞A549購(gòu)自購(gòu)自美國(guó) ATCC公司；PBS、DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰酶（Trypsin?EDTA）、RPMI?1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）；雙抗（Pen Strep）購(gòu)自 Gibco公司；CCK8購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；米托蒽醌（Mitoxantrone，MTX）購(gòu)自美國(guó)Selleck生物科技有限公司；重組人干擾素?γ（IFN?γ）購(gòu)自上海近岸蛋白質(zhì)科技有限公司；細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海翔圣生物科技有限公司；BV785標(biāo)記的鼠抗人的HLA?DR 抗體（BV785?HLA?DR）購(gòu)自 Biolegend 公司；7?氨基放菌素 D（7?AAD）和 APC標(biāo)記的膜聯(lián)素 V（APC?Annexin V）購(gòu)自 Biolegend 公司；溴化乙錠（PI）購(gòu)自翊圣公司；BV650標(biāo)記的鼠抗人CD80抗體（BV650?CD80）購(gòu)自 BD 公司；Percp/Cy5.5 標(biāo)記的鼠抗人 Galectin9 抗體 （Percp/Cy5.5?Galectin9） 購(gòu)自Biolegend公司；BV510標(biāo)記的鼠抗人 CD39抗體（BV510?CD39）購(gòu)自 Biolegend 公司；BV421 標(biāo)記的鼠抗人 CD270抗體（BV421?CD270）購(gòu)自 BD 公司；APC 標(biāo)記的鼠抗人 HSP70抗體購(gòu)自 Biorbyt公司（APC?HSP70）；FITC標(biāo)記的山羊抗兔二抗和CRT一抗購(gòu)自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) A549用含10%FBS的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞置于37℃、5%CO2空氣和飽和濕度培養(yǎng)箱中按照常規(guī)方法培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞存活檢測(cè) 采用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞存活：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞接種于96孔板中，細(xì)胞密度為 1×105個(gè)/mL，每孔接種 100 μL，置于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁 24 h后加入0.4～12.8 μg/μL的香菇多糖，并設(shè)置不加藥的空白對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)24 h和48 h后，每孔加入10 μL的CCK8，96孔板于培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育2 h，然后分別在24 h和48 h采用酶標(biāo)儀檢測(cè)各樣品在450nm處的吸光度值。

1.2.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用 AnnexinV/7AAD 雙染法?流式檢測(cè)與分析細(xì)胞凋亡：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞密度為2.0×105個(gè)/mL，每孔接種2 mL，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁 24 h 后加入 0.4～8.0 μg/μL 的香菇多糖，4.52 ng/μL的 MTX 設(shè)為陽(yáng)性對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng) 48 h，0.25%的胰酶消化后收集細(xì)胞，重懸細(xì)胞使其終濃度為1×105個(gè)/mL，取 100 μL 細(xì)胞懸液于 5 mL 離心管中，加入 5 μL 100 μg/mL PE?Annexin V 和 1 μL 100 μg/mL 7AAD 工作液，室溫避光孵育 15 min，染色1 h。流式細(xì)胞儀上樣檢測(cè)與分析。

1.2.4 細(xì)胞周期檢測(cè) 采用PI單染法?流式檢測(cè)細(xì)胞周期：取對(duì)數(shù)期的A549細(xì)胞接種于直徑為60 mm的培養(yǎng)皿中，細(xì)胞密度為 2.0×105個(gè)/mL，每孔接種3 mL，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁24 h 后加入濃度為 0.5～2.0 μg/μL 的香菇多糖，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，0.25%的胰酶消化細(xì)胞，離心收集細(xì)胞并使用預(yù)冷－20℃的70%乙醇4℃固定過(guò)夜，離心收集細(xì)胞，過(guò)濾，重懸細(xì)胞使其終濃度為1×105個(gè)/mL，取 100 μL 細(xì)胞懸液于 5 mL 離心管中，加入 1 μL 50 μg/mL 的 PI、 2 μL 100 μg/mL RNase A在4℃避光孵育30 min。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)與分析各樣品中PI的熒光強(qiáng)度。

