白建偉，王 峰，潘 鴻，趙 蘭，粟立羽，李 巖

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)教研室，貴州 遵義 563099；3.遵義醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院食品與營養(yǎng)學(xué)教研室，貴州 遵義 563099；4.遵義醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

綠原酸是從中藥、果蔬等物質(zhì)中提取的一種天然的多酚類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗菌和抗腫瘤等作用[1-2]。綠原酸能有效抑制結(jié)腸癌、肺癌、肝癌等癌細(xì)胞的生長，抑制作用與劑量無依賴性[3-4]，目前尚不清楚綠原酸對胃癌細(xì)胞是否也有抑制作用。劉潔等[4]研究發(fā)現(xiàn)，綠原酸對Lewis肺癌移植瘤小鼠和H22肝癌移植瘤小鼠的胸腺、脾臟均無明顯影響，這表示綠原酸在發(fā)揮抗腫瘤活性的同時并沒有對免疫器官產(chǎn)生損傷。綠原酸能通過Caspase依賴性凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5]，但能否通過AIF介導(dǎo)的非Caspase依賴性線粒體途徑誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡尚不清楚。

本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度的綠原酸處理中分化人胃癌SGC-7901細(xì)胞，研究綠原酸對SGC-7901細(xì)胞增殖的影響，以及不同濃度綠原酸作用于胃癌細(xì)胞后，非Caspase依賴途徑中凋亡誘導(dǎo)因子AIF的變化，為胃癌治療提供新的思路和方向。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與來源 綠原酸(Sigma公司，純度>95%)，人胃癌SGC-7901細(xì)胞株(中國科學(xué)院上海細(xì)胞所)，DMEM培養(yǎng)基(Hyclone)，胎牛血清FBS(Hyclone)，青鏈雙抗(上海生工)，噻唑藍(lán)(Sigma)，細(xì)胞線粒體分離試劑盒(碧云天)，JC-1 探針(碧云天)，Trizol(invitrogen)，PCR引物來源(生工)，SYBRGreen PCR試劑盒(Thermo F-415XL)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo #K1622)，BCA 蛋白定量試劑盒(凱基)，30%丙烯酰胺(無錫菩禾)，PBS 磷酸鹽緩沖液(無錫菩禾)，蛋白預(yù)染Marker(Thermo)，PVDF膜(millipore)。

1.2 方法

1.2.1 藥品配制 稱取155 mg的綠原酸粉末溶于1 mL的無水乙醇中，配成終濃度為155 mg/mL的綠原酸母液。使用時，需稀釋1 000倍。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，體外培養(yǎng)人胃癌SGC-7901細(xì)胞，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天換一次液，觀察細(xì)胞生長狀況，待細(xì)胞長到70%～80%后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 MTT法檢測細(xì)胞存活率 將細(xì)胞濃度調(diào)整為2×105個/mL，每孔加入200 μL細(xì)胞懸液(96孔板)，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，每組設(shè)3個實(shí)驗(yàn)學(xué)重復(fù)；按預(yù)設(shè)梯度(4.84 μg/mL、9.69 μg/mL、19.375 μg/mL、38.75 μg/mL、77.50 μg/mL和155 μg/mL)加入稀釋好的綠原酸溶液，繼續(xù)分別培養(yǎng)12、24、48、72 h；培養(yǎng)結(jié)束前4 h每孔再加入10 μL MTT溶液；培養(yǎng)結(jié)束后，棄上清，每孔加入100 μL DMSO溶液；酶標(biāo)儀測定570 nm波長下各孔的吸光值，計算3個復(fù)孔吸光值(A)，按照公式計算出SGC-7901細(xì)胞的存活率：細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組A值-調(diào)零組A值)/(對照組 A 值-調(diào)零組組A值)(設(shè):對照組細(xì)胞存活率為100%)。

1.2.4 細(xì)胞線粒體和胞漿蛋白分離 收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，600×g，4 ℃離心5 min，棄上清；加入1.0 mL線粒體分離試劑，重懸細(xì)胞，冰浴10 min；用超聲波細(xì)胞粉碎儀處理細(xì)胞，600×g，4 ℃離心10 min；取上清液移至新的EP管中，11 000×g，4 ℃離心10 min；上清液為胞漿蛋白，沉淀即為細(xì)胞線粒體。

1.2.5 JC-1檢測SGC-7901細(xì)胞線粒體膜電位變化情況 將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×105個/mL，每孔加入3mL細(xì)胞懸液 (6孔板)；37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h；加藥前將培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基，設(shè)不加藥對照組，加藥組按照19.375、38.75、77.5 μg/mL進(jìn)行加藥處理細(xì)胞；培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，用無菌的PBS洗滌細(xì)胞兩次；加入500 μL JC-1工作液(現(xiàn)用現(xiàn)配)，37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育30 min；用PBS洗滌細(xì)胞兩次，熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞熒光變化。

