馮光勇，張瑩瑩，張貴海

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤醫(yī)院 頭頸部科，貴州 遵義 563099)

鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是常見的頭頸部惡性腫瘤之一，其好發(fā)于亞洲東部、東南部，特別是我國(guó)南部及東南部，具有地區(qū)及家族聚集性。近年來，隨著現(xiàn)代影像學(xué)和放療技術(shù)的發(fā)展，鼻咽癌的診治得到了一定的提高，但復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是鼻咽癌治療失敗的主要原因之一。因此，如何延緩鼻咽癌進(jìn)展及提高鼻咽癌局控率是目前研究的熱點(diǎn)。ATF5 (Activating transcription factor 5)是屬于bZip家族的轉(zhuǎn)錄因子，其家庭成員還包括CREB、FOS、NRF2等明星蛋白，ATF5不僅參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡等過程，而且對(duì)細(xì)胞的應(yīng)激、維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)也具有重要意義，ATF5失調(diào)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。在多數(shù)腫瘤細(xì)胞中，ATF5蛋白的上調(diào)將促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活、遷移、參與放療抵抗，同時(shí)還能抑制自噬[1]；但在肝癌細(xì)胞中，ATF5高表達(dá)起著抑癌作用，高表達(dá)的ATF5蛋白預(yù)示著更好的預(yù)后[2]。關(guān)于ATF5在鼻咽癌中的表達(dá)情況目前鮮有報(bào)道，因此，本文通過鼻咽癌組織中ATF5蛋白表達(dá)情況，結(jié)合臨床病理特征，探討ATF5蛋白表達(dá)水平與鼻咽癌患者分期、臨床特征的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本 收集遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科2010年8月至2017年4月共45例初診鼻咽癌患者組織病理標(biāo)本，所有患者治療前均完成頭顱(鼻咽部)及頸部核磁共振、胸部、腹部影像學(xué)及全身骨顯像檢查評(píng)估。根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC 2010)進(jìn)行詳細(xì)TNM分期，所有病患病理類型均為非角化型未分化鱗癌。均采用三維放療，放療期間均予以鉑類藥物為主的同期增敏化療。其中，Ⅰ～Ⅱ期8例，Ⅲ～Ⅳ期(Ⅳ期包括Ⅳa、Ⅳb及Ⅳc期)患者37例，有遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移14例，非遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移31例，取5例癌旁組織作對(duì)照組。所有組織標(biāo)本既往均經(jīng)10%中性福爾馬林固定液固定，常規(guī)石蠟包埋，本次實(shí)驗(yàn)行4 μm連續(xù)切片10張待用。

1.2 主要試劑 兔抗人ATF5抗體購(gòu)自美國(guó)abcam公司，山羊抗兔IgG 抗體和DAB顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，蘇木素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 免疫組織化學(xué)染色 鼻咽癌組織石蠟標(biāo)本連續(xù)切片脫蠟水化，使用3%過氧化氫阻斷、滅活內(nèi)源性過氧化氫酶，置0.01M枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)中水煮修復(fù)抗原，自然冷卻至室溫，添加一抗(Anti-ATF5 antibody，工作濃度 1∶200)，置于4 ℃冰箱過夜，轉(zhuǎn)至室溫平衡30 min，添加二抗(兔kit，工作濃度 1∶400)，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，顯微鏡下觀察反應(yīng)進(jìn)度，自來水充分沖洗，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，中性樹膠封片。

1.4 結(jié)果判斷 每張切片隨機(jī)選擇3個(gè)不同的視野(×200)顯微鏡下觀察，并判斷陽性表達(dá)強(qiáng)度和陽性率。染色結(jié)果采用半定量分析方法，以染色強(qiáng)度結(jié)合陽性細(xì)胞數(shù)百分比進(jìn)行評(píng)分。染色強(qiáng)度以多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)的染色強(qiáng)度并減去背景著色計(jì)分：無明顯著色為0分，輕微為1分，中度為2分，重度為3分。陽性細(xì)胞百分比即每張免疫組化切片選擇3個(gè)不同的視野(×200)觀察：0～5%評(píng)為0分，6%～25%評(píng)1分，26%～50%評(píng)2分，51%～75%評(píng)3分，>75%均評(píng)為4分。對(duì)每個(gè)視野均進(jìn)行染色強(qiáng)度計(jì)分與陽性細(xì)胞百分比評(píng)分，最終評(píng)分以陽性細(xì)胞百分比與染色強(qiáng)度的加和：0分為陰性(-)，小于4分為弱陽性(+)，4～6分為中度陽性(++)，6～7分為強(qiáng)陽性(+++)。將陽性細(xì)胞百分比與染色強(qiáng)度的評(píng)分相乘，乘積范圍為0～12分，分值≤6分為低表達(dá)，分值>6分為高表達(dá)[3]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，ATF5表達(dá)與鼻咽癌TNM分期關(guān)系采用秩和檢驗(yàn)，ATF5表達(dá)與鼻咽癌臨床特征關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同TNM分期鼻咽癌組織ATF5表達(dá)水平 結(jié)果(見圖1)顯示：ATF5蛋白在鼻咽癌組織中存在表達(dá)，根據(jù)染色結(jié)果，可定位于腫瘤細(xì)胞胞漿及部分胞核內(nèi)；結(jié)果(見表1、圖1)顯示，早期鼻咽癌組織ATF5蛋白表達(dá)水平顯著高于中晚期鼻咽癌組織的表達(dá)水平(P=0.018)。

