羅才林 ，徐德林，錢 剛，潘胤池，陳紅波，謝 欣，上官燕妮，李 林

(遵義醫(yī)學院 醫(yī)學細胞生物學教研室，貴州 遵義 563099)

白及[Bletillastriata(Thunb.) Reichb . f.]是蘭科白及屬草本單子葉植物，又名甘根、白根、良姜、紫蘭等，主要分布于我國貴州、四川、云南、湖南、安徽等省份。白及是我國重要中藥材之一，主要功效有收斂止血、消腫生肌[1]等作用。由于白及含膠狀成分，具有較好的止血作用，可顯著縮短凝血時間[2]，可以治療咯血、吐血、外傷出血、瘡瘍腫毒、皮膚皸裂等癥狀[3]，具有可觀的藥用價值和應用前景。現(xiàn)代藥理學研究表明白及中含有豐富的聯(lián)苯類、菲類、二氫菲類等，其具有抗腫瘤、抗菌、抗炎鎮(zhèn)痛、促進傷口愈合等作用[4-6]，這些化學成分被認為可能是白及發(fā)揮抗腫瘤、抗炎和抗菌活性的物質基礎[7]。

蔗糖合酶(sucrose synthase)是植物的光合作用產物蔗糖進入各種代謝途徑所必需的關鍵酶之一，蔗糖合酶的獨特之處在于它可以催化蔗糖代謝的可逆反應，更重要的是，蔗糖合酶催化蔗糖的合成和分解時幾乎不消耗能量的方式，在不需要其他酶的參與下，允許蔗糖從“庫”快速轉化為“源”[8]。這些特點使蔗糖合酶在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮了重要的作用。已有研究表明蔗糖合酶參與淀粉合成[9]、纖維細胞分化[10]、細胞壁合成[11]和抗逆性[12]等生命活動，還能為機體提供核苷單糖供體，可使蔗糖合酶基因作為一個催化成分而影響核苷單糖的生物合成過程，具有廣泛的應用前景。

目前已在花生[13]、甜高粱[14]、甜瓜[15]和鐵皮石斛[16]等多種高等植物中分離得到了蔗糖合酶基因，但有關白及蔗糖合酶基因結構與功能的研究還未見報道。本研究通過從構建的白及轉錄組數據庫中挑取出蔗糖合酶基因序列，運用生物信息學軟件，分析該基因序列的結構、預測編碼蛋白的理化性質及功能結構域特點，為在分子水平上分析高等植物的蔗糖合酶的保守結構域研究提供基礎資料，對揭示蔗糖合酶在白及中的生物學功能以及了解其在整個糖代謝具有重要意義，也為深入分析其它物種蔗糖合酶的結構與功能關系提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究所用的白及為本課題組采集自獲得“國家地理保護標志產品”的“白及之鄉(xiāng)”貴州省正安縣的地方大規(guī)模種植品系“正安白及”，收獲田間自由散粉所結的蒴果，在實驗室組培出幼苗后移栽至室外。

1.2 白及轉錄組數據庫的構建 提取白及不同生育階段根、莖、葉、花、蒴果的總RNA進行質和量的測定后進行5G數據量的mRNA轉錄組測序。Trinity Method對測序結果進行denovo組裝，進一步將unigene序列進行信息學注解，從中挑選出被初步注解為蔗糖合酶的序列，電子克隆后進行后續(xù)分析。

1.3 序列的生物信息學分析 根據測序結果，運用NCBI的BLAST在線分析軟件進行白及蔗糖合酶核苷酸序列比對分析，并利用ORF finder分析蔗糖合酶核苷酸序列的開放閱讀框；采用Expasy Prot Param分析白及蔗糖合酶的分子量、等電點和氨基酸組成；使用在線工具SOPMA 分析白及蔗糖合酶基因的二級結構，并用軟件SWISS MODEL進行序列結構的三維建模；在線軟件EBI分析其蛋白質保守結構域，運用DNAMAN(6.0)對多物種氨基酸序列比對；使用MEGA6.0軟件的鄰接法(Neighbor-joining)構建多物種的蔗糖合酶氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)生樹；應用在線工具Psort對亞細胞進行定位分析，在線工具Profun進行功能分類預測。

2 結果

2.1 蔗糖合酶序列與氨基酸理化性質特征分析 從白及轉錄組數據庫中挑選出初步注解為蔗糖合酶的unigene，將其與NCBI數據庫中的已知核酸序列比對，發(fā)現(xiàn)與不同物種中的蔗糖合酶序列高度相似。該序列全長為2 957 bp，ORF finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/ orfig.cgi)查找開放閱讀框(ORF)發(fā)現(xiàn)，該序列包含一個完整的開放閱讀框，全長2 451 bp，共編碼816個氨基酸殘基。Expasy Prot param (http://web.expasy.org/prot-param)軟件預測顯示白及蔗糖合酶由20種氨基酸組成，其中Leu和Ser含量最高，分別為11.2%和8.3%，不含Pyl和Sec。該蛋白分子量為93.09 kDa，理論等電點(pI)為5.97，原子組成為C4211H6532N1128O1212S23，負電荷殘基(Asp + Glu)109個，正電荷殘基(Arg + Lys)90個，不穩(wěn)定系數為31.51，表明該蛋白質結構穩(wěn)定。將該基因序列提交NCBI數據庫(GI:ANW09660.1)。

