裴美娟，王 愷,2，張 婷 ,3，涂 悅，耿 俐

(1.武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院 腦科中心，天津 300162；2.中國人民解放軍91428部隊 衛(wèi)生隊，浙江 寧波 315456；3.中國人民解放軍第三醫(yī)院 醫(yī)務(wù)處，陜西 寶雞 721000；4.中國人民解放軍第三醫(yī)院 婦產(chǎn)科，陜西 寶雞 721000)

腦梗死作為常見的一種腦血管疾病，近年來發(fā)病率逐漸升高，其較高的致殘率和致死率給患者及社會帶來了沉重負(fù)擔(dān)，早期干預(yù)對于患者的病情控制及預(yù)后有著重要意義[1-2]。多項(xiàng)研究證實(shí)，應(yīng)用白藜蘆醇可有效改善患者腦水腫和神經(jīng)功能損傷癥狀，但具體機(jī)制尚未形成定論[3-4]。線粒體是細(xì)胞能量代謝的重要場所，線粒體的功能障礙與細(xì)胞毒性腦水腫和神經(jīng)功能損傷程度密切相關(guān)，這提示線粒體可能是白藜蘆醇發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的重要靶點(diǎn)之一[5-6]。本研究擬通過構(gòu)建小鼠大腦中動脈栓塞(MCAO)模型，探討白藜蘆醇對腦水腫的影響，并檢測線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)拷貝數(shù)以及線粒體生物合成相關(guān)基因表達(dá)的變化，從而為探索白藜蘆醇治療腦梗死的機(jī)制提供更多基礎(chǔ)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 雄性C57BL/6小鼠36只，25～30 g，購于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心(動物合格證號：0033432)。

1.2 試劑與儀器 組織DNA/總RNA共提取試劑盒、cDNA合成試劑盒(北京天根生化科技有限公司)，real-time PCR試劑盒(康為世紀(jì)公司)，白藜蘆醇(501-36-0(純度≥98%)，武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司)，real-time PCR儀(美國ABI公司)，小動物麻醉機(jī)、臺式動物手術(shù)顯微鏡(深圳瑞沃德公司)

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 白藜蘆醇的配制 將2 g白藜蘆醇溶于100 mL生理鹽水中，4 ℃保存。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組及術(shù)前準(zhǔn)備 將36只C57BL/6雄性小鼠隨機(jī)分為3組，即對照組(C組)、大腦中動脈栓塞組(MCAO組)和白藜蘆醇組(R組)，每組12只。MCAO組和R組采用線栓法構(gòu)建大腦中動脈栓塞模型：以400 mL/min的3%濃度異氟烷進(jìn)行誘導(dǎo)麻醉，隨后改為2%濃度持續(xù)麻醉。

1.3.3 MCAO模型制備 取頸正中切口，手術(shù)顯微鏡10倍視野下分離并暴露右側(cè)頸內(nèi)、外動脈分叉處。首先，結(jié)扎頸外動脈以防止插線時將線栓插入頸外動脈而未進(jìn)入大腦中動脈。其次，在頸內(nèi)動脈上打1個活結(jié)但不結(jié)扎，為稍后固定線栓做準(zhǔn)備。然后，在頸內(nèi)、外動脈分叉處遠(yuǎn)端的頸總動脈上結(jié)扎以阻斷血流，另在距離分叉處近端夾1個動脈夾，為隨后插入線栓做準(zhǔn)備。最后，在頸總動脈結(jié)扎線和動脈夾之間剪一斜形切口，將魚線從切口插入頸總動脈直至動脈夾處，此時將頸總動脈連同魚線一起結(jié)扎，松緊以不影響線栓移動為宜，撤去動脈夾，將魚線繼續(xù)向頸內(nèi)動脈插入1 cm左右，遇阻力時停止，此時結(jié)扎頸內(nèi)動脈上的套線以固定線栓，縫合皮膚，并在體外留有線栓的另一頭。1 h后緩慢拔出部分線栓(約1 cm)，并剪斷體外部分線栓。

1.3.4 給藥劑量及途徑 C組小鼠正常飼養(yǎng)，不進(jìn)行任何特殊操作。MCAO組按1 mL/100 g劑量給予生理鹽水灌胃，3次/日；R組按1 mL/100 g劑量給予2%白藜蘆醇生理鹽水溶液灌胃，3次/日。

1.3.5 MCAO模型評價 麻醉清醒后，小鼠出現(xiàn)如下三種狀態(tài)之一，則認(rèn)為MCAO造模成功：①不能完全伸展單側(cè)前肢；②向單側(cè)轉(zhuǎn)圈；③向單側(cè)傾斜[7]。如出現(xiàn)可正常行走或生命體征衰弱則予以剔除并進(jìn)行增補(bǔ)。

1.3.6 神經(jīng)功能損傷評分及標(biāo)本采集 3組小鼠于術(shù)后第72小時行mNSS評分，分?jǐn)?shù)越高表明神經(jīng)功能損傷癥狀越嚴(yán)重，即0分為正常，最嚴(yán)重為18分。評價完成后通過頸椎離斷法處死小鼠，MCAO組及R組留取缺血半暗帶同一部位腦組織約10 mg，C組留取相應(yīng)部位腦組織10 mg。剩余腦組織進(jìn)行干濕比重測量。