表1鼻咽癌組織ATF5蛋白表達(dá)情況

分期例數(shù)ATF5陰性弱陽性表達(dá)中度陽性強(qiáng)陽性UPⅠ～Ⅱ80026-2.3620.018Ⅲ～Ⅳ37012511

2.2 ATF5蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 ATF5蛋白表達(dá)水平與鼻咽癌分期(P=0.046)、腫瘤病灶(T分期)(P=0.033)呈負(fù)相關(guān)，與鼻咽癌患者性別、年齡、淋巴轉(zhuǎn)移情況、遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移及EB病毒感染無明顯相關(guān)性；見表2。

A:陰性對(duì)照;B:Ⅰ期;C:Ⅱ期;D:Ⅲ期;E:Ⅳ期，(SP ×200，邊角×400)。圖1 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)鼻咽癌組織ATF5蛋白的表達(dá)

表2鼻咽癌患者臨床資料與Nav1.5蛋白表達(dá)的關(guān)系

類別ATF5 表達(dá)例數(shù)低表達(dá)(%)高表達(dá)(%)P 性別 男性 女性37823(62.2%)5(62.5%)14(37.8%)3(37.5%)0.998年齡 >50 ≤50232215(62.2%)13(59.1) 8(34.8%)9(40.9%)0.672分期 I～I(xiàn)I III～I(xiàn)V8372(25.0%)26(70.3%)6(75.0%)11(29.7%)0.046病灶分期 T1～2 T3～420259(45.0%)19(76.0%)11(55.0%)6(24.0%)0.033淋巴分期 N0～1 N2～315309(60.2%)19(63.3%)6(40.0%)11(36.7%)0.828遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移 M0(無) M1(有)311417(54.8%)11(78.6%)14(45.2%)3(21.4%)0.235EB病毒 陽性 陰性212412(57.1%)16(66.7%)9(42.9%)8(33.3%)0.511

3 討論

ATF5是屬于bZip家族的轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡及腫瘤形成，ATF5在調(diào)節(jié)多種組織的分化中起著重要作用，如大腦、骨、肝臟、脂肪等[1]，尤其是在神經(jīng)組織上，研究顯示[4-5]，沉默小鼠ATF5基因?qū)?dǎo)致腦室區(qū)神經(jīng)細(xì)胞增殖明顯減少，提示ATF5在調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)及分化方面起著重要作用。同時(shí)ATF5在參與細(xì)胞應(yīng)激及維持蛋白穩(wěn)態(tài)方面也起著重要作用，細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)(如熱休克蛋白反應(yīng))將導(dǎo)致ATF5表達(dá)上調(diào)，上調(diào)的ATF5將介導(dǎo)分子伴侶、蛋白酶及prosurvival蛋白的轉(zhuǎn)錄，這些蛋白酶將維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)[6]。

失調(diào)的ATF5導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、發(fā)展，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的存活、遷移、抗輻射、抑制自噬，關(guān)于ATF5蛋白在腫瘤中的表達(dá)情況，有著截然相反的兩種結(jié)果，在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中，ATF5表達(dá)與腫瘤的生存、惡性程度、侵襲能力及預(yù)后相關(guān)。研究顯示[7-8]：ATF5蛋白高表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生存至關(guān)重要，干擾ATF5表達(dá)將導(dǎo)致原發(fā)性腫瘤細(xì)胞膠質(zhì)瘤死亡，但不影響腫瘤周圍正常細(xì)胞的狀態(tài)，相比之下正常的星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞并不依靠ATF5來存活[9]，ATF5在乳腺癌[10]、上皮性卵巢癌[11]、直腸癌[12]、胰腺癌細(xì)胞[13]中均存在高表達(dá)，提示ATF5高表達(dá)與腫瘤的生物學(xué)行為密切相關(guān)。ATF5與肺癌的侵襲性有關(guān)，沉默ATF5表達(dá)可以降低其侵襲能力[14]，在濾泡性淋巴瘤中，ATF5作為一種調(diào)控因子，參與疾病的進(jìn)展[15]。但是在肝癌細(xì)胞中，ATF5在肝細(xì)胞中具有潛在的抗癌功能[16]，肝癌細(xì)胞中ATF5低表達(dá)提示更差的臨床預(yù)后。本研究證實(shí)了ATF5蛋白在鼻咽癌組織中存在表達(dá)，且早期鼻咽癌組織中ATF5蛋白表達(dá)水平顯著高于中晚期鼻咽癌組織表達(dá)水平，結(jié)合臨床病理特征，進(jìn)一步揭示了ATF5蛋白表達(dá)水平與鼻咽癌患者分期(主要是T分期)顯著負(fù)相關(guān),即高表達(dá)的ATF5預(yù)示著更早的臨床T分期，低表達(dá)的ATF5預(yù)示著更晚的臨床T分期。腫瘤T分期反應(yīng)了腫瘤的局部侵襲能力，T分期越晚，腫瘤局部侵襲范圍就越大。通過我們研究結(jié)果提示：在鼻咽癌中高表達(dá)的ATF5表現(xiàn)更低侵襲能力，低表達(dá)的ATF5擁有更強(qiáng)的侵襲能力，從而影響分期。但關(guān)于ATF5如何調(diào)控這一過程仍需要深入探索。

