徐 寬，凌江紅,2，周 洲，張麗敏，張鈺琴，謝天一，王煜姣

功能性消化不良( functional dyspepsia,FD)包括餐后飽脹不適、早飽、上腹痛或上腹部燒灼感等癥狀, 是指發(fā)生在胃和十二指腸沒有任何系統(tǒng)性、代謝性和器質(zhì)性疾病的一種或多種消化不良癥狀[1]。臨床上關(guān)于FD的治療還沒有有效方法，對FD的防治成為亟待解決的課題。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以通過處理內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白的堆積來維持細(xì)胞的正常功能，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的自我代償過程[2]。疾病的發(fā)生發(fā)展與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)有密切關(guān)系，通過調(diào)節(jié)ERS來防治疾病已成為研究熱點。柴胡疏肝散源自《景岳全書》，是疏肝理氣法的代表方劑。本課題組既往研究[3- 4]顯示柴胡疏肝散能夠改善FD大鼠的胃動力，其機制可能與增強細(xì)胞活性和減少自噬有關(guān)，但是對于FD大鼠改善胃動力的深層機制尚不清楚。本研究從調(diào)控ERS角度來進一步探討柴胡疏肝散防治FD的機制，通過觀察ERS相關(guān)因子的變化，為柴胡疏肝散防治FD提供更深入的實驗依據(jù)。

1 材料

1.1動物SPF級SD大鼠30只，雌雄各半，體質(zhì)量(250±20) g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按隨機數(shù)字表法分為正常組、模型組、生理鹽水組、柴胡疏肝散組及多潘立酮組，每組6只。SPF級環(huán)境飼養(yǎng)，溫度(22±3)℃，濕度50%，明暗交替12 h。

1.2藥物柴胡疏肝散(組成: 柴胡6 g, 陳皮6 g, 香附4.5 g, 川芎4.5 g, 枳殼4.5 g, 白芍4.5 g, 甘草1.5 g)及多潘立酮(10 mg/片, 西安楊森制藥有限公司生產(chǎn), 批準(zhǔn)文號:150324778)均購于廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房。柴胡疏肝散濃度參考徐叔云等主編的《藥理實驗方法學(xué)》第三版[5]，按照普通成人(60 kg/人)臨床用量的3倍，以1 ∶5的容積比用蒸餾水泡30 min，煎煮2 次(30 min/次)，過濾，去渣取汁，合并濾液加熱蒸發(fā)，制成0.32 g/ml水煎濃縮液，4 ℃保存?zhèn)溆?；多潘立酮按成?60 kg/人)臨床用量的3倍，用蒸餾水制成濃度為0.30 mg/ml。

1.3營養(yǎng)性半固體糊的制備羧甲基纖維素2.5 g，溶于62.5 ml 蒸餾水中，分別加入4 g奶粉、2 g糖、2 g淀粉，攪拌均勻，配制成73 ml 的營養(yǎng)半固體糊。4 ℃保存?zhèn)溆?，用時恢復(fù)至室溫。

1.4試劑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激因子肌醇需求酶1(inositol-requiring enzyme 1,IRE1)一抗、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2(TNF receptor associated factor 2,TRAF2)一抗均購自Abcam公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗、濃縮型DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；RNAiso Pius、SYBR Premix試劑盒購自TaKaRa公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo公司；引物設(shè)計合成由上海生物工程有限公司負(fù)責(zé)。IRE1上游引物：5′-GAC CGG CAG TTG CAG TAC AT-3′,下游引物：5′-TGG TCT GAT GAA GCA AGG TG-3′，擴增長度為118 bp;TRAF2上游引物：5′-GGC TTC TCC AAG ACC CTT CT-3′,下游引物5′-CAG GCA GAA GGA GCA GTA GC-3′，擴增長度為123 bp；GAPDH上游引物：5′-GGC ACA GTC AAG GCT GAG AAT G-3′，下游引物：5′-ATG GTG GTG AAG GCG CCA GTA-3′，擴增長度為143 bp。

1.5儀器實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，普通PCR擴增儀(美國Bio-rad公司)，超微量樣本分光光度計(美國Thermo Scientific公司)，正置熒光相差微成像顯微鏡(日本OLYMPUS 公司)，凝膠成像分析儀(美國Bio-rad公司)。