1.2.6 熒光定量 PCR 法檢測AIF基因的表達(dá)情況(見表1)。

表1引物名稱、序列及產(chǎn)物大小

引物名稱引物系列產(chǎn)物大小(bp)AIF(human)-RT-FAACCAGGGATTTA-CAGGG421AIF(human)-RT-RAAGTTTCTCCAGCAT-TCGHumanactinbeta-RT-FAGCGAGCATC-CCCCAAAGTT285Humanactinbeta-RT-RGGGCACGAAGGCTCAT-CATT

將處理好的細(xì)胞用適量的Trizol 裂解液充分裂解，向離心管中加入200 μL預(yù)冷的氯仿，劇烈振蕩后室溫靜置10 min；12 000×g，4 ℃，離心10 min；吸取上層水相約500 μL轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入500 μL的異丙醇，顛倒混勻6～8次，-20 ℃冰箱放置30 min；10 000×g，4 ℃，離心15 min；棄上清，75%乙醇洗滌沉淀2次(4 ℃，8 000×g，離心5 min)，棄上清，濾紙吸凈殘存乙醇，自然干燥5～10 min；20 μL DEPC處理水，溶解RNA；測定RNA濃度；按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；擴(kuò)增程序?yàn)椋簾嶙冃?95 ℃ 10 min，擴(kuò)增(95 ℃ 20 s,62 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s)40個循環(huán)；數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件分析。

1.2.7 Western blot 法檢測AIF蛋白的表達(dá)情況 將處理好的細(xì)胞用RIPA裂解液充分裂解，12 000×g，4 ℃，離心10 min，取上清，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量后，加入適量蛋白上樣緩沖液，煮沸 10 min，離心后取上清待用，制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠，上樣后，依次進(jìn)行電泳-電轉(zhuǎn)-封閉-一抗孵育(AIF 1∶2 000)-二抗孵育(兔抗 1∶2 000)-凝膠成像系統(tǒng)檢測。

2 結(jié)果

2.1 綠原酸對人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的影響 MTT結(jié)果顯示(見圖1)，4個時間點(diǎn)變化趨勢基本一致，隨著綠原酸的濃度增加，對SGC-7901細(xì)胞的生長抑制率也逐漸增加。然而12 h時綠原酸作用于細(xì)胞的時間較短，對細(xì)胞的抑制效果不太明顯，而24、48、72 h時整體變化基本一致，因此選擇給藥后培養(yǎng)時間為24 h。4.84、9.69、19.375、38.75、77.50、155 μg/mL綠原酸作用于細(xì)胞24 h后，抑制率分別為(5.28±3.93)、(7.51±3.87)、(18.94±0.95)、(51.61±0.59)、(66.23±0.71)、(71.07±1.98)，濃度為19.375、38.75、77.50 μg/mL時抑制率增加明顯，標(biāo)準(zhǔn)差小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，因此選擇后續(xù)實(shí)驗(yàn)的給藥濃度為19.375、38.75、77.50 μg/mL。以上結(jié)果表明不同濃度的綠原酸均能抑制SGC-7901細(xì)胞的生長，呈劑量依賴性。

A:12 h;B:24 h;C:48 h;D:72 h。*表示與對照組相比，P<0.05；**表示與對照組相比，P<0.01。圖1 綠原酸對胃癌SGC-7901細(xì)胞的存活率的影響

2.2 綠原酸處理人胃癌SGC-7901細(xì)胞后線粒體膜電位的變化 JC-1是一種具有通透性的熒光染料，能隨著線粒體膜電位的變化而變化。當(dāng)線粒體膜電位高時，JC-1濃度也隨之增加，呈現(xiàn)紅色熒光；當(dāng)線粒體膜電位低時，JC-1濃度也隨之降低，呈現(xiàn)綠色熒光。圖2結(jié)果顯示，對照組紅色熒光很強(qiáng)，表明線粒體膜電位較高；而用藥組隨著用藥濃度的增加，紅色熒光逐漸減弱，綠色熒光逐漸增強(qiáng)，表明線粒體膜電位逐漸下降。