總之，ATF5擁有眾多特性，是腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)，ATF5可以通過激活mTOR、BCL1、MCL1等信號(hào)通路參與蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄，在腫瘤的生物學(xué)行為中具有重要作用[17]，ATF5作為一種轉(zhuǎn)錄因子，雖然不能用常規(guī)小分子靶向藥物來控制，但ATF5調(diào)節(jié)藥物作為一種創(chuàng)新、安全、高效的抗腫瘤藥物是可行的[18]，可能成為未來腫瘤治療的熱點(diǎn)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Sears T K,Angelastro J M.The transcription factor ATF5:role in cellular differentiation,stress responses and cancer[J].Oncotarget,2017,8(48):84595-84609.

[2] Wu Y,Wu B,Chen R,et al.High ATF5 expression is a favorable prognostic indicator in patients with hepatocellular carcinoma after hepatectomy[J].Med Oncol,2014,31(11):269.

[3] Mei Z,Wang G,Liang Z,et al.Prognostic value of IRF-2 expression in colorectal cancer[J].Oncotarget,2017,8(24):38969-38977.

[4] Nakano H,Iida Y,Suzuki M,et al.Activating transcription factor 5 (ATF5) is essential for the maturation and survival of mouse basal vomeronasal sensory neurons[J].Cell Tissue Res,2016,363(3):621-633.

[5] Wang S Z,Ou J,Zhu L J，et al.Transcription factor ATF5 is required for terminal differentiation and survival of olfactory sensory neurons[J].Proc Natl Acad Sci USA,2012,109(45):18589-18594.

[6] Hua X M,Wang J,Qian D M,et al.DNA methylation level of promoter region of activating transcription factor 5 in glioma[J].J Zhejiang Univ Sci B,2015,16(9):757-762.

[7] Sheng Z,Evans S K,Green M R.An activating transcription factor 5-mediated survival pathway as a target for cancer therapy[J].Oncotarget,2010,1(6):457-460.

[8] Ciaccio N A,Moreno M L,Bauer R L,et al.High-yield expression in E.coli and refolding of the bZIP domain of activating transcription factor 5[J].Protein Expr Purif,2008,62(2):235-243.

[9] Greene L A,Lee H Y,Angelastro J M.The transcription factor ATF5:role in neurodevelopment and neural tumors[J].J Neurochem,2009,108(1):11-22.

[10]Ben-Shmuel S,Rashed R,Rostoker R,et al.Activating transcription factor-5 knockdown reduces aggressiveness of mammary tumor cells and attenuates mammary tumor growth[J].Front Endocrinol (Lausanne)，2017， 8:173.

[11]Chen A,Qian D,Wang B,et al.ATF5 is overexpressed in epithelial ovarian carcinomas and interference with its function increases apoptosis through the downregulation of Bcl-2 in SKOV-3 cells[J].Int J Gynecol Pathol，2012，31(6):532-537.

[12]Kong X,Meng W,Zhou Z,et al.Overexpression of activating transcription factor 5 in human rectal cancer[J].Exp Ther Med， 2011，2(5):827-831.

[13]Hu M,Wang B,Qian D,et al.Interference with ATF5 function enhances the sensitivity of human pancreatic cancer cells to paclitaxel-induced apoptosis[J].Anticancer Res， 2012，32(10):4385-4394.

[14]Nukuda A,Endoh H,Yasuda M,et al.Role of ATF5 in the invasive potential of diverse human cancer cell lines[J].Biochem Biophys Res Commun，2016，474(3):509-514.

[15]Bisikirska B,Bansal M,Shen Y,et al.Elucidation and pharmacological targeting of novel molecular drivers of follicular lymphoma progression[J].Cancer Res，2016，76(3):664-674.

[16]Gao F,Xia Y,Wang J,et al.Integrated analyses of DNA methylation and hydroxymethylation reveal tumor suppressive roles of ECM1,ATF5,and EOMES in human hepatocellular carcinoma[J].Genome Biol， 2014，15(12):533.

[17]Angelastro J M.Targeting ATF5 in Cancer[J].Trends Cancer，2017，3(7):471-474.

[18]Cates C C,Arias A D.Regression eradication of gliomas in mice by a systemically-deliverable ATF5 dominant-negative peptide[J].Oncotarget，2016，7(11):12718-12730.