2.2 二級結構預測分析 對白及蔗糖合酶的二級結構用SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/ cgi-bin/ npsa_automat.pl? page=npsa_sopma.html)進行預測，分析表明主要的結構元件是α-螺旋和無規(guī)則卷曲，符合SuSy蛋白的典型特征(見圖1)。分布比例上看，該基因816個氨基酸殘基中，396個氨基酸殘基(占48.53%)為α-螺旋結構( Alpha helix)，129個氨基酸殘基(15.81%)為線狀結( Extended strand)，201個氨基酸殘基(24.63%)為無規(guī)則卷曲結構(Random coil)，90個氨基酸殘(11.03%)為β-轉角(Beta turn)。從分布位點上來看，C端和N端富含α-螺旋，而無規(guī)則卷曲、延伸鏈和β-轉角則散布于整個蛋白質中。

藍色代表α-螺旋; 紅色代表延伸鏈; 綠色代表β-轉角; 紫色代表不規(guī)則卷曲。圖1 白及蔗糖合酶二級結構預測

2.3 結構域與三維結構預測分析 利用在線工具EBI(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)分析氨基酸序列的結構域發(fā)現(xiàn)，白及蔗糖合酶包括蔗糖合酶功能域(N端)和糖基轉移功能域(C端)。蔗糖合成相關的功能區(qū)域(sucrose_synth)在第9個氨基酸到第555個氨基酸，糖基轉移功能域(glycos transf 1)在第561個氨基酸到第741個氨基酸是與轉運相關的區(qū)域(見圖3)。在Swiss-Model顯示，白及SuSy蛋白序列與擬南芥的SuSy蛋白同源性為74.75%。以擬南芥的結構為模板，構建白及SuSy蛋白的三維結構，結果見圖2。

2.4 氨基酸序列同源性分析 以白及(GI:ANW09660.1)及其近緣屬植物的鐵皮石斛(GI:ALS55906.1)、雙子葉的模式植物甜菜(GI:AAK65960.1)氨基酸序列進行Alignment多重比對(見圖3)。比對發(fā)現(xiàn)，白及蔗糖合酶與鐵皮石斛蔗

糖合酶的氨基酸序列表現(xiàn)出高度同源性，達91.54%，從全序列差異位點來看，主要的差異位點在N端，鐵皮石斛有約40個氨基酸殘基的缺失，在氨基酸序列長度上短于其他兩種材料。另外，白及蔗糖合酶與甜菜的氨基酸序列相比，同源性為69.45%，他們在N端、C端的保守性較差，而在其他區(qū)域具有較高的相似度。三種材料的蔗糖合酶氨基酸序列相比，中部仍然存在大量完全一致的區(qū)段，這說明蔗糖合酶基因在親緣關系較近的植物中的氨基酸序列表現(xiàn)出較高的保守性。

圖2 白及蔗糖合酶的三維結構預測

黑色背景表示同源性為100%，藍色背景表示同源性為66.7%，“·”表示氨基酸缺失ANW09660.1 ：紫花白及；ALS55906.1：鐵皮石斛；AAK65960.1：甜菜。圖3 白及蔗糖合酶和鐵皮石斛及甜菜氨基酸序列同源性比對

2.5 亞細胞定位及功能預測 采用Psort(http://psort.nibb.acform)在線軟件對白及蔗糖合酶的表達部位進行預測，結果為：定位于細胞質中的概率為47.8%，細胞核中的概率為26.1%，線粒體中的概率為26.1%，表明該酶主要存在細胞質中。采用ProtFun (http://www.cbs. dtuices/ProtFun/)對白及蔗糖合酶的功能預測，則表明該蛋白具有信號轉導(40.2%)、轉錄(39.3%)、生長因子(38.1%)功能的概率較高(見表1)。

2.6 白及蔗糖合酶系統(tǒng)進化分析 選取16種單子葉植物和雙子葉植物的蔗糖合酶氨基酸序列構建進化樹，比較分析不同物種中該基因的進化與親緣關系。從構建的進化樹中可見，16條氨基酸序列分為單子葉植物組、雙子葉植物組2個分支，如圖4所示。白及蔗糖合酶歸于單子葉植物組，與鐵皮石斛、金蝶蘭、綠竹在一個大分支下，這說明該基因在進化上與這三者的親緣關系較近，尤其是與鐵皮石斛的進化上具有最高的親緣關系。氨基酸序列保守結構域分析表明各序列均有相同的motif數目，在序列上的位置稍有不同。