A:對照組;B:19.375 μg/mL;C:38.75 μg/mL;D:77.5 μg/mL。圖2 綠原酸處理胃癌SGC-7901細(xì)胞后膜電位的變化

2.3 綠原酸對人胃癌SGC-7901細(xì)胞AIFmRNA表達(dá)量的影響 qRT-PCR結(jié)果顯示(見圖3)，綠原酸作用于SGC-7901細(xì)胞24h后，與對照組相比，用藥組AIF基因的表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。中濃度組(38.75 μg/mL)、高濃度組(77.50 μg/mL)AIF的表達(dá)水平顯著高于低濃度組(19.375 μg/mL，P<0.01，P<0.01)。

2.4 綠原酸對人胃癌SGC-7901細(xì)胞AIF蛋白表達(dá)量的影響 Western blot結(jié)果顯示(見圖4)，綠原酸作用于SGC-7901細(xì)胞24 h后，與對照組相比，線粒體中AIF的蛋白表達(dá)量明顯降低，而細(xì)胞質(zhì)中AIF的蛋白表達(dá)量顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；綠原酸濃度越高，線粒體中AIF的蛋白表達(dá)量越低，而細(xì)胞質(zhì)中AIF的蛋白表達(dá)量越高。提示綠原酸能促進(jìn)AIF從線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)，從而發(fā)揮促凋亡作用。

**表示與對照組相比，P<0.01。圖3 綠原酸對AIF基因表達(dá)量的影響

A:細(xì)胞質(zhì)；B：線粒體；*表示與對照組相比，P<0.05；**表示與對照組相比，P<0.01。圖4 綠原酸對AIF蛋白表達(dá)量的影響

3 討論

胃癌是全球第三大癌癥，發(fā)病率僅次于肺癌和肝癌[6]。多數(shù)胃癌在確診時已處于晚期，需要手術(shù)聯(lián)合化療進(jìn)行治療，目前臨床上常用的化療藥物普遍存在副作用大、耐藥性等不良反應(yīng)，而天然抗癌藥物對機(jī)體的低毒性，是臨床治療迫切需要的[7-8]。因此，對于天然抗癌藥物的研究顯得尤為重要。

綠原酸是一種有前景的癌癥治療藥物，能抑制多種癌細(xì)胞的增殖，如人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤HXO-RB44[9]、人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-1[10]、乳腺癌[11]等，其抑制作用的發(fā)揮可能與抑癌基因的表達(dá)增加及細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)降低有關(guān)。細(xì)胞凋亡是生物體進(jìn)行自我更新和自我調(diào)節(jié)的一種重要手段,是生物體維持自身正常生理功能的重要保障。線粒體是細(xì)胞凋亡的調(diào)控中心，當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激后，線粒體外膜的通透性增高，將位于內(nèi)外膜間的線粒體蛋白釋放到細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中，通過Caspase依賴和非依賴兩種途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。AIF是Caspase非依賴途徑中最保守的促凋亡蛋白，是細(xì)胞凋亡的起始因子和效應(yīng)因子，在胃癌SGC-7901細(xì)胞中高表達(dá)[13]。AIF同時也是維持線粒體正常生理功能的重要蛋白，前體蛋白分子量為67 kDa，正常情況下存在于線粒體內(nèi)外膜間，受凋亡刺激后，AIF會裂解為成熟蛋白，通過激活鈣蛋白酶和(或)組織蛋白酶從線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)最后轉(zhuǎn)至細(xì)胞核，促使染色體凝集，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[14]。

本實(shí)驗(yàn)研究顯示，綠原酸能抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖，抑制率隨著藥物濃度和作用時間的增加而增加。線粒體膜電位的降低是早期細(xì)胞凋亡發(fā)生的一種特異性標(biāo)志，有研究顯示Aβ 1-42寡聚體可通過促進(jìn)AIF從線粒體向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位，介導(dǎo)大鼠神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[15]。本研究通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，綠原酸作用于胃癌SGC-7901細(xì)胞后綠色熒光增強(qiáng)，表明細(xì)胞發(fā)生了早期凋亡。細(xì)胞受到凋亡刺激，會促使AIF從線粒體移位至細(xì)胞質(zhì)，這一點(diǎn)也在本研究中得以驗(yàn)證。Western blot結(jié)果顯示線粒體中AIF蛋白的表達(dá)量隨著藥物濃度的增加呈上升趨勢，相反，細(xì)胞質(zhì)中AIF蛋白的表達(dá)量隨著藥物濃度的增加呈下降趨勢。有研究顯示穿心蓮內(nèi)酯可誘導(dǎo)SKOV3、A431細(xì)胞凋亡，其誘導(dǎo)凋亡可能與線粒體膜電位下降有關(guān)[16]。

綜上所述，綠原酸能抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖，并降低線粒體膜電位，促進(jìn)AIF從線粒體轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)，從而可能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。

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