1.2.5 腫瘤細(xì)胞免疫原性死亡相關(guān)分子的檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞接種于24孔板中，細(xì)胞密度為 2.0×105個(gè)/mL，每孔接種 0.5 mL，置于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁24 h后加入0.5～4.0 μg/μL的香菇多糖，并設(shè)置不加香菇多糖的空白對(duì)照組和20 ng/μL IFN?γ作為陽(yáng)性對(duì)照，每孔重復(fù)3次。繼續(xù)培養(yǎng)24 h及48 h后，0.25%的胰酶消化收集細(xì)胞，過(guò)濾、重懸細(xì)胞使其終濃度為1×105個(gè)/mL。取100 μL細(xì)胞懸液于5 mL離心管中，加入 1 μL 50 μg/mL BV786 標(biāo)記的 HLA?DR 抗體在 4℃避光孵育30 min。含1%FBS的PBS洗滌一次后，分別在24 h和48 h采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)與分析各樣品中的BV786 熒 光 強(qiáng) 度。 CD80、 Galectin9、 CD39、 CD270、HSP70、CRT等分子的表達(dá)量檢測(cè)與分析采用上述類似方法。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用SPSS9.0和Graphpad Prim軟件分析，結(jié)果以x±s表示。組間差異比較采用t檢驗(yàn)分析，P＜0.01具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 香菇多糖對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響 CCK8法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率的結(jié)果表明：香菇多糖對(duì)A549細(xì)胞的增殖具有顯著抑制作用，香菇多糖在24 h和 48 h，IC50分別為 6.258 μg/μL 和 15.823 μg/μL（圖 1）。

圖1 不同濃度的香菇多糖處理48 h后對(duì)A549細(xì)胞存活率的影響

2.2 香菇多糖對(duì)A549細(xì)胞凋亡及其周期的影響

不同濃度的香菇多糖處理A549細(xì)胞48 h后，Annex?inV/7AAD雙染?流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果表明：香菇多糖明顯誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生凋亡，且細(xì)胞發(fā)生早期凋亡率提高最為明顯（圖2）。

圖2 不同濃度的香菇多糖對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響

不同濃度的香菇多糖對(duì)A549細(xì)胞的周期影響結(jié)果表明：香菇多糖作用48 h后，細(xì)胞周期各階段的細(xì)胞數(shù)目比例都發(fā)生明顯的改變：隨香菇多糖濃度的增加，G0/G1期細(xì)胞比例減少，S期細(xì)胞比例上升，而G2/M期細(xì)胞比例不變，表明香菇多糖對(duì)細(xì)胞周期S期都具有阻滯作用（圖3、4）。

圖3 不同濃度的香菇多糖對(duì)A549細(xì)胞周期的影響

圖4 不同濃度的香菇多糖對(duì)A549細(xì)胞周期的影響

2.3 香菇多糖對(duì)細(xì)胞ICD相關(guān)分子表達(dá)的影響為探究香菇多糖對(duì)A549細(xì)胞死亡信號(hào)分子鈣網(wǎng)蛋白（calreticulin， CRT）的影響，分別以 0.5～4.0 μg/μL的香菇多糖作用A549細(xì)胞48 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面CRT的表達(dá)。結(jié)果顯示：香菇多糖都能明顯誘導(dǎo)A549細(xì)胞CRT表達(dá)提高，促進(jìn)A549細(xì)胞在凋亡的同時(shí)使CRT從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)大量轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜表面（圖5）；不同濃度的香菇多糖都能明顯誘導(dǎo)A549細(xì)胞表達(dá)熱休克蛋白 70（heat shock proteins 70，HSP70），促進(jìn)A549細(xì)胞在凋亡的同時(shí)釋放帶有特異性抗原肽的HSP70（圖6）。

圖5 不同濃度的香菇多糖處理48 h后對(duì)A549表達(dá)CRT的影響

2.4 香菇多糖對(duì)免疫檢查點(diǎn)相關(guān)分子表達(dá)的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明：0.5～4.0 μg/μL 的香菇多糖都能明顯誘導(dǎo)A549細(xì)胞免疫系統(tǒng)功能抑制性蛋白 CD270、CD39及CD80表達(dá)量升高 （圖7～9）。 但誘導(dǎo)A549表面免疫檢測(cè)點(diǎn)分子Galectin9蛋白表達(dá)量明顯下降（圖9）。

圖7 不同濃度的香菇多糖處理48 h后對(duì)A549表達(dá)CD270的影響

圖8 不同濃度的香菇多糖處理48 h后對(duì)A549表達(dá)CD39的影響

圖9 不同濃度的香菇多糖處理48 h后對(duì)A549表達(dá)CD80的影響

圖10 不同濃度的香菇多糖處理48 h后對(duì)A549表達(dá)Galec?tin9的影響

為了進(jìn)一步探究香菇多糖對(duì)A549細(xì)胞表面CD4＋T細(xì)胞識(shí)別抗原MHC?II表達(dá)的影響，香菇多糖處理A549細(xì)胞48 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表達(dá)結(jié)果顯示，香菇多糖可顯著促進(jìn) A549表面 MHC?II表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，香菇多糖刺激 A549細(xì)胞表達(dá)MHC?II的最佳濃度約為4 μg/μL ，作用時(shí)間為48 h（圖 11）。