表1蔗糖合酶功能預測結果

功能分類預測值概率(%)信號轉導0.08640.2受體0.0052.7荷爾蒙0.00120.6結構蛋白0.00830.1運載體0.02422.2離子通道0.01017.5電壓門控離子通0.00625.3陽離子通道0.01021.5轉錄0.05039.3轉錄調控0.03124.7脅迫因子0.01112.7免疫應答0.01012.2生長因子0.00538.1金屬離子轉移0.0092.0

AAM68126.1：甘蔗；ACM69042.1：高粱；CAA26229.1：玉米；CAA78747.1：水稻；EMS59092.1：小麥；AAL50570.1：綠竹；AEA76429.1：金蝶蘭；ANW09660.1：白及；ALS55906.1：鐵皮石斛；AAA97571.1：馬鈴薯；AED92894.1：擬南芥；AEF56625.1：花生；CAA09910.1：豌豆；AEV40460.1：木棉；AIJ28962.1：木薯；AAK65960.1：甜菜。圖4 白及蔗糖合酶系統(tǒng)進化分析

3 討論

參與植物體內蔗糖代謝的酶有3種：蔗糖磷酸合成酶( Sucrose Phosphate Synthase, SPS)、蔗糖合酶( Sucrose Synthase, SuSy)、轉化酶( Invertase, Ivr)[17]，植物中廣泛存在的一種糖基轉移酶是蔗糖合酶[18]，也是催化蔗糖代謝反應的關鍵酶。在UDP存在時，蔗糖合酶可催化蔗糖分解生成UDP-葡萄糖和果糖的可逆反應[19]。而UDP-葡萄糖則作為糖基供體，為生物合成糖苷、寡糖、多糖和糖蛋白等含糖基化合物提供糖基[20]。這些特點使蔗糖合酶能影響植物的呼吸、碳水化合物的生物合成及利用等過程，因此研究植物蔗糖合酶及其功能是揭示植物生長發(fā)育規(guī)律的重要內容，而且已經有了較大進展[21]。對白及的蔗糖合酶序列進行生物信息學分析，有利于進一步了解白及蛋白所發(fā)揮的生理作用與代謝功能。

用蛋白質的氨基酸序列構建的遺傳進化樹分支能顯示物種間的親緣關系，還能評價蛋白功能的相關性，由于植物在長期適應環(huán)境的進化過程中，相關生理功能的基因因其保護作用而表現(xiàn)得相對保守[22]。本研究對蔗糖合酶進行系統(tǒng)進化分析，結果顯示白及與親緣關系較近的鐵皮石斛同處于一個分支上，其核苷酸序列同源性高達91%。進一步選擇與白及親緣關系差異較大和較小的2個物種進行蔗糖合酶氨基酸序列的多序列比對，發(fā)現(xiàn)與鐵皮石斛有高度同源性(91.54%)，說明植物蔗糖合酶氨基酸序列的一致性很高，是相對保守的結構蛋白。而近年來的多種研究分析也表明蔗糖合酶基因在不同的物種中具有功能的保守性。

預測白及蔗糖合酶氨基酸序列的結構域發(fā)現(xiàn)其具有典型的蔗糖合酶結構，蔗糖合酶基因都有蔗糖合成酶和糖基轉移酶結構域，基本單位結構域是以α-螺旋結構、無規(guī)則卷曲結構、線狀結構和β-轉角相互作用形成的復雜結構，進一步折疊形成蛋白質的三級結構。蔗糖合成酶在以下反應中催化蔗糖的合成：UDP-葡萄糖+ D-果糖= UDP +蔗糖，而蔗糖合酶的羧基末端區(qū)域屬于糖基轉移酶家族。蔗糖轉運酶能催化糖部分從激活的供體分子轉移到特定的受體分子，從而形成糖苷鍵。由此可以說明蔗糖合酶在植物的代謝網絡中起著至關重要的作用。

蛋白質的亞細胞可以決定其功能，植物的蔗糖合酶基因主要以可溶性形式存在于細胞質中，蔗糖合酶能迅速變化其在細胞中的存在方式來行使不同的生理功能。當蔗糖合酶存在于細胞質中以可溶性形式時，主要為細胞的能量代謝和淀粉的合成提供蔗糖分解的產物[23]，本文推測的白及蔗糖合酶是存在于細胞質中的可溶性穩(wěn)定蛋白，而在大麥和黃瓜等植物中也發(fā)現(xiàn)了定位在細胞質中的蔗糖合酶[24-25]。白及蔗糖合酶的功能預測主要是信號轉導，因為蔗糖是重要的信號分子，可以參與植物的生長發(fā)育過程，并且蔗糖合酶通過介導的蔗糖代謝反應釋放的己糖，其作為信號分子直接感知或者通過能量和代謝物之間的改變間接感知上游信號從而觸發(fā)信號轉導[26]。本研究首次對白及蔗糖合酶基因進行了生物信息學分析，為進一步闡明蔗糖合酶的作用機制及功能應用奠定了理論基礎，為植物白及蔗糖合酶基因的分子研究提供了理論依據及基礎資料。

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