1.3.7 線粒體DNA拷貝數(shù)及線粒體合成相關(guān)基因表達(dá)的測定 依據(jù)試劑盒的說明書，提取標(biāo)本腦組織的基因組DNA和總RNA，并將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。設(shè)計過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子-1α(Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1alpha,PGC-1α)、過氧化物酶體增生物激活受體δ(peroxisome Proliferator-activated receptorδ,PPARδ)、核呼吸因子-1(nuclear respiratory factor1,NRF1)、線粒體轉(zhuǎn)錄因子-A(mitochondrial transcription factor A，TFAM)和線粒體單拷貝基因Cytb的引物。通過實(shí)時熒光定量PCR的方法進(jìn)行基因表達(dá)檢測，具體操作如下：配制25 μL的PCR反應(yīng)體系，包括2×SYBR Mixture(12.5 μL)，cDNA 50ng或基因組DNA100 ng(2 μL)，上下游引物(共2 μL)和雙蒸水(8.5 μL)，每個基因均設(shè)置3個重復(fù)孔。反應(yīng)條件采用兩步法：95 ℃預(yù)變性10 min，隨后95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min共40個循環(huán)，隨后以0.3 ℃梯度逐漸升溫以進(jìn)行溶解曲線分析。應(yīng)用2-ΔΔCt法計算各目的基因的相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1引物序列

基因 序列(5'-3')產(chǎn)物長度(bp)PGC-1α上游 CACCAAACCCACAGAAAACAG下游 GGGTCAGAGGAAGAGATAAAGTTG125PPARδ上游 CACATCTACAATGCCTACCT下游 CTTCTCTGCCTGCCACAATGTCT132NRF1上游 AATGTCCGCAGTGATGTCC下游 GCCTGAGTTTGTGTTTGCTG149TFAM上游 CACCCAGATGCAAAACTTTCAG下游 CTGCTCTTTATACTTGCTCACAG162β-actin上游 TGCCTGACGGTCAGGTCA下游 CAGGAAGGAAGGCTGGAAG77mtDNA(Cytb)上游 GCTTTCCACTTCATCTTACCATTTA下游 TGTTGGGTTGTTTGATCCTG155RSP18(DNA內(nèi)參)上游 TGTGTTAGGGGACTGGTGGACA下游 CATCACCCACTTACCCCCAAAA109

1.3.8 腦組織含水量測定 分離左右大腦半球，去除嗅球、小腦和腦干，立即稱重，此時為濕重。隨后將大腦放入烘干箱中，75 ℃烘烤48 h后稱重，此時為干重。含水量=(濕重-干重)/濕重。

2 結(jié)果

2.1 造模一般情況 24只手術(shù)小鼠，3只于術(shù)后72 h內(nèi)死亡，1只可正常行走，故予以剔除，并增補(bǔ)4只入組。

2.2 神經(jīng)功能損傷評分 R組和MCAO組mNSS評分顯著高于C組，且應(yīng)用白藜蘆醇后R組評分低于MCAO組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

2.3 各基因表達(dá)及mtDNA拷貝數(shù)變化 R組和MCAO組大鼠腦組織中PGC-1α、PPARδ、NRF1和TFAM 基因表達(dá)以及mtDNA拷貝數(shù)均顯著高于C組，且R組高于MCAO組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表3)。

2.4 腦組織含水量 MCAO組和R組大鼠腦組織含水量顯著高于C組，且MCAO組高于R組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

表2 mNSS及腦含水量變化

組別mNSS含水量R5.75±1.13*0.774±0.060*MCAO8.63±2.05*0.789±0.004*C 0.000.762±0.007 F104.654.46

*：與其他兩組比較，均P<0.05。

表3各基因表達(dá)及mtDNA拷貝數(shù)變化

組別PGC-1αPPARδNRF1TFAMmtDNA拷貝數(shù)R3.30±0.62*2.54±0.44*1.97±0.16*3.37±1.18*5.38±1.20*MCAO1.44±0.31*1.67±0.29*1.33±0.14*1.82±0.45*3.12±1.13*C1.02±0.211.10±0.351.08±0.221.08±0.341.04±0.17 F26.8310.637.0816.5520.42