圖11 不同濃度的香菇多糖處理48 h后對(duì)A549表達(dá)MHC?II的影響

3 討論

我們?cè)疾爝^(guò)香菇多糖分別處理HT1299、PC?9、H1975、A549、Huh7及HepG2等多種腫瘤細(xì)胞系后對(duì)ICD相關(guān)分子表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)僅對(duì)A549細(xì)胞的影響最為明顯。本研究因而選擇A549肺癌細(xì)胞株為模型分別考察了香菇多糖的促細(xì)胞凋亡作用，對(duì)細(xì)胞周期的影響。香菇多糖對(duì)A549細(xì)胞的增殖具有抑制作用且具有時(shí)間和濃度依賴性，誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生早期凋亡且對(duì)細(xì)胞周期S期都具有阻滯作用。

本研究進(jìn)一步考察了香菇多糖對(duì)A549細(xì)胞發(fā)生ICD的兩大標(biāo)志物CRT和HSP70的影響。本研究發(fā)現(xiàn)香菇多糖在誘導(dǎo)A549凋亡的同時(shí)增加細(xì)胞膜表面CRT表達(dá)的水平，CRT是定位在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）的鈣結(jié)合蛋白，其跨膜轉(zhuǎn)位表達(dá)于細(xì)胞膜表面可以作為細(xì)胞毒性標(biāo)志而被機(jī)體內(nèi)的抗原提呈細(xì)胞（antigen processing cells， APCs）識(shí)別，APCs將相關(guān)的抗原肽提呈給T淋巴細(xì)胞，激活T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)機(jī)體的適應(yīng)性免疫應(yīng)答［6］。CRT在介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫原性死亡中具有非常重要的作用［7－8］，抑制CRT的表達(dá)量在很多腫瘤模型中被證實(shí)可以使腫瘤細(xì)胞的免疫原性清除［9］，而腫瘤細(xì)胞的免疫原性在敲除CRT的細(xì)胞表面重構(gòu)后又可恢復(fù)［10］。CRT蛋白跨膜轉(zhuǎn)位數(shù)量的變化與ICD呈正相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)香菇多糖抑制A549細(xì)胞增殖的同時(shí)提高了細(xì)胞膜表面HSP70的表達(dá)水平。HSP70是高度保守的熱休克蛋白家族的一員，正常情況下HSP70位于胞漿，腫瘤細(xì)胞在經(jīng)過(guò)硼替佐米或者蒽醌類藥物處理發(fā)生凋亡的時(shí)候分泌HSP70，分泌到細(xì)胞膜表面的HSP70可以促進(jìn)DC對(duì)腫瘤細(xì)胞的吞噬，促進(jìn)抗原呈遞，激活CD8＋T 細(xì)胞［11］。 HSP70 變化與 ICD 呈正相關(guān)［12］。細(xì)胞膜表面CRT和HSP70的共同表達(dá)可以有效激活A(yù)PCs識(shí)別腫瘤細(xì)胞繼而激發(fā)機(jī)體抗腫瘤免疫［13］。本研究結(jié)果驗(yàn)證了香菇多糖誘導(dǎo)ICD的能力，因而將香菇多糖確定為ICD誘導(dǎo)物，香菇多糖對(duì)體內(nèi)的抗腫瘤作用具有積極的影響。

本研究還考察了香菇多糖對(duì)免疫檢查點(diǎn)分子CD270、CD39、Galectin9 表達(dá)量的影響，結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)香菇多糖處理A549表面CD270、CD39的表達(dá)量增加，Galectin9的表達(dá)量減少。免疫檢測(cè)點(diǎn)主要是一類具有免疫抑制性的分子［1］，正常情況下能夠抑制T淋巴細(xì)胞的功能，在腫瘤組織中可能被腫瘤細(xì)胞利用而發(fā)生免疫逃逸。程序性死亡受體?1（programmed death protein?1， PD?1）抑制劑臨床實(shí)驗(yàn)證明可應(yīng)用于晚期黑色素瘤的治療［14］。Ipilimumab抗體應(yīng)用于晚期或者不可切除的黑色素瘤患者［15］。下調(diào)免疫系統(tǒng)功能抑制性蛋白，可以促進(jìn)DC對(duì)腫瘤細(xì)胞的抗原呈遞，增強(qiáng)T細(xì)胞的殺傷作用。免疫檢查點(diǎn)的數(shù)量變化與T細(xì)胞的殺傷作用呈負(fù)相關(guān)［16］。免疫檢測(cè)點(diǎn)分子的高表達(dá)為我們后期動(dòng)物水平聯(lián)合PD?1治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)［17－18］。上述體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果為香菇多糖抗肺癌免疫提供了實(shí)驗(yàn)的依據(jù)，后續(xù)將構(gòu)建肺癌荷瘤小鼠動(dòng)物模型，深入研究香菇多糖誘導(dǎo)荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫原性細(xì)胞死亡的體內(nèi)免疫機(jī)制，為完善香菇多糖通過(guò)免疫調(diào)節(jié)發(fā)揮抗癌作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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