*：與其他兩組比較，均P<0.05。

3 討論

腦水腫是發(fā)生腦梗死后常見的并發(fā)癥之一，通常于發(fā)病后的第3～5天達(dá)到高峰。前期主要是由于腦缺血后，細(xì)胞無氧酵解增加導(dǎo)致乳酸堆積，Na+/K+交換通道抑制，細(xì)胞內(nèi)H+濃度升高，促使大量水進(jìn)入，形成細(xì)胞毒性腦水腫[8]。當(dāng)腦細(xì)胞發(fā)生水腫后，顱內(nèi)壓可急劇增高，正常腦組織受到壓迫，從而加重循環(huán)障礙及缺血性損傷，使病情惡化，甚至導(dǎo)致腦疝形成，威脅生命[9]。白藜蘆醇主要存在于葡萄、花生根莖、虎杖等植物中，具有抗炎癥、抗氧化等效果，對血管內(nèi)膜亦有保護(hù)作用，近年來也有學(xué)者將其作為治療腦梗死的輔助用藥，發(fā)現(xiàn)其同樣具有良好的治療效果[10]。本實(shí)驗(yàn)表明，白藜蘆醇可有效減輕腦梗死小鼠的神經(jīng)功能損傷癥狀，并有效降低梗死后腦水腫的嚴(yán)重程度，這與劉金梅等[3]的研究結(jié)果一致，其發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可有效降低腔隙性腦梗死患者的血液黏度和體內(nèi)炎性反應(yīng)，緩解腦梗死后的臨床癥狀，但目前白藜蘆醇發(fā)揮腦保護(hù)作用的主要機(jī)制尚不明確。線粒體是為細(xì)胞提供能量的重要細(xì)胞器，當(dāng)缺血缺氧發(fā)生時氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的形成可導(dǎo)致線粒體功能障礙，促進(jìn)腦水腫的發(fā)生[11]。但線粒體的基因修復(fù)系統(tǒng)效率很低，機(jī)體保持mtDNA功能完整的主要機(jī)制是通過誘導(dǎo)線粒體生物合成增加而代償線粒體功能的降低[12]。為此我們進(jìn)而探討了腦組織中線粒體生物合成相關(guān)基因表達(dá)及mtDNA拷貝數(shù)的變化。

線粒體生物合成是缺氧、低氧狀態(tài)下細(xì)胞的一種適應(yīng)手段，該過程可受到多種因素調(diào)控，其中PGC-1α、PPARδ、NRF1和TFAM等基因被認(rèn)為在細(xì)胞線粒體生物合成中起著關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[13]。PGC-1α作為一種共激活因子，可與PPARδ結(jié)合，從而使自身發(fā)生分子構(gòu)象改變，促進(jìn)二者的復(fù)合體與組蛋白羥基轉(zhuǎn)移酶結(jié)合，增加基因組轉(zhuǎn)錄活性[14]。同時PGC-1α表達(dá)上調(diào)時可激活下游的核呼吸因子NFR-1和NRF-2，進(jìn)而激活呼吸鏈相關(guān)基因COXⅣ和COXⅤ等基因轉(zhuǎn)錄，共同參與協(xié)調(diào)氧化呼吸鏈蛋白的表達(dá)，促進(jìn)線粒體生成[15]。另外PGC-1α還可活化TFAM，激活mtDNA編碼的氧化磷酸化蛋白的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)線粒體進(jìn)行生物合成[16]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腦梗死后的腦組織中PGC-1α、PPARδ、NRF1和TFAM 基因表達(dá)顯著上調(diào)，mtDNA拷貝數(shù)明顯增加，表明缺氧造成線粒體損傷后，激活了PGC-1α/TFAM通路，促使mtDNA發(fā)生了代償性擴(kuò)增。這可能是由于氧化應(yīng)激反應(yīng)在造成mtDNA損傷的同時，本身還能作為第二信使，觸發(fā)呼吸核因子、線粒體轉(zhuǎn)錄因子等基因的表達(dá)，促進(jìn)線粒體合成以降低受損mtDNA所占比例，從而代償氧化供能功能的下降[17]；另外腦梗死后可刺激組織乙酰膽堿合成的增加，從而抑制線粒體畸形改變，并促進(jìn)線粒體的合成，使DNA拷貝數(shù)增加[18]。當(dāng)應(yīng)用白藜蘆醇后，可見大鼠的線粒體生物合成基因表達(dá)進(jìn)一步升高，且mtDNA拷貝數(shù)顯著提高，表明白藜蘆醇可能是通過激活PGC及下游通路，促進(jìn)mtDNA的生物合成，從而增強(qiáng)缺血缺氧腦組織的能量供應(yīng)，進(jìn)而改善腦水腫程度，發(fā)揮腦保護(hù)作用。這可能是由于白藜蘆醇能夠通過激活沉默信息調(diào)節(jié)因子，將p53蛋白第382位賴氨酸殘基去乙?；?，從而抑制p53的活性[19]，促進(jìn)PGC及下游基因表達(dá)，保障mtDNA拷貝數(shù)代償性增加[20]。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建腦梗死小鼠模型，初步探討了白藜蘆醇對腦水腫及線粒體生物合成的影響，為解釋白藜蘆醇發(fā)揮腦保護(hù)作用的機(jī)制提供了基礎(chǔ)支持。但腦梗死的發(fā)病是多種因素共同造成的結(jié)果，其發(fā)生發(fā)展也涉及多條通路及靶基因，這仍有待挖掘。若能進(jìn)一步探討白藜蘆醇對其他通路的影響，或許可為腦梗死的臨床治療用藥乃至開發(fā)白藜蘆醇的新用途提供幫助。

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