1.6方法

1.6.1動物模型制備 30只SD大鼠，隨機分為正常組、模型組、生理鹽水組、柴胡疏肝散組及多潘立酮組，每組6只，雌雄各半，每6只一籠。參照改良夾尾刺激法[6]制造FD大鼠模型，即用紗布包裹止血鉗輕度鉗夾大鼠尾部中后1/3處，立即放開，每次30 min，2 次/d，持續(xù)4周。除正常組、模型組外，其余各組于造模同一天分別給予0.9% NaCl、柴胡疏肝散煎劑及多潘立酮灌胃，1.5 ml/100 g，早晚各1次，間隔12 h，連續(xù)給藥4周。

1.6.2標(biāo)本收集 在實驗第28天各組大鼠禁食不禁水24 h，第29天各組大鼠予以半固體糊灌胃，30 min后將大鼠予10%水合氯醛腹腔麻醉，剖腹，結(jié)扎賁門和幽門。迅速剪取全胃，用濾紙拭干，稱取重量為全胃重量，沿胃大彎剪開胃體，觀察胃殘留食物情況及黏膜表面有無腫脹、潮紅、糜爛、潰瘍及其他器質(zhì)性病變，并用冷生理鹽水洗凈胃內(nèi)容物，濾紙拭干，再次稱取重量為空胃重量。最后取距幽門0.5 cm的胃竇組織分為兩份，一份用4%多聚甲醛固定，用于免疫組化檢測；另外一份放入凍存管中快速液氮保存，再轉(zhuǎn)移到-80 ℃凍存，待后續(xù)Real-time PCR指標(biāo)檢測。

1.6.3胃排空率測定 胃排空率=1-(全胃重量-空胃重量)/所灌固體糊重量×100%。

1.6.4免疫組化檢測胃竇組織IRE1、TRAF2蛋白的表達(dá) 取經(jīng)4%多聚甲醛固定的胃竇組織，制作石蠟切片。按照免疫組化法說明書檢測IRE1及TRAF2蛋白的表達(dá)，鏡檢顯色呈棕黃色者為陽性表達(dá)。每只大鼠觀察2張切片，每張切片在400倍光鏡下選取5個互不重疊視野，采用正置熒光相差微成像顯微鏡及其圖像采集系統(tǒng)采集圖片，并以Image-ProPlus6.0圖像分析軟件分析圖片，測量積分光密度(IOD) 值，取均值作為結(jié)果。

1.6.5Real-time PCR檢測胃竇組織IRE1、TRAF2 mRNA 的表達(dá) 應(yīng)用TRIzol法提取胃竇組織總RNA，用紫外分光光度計測定各組樣品純度。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒明書操作，以 20 μl為體系將總RNA轉(zhuǎn)錄成單鏈，-20 ℃保存?zhèn)溆?。進一步以模板(20 μl)+上/下游引物(各1 μl)+無核酸酶超純水(6 μl)的反應(yīng)體系，上熒光定量PCR儀進行擴增反應(yīng)， 95 ℃預(yù)變性2 min，繼以 95 ℃變性20 s，退火15 s, 72 ℃延伸30 s，如此反復(fù)40個循環(huán)后，結(jié)束后 4 ℃保存，每個循環(huán)結(jié)束后，采集熒光信號。每個樣品設(shè)立3個復(fù)孔重復(fù)。結(jié)果采用相對定量2-ΔΔCt計算。

2 結(jié)果

2.1生活狀態(tài)、組織學(xué)變化大鼠在造模初期生活狀態(tài)良好，發(fā)育正常，各組之間無明顯差異。造模1周之后，除正常組外，其他組大鼠開始出現(xiàn)扎堆現(xiàn)象，毛發(fā)雜亂，情緒暴躁易激怒，夾尾大鼠體質(zhì)量明顯低于正常組大鼠。造模結(jié)束，解剖胃組織，可見胃竇表面光滑，有褶皺，無黏膜出血、潰瘍、腫脹、潮紅器質(zhì)性改變。

2.2藥物干預(yù)后胃排空率的比較與模型組和生理鹽水組比較，柴胡疏肝散組和多潘立酮組胃排空率均顯著升高(P<0.05)，與正常組比較，模型組、生理鹽水組胃排空率顯著減低(P<0.05)，各組F值：13.25。見表1。

表1 各組大鼠胃排空率比較

圖1 IRE1蛋白在各組大鼠胃竇的表達(dá) 免疫組織化學(xué)染色×400

圖2 TRAF2蛋白在各組大鼠胃竇的表達(dá) 免疫組織化學(xué)染色×400

2.3各組大鼠胃竇組織IRE1及TRAF2蛋白表達(dá)IRE1、TRAF2蛋白陽性表達(dá)為胞質(zhì)染棕色，免疫組化顯示，柴胡疏肝散組、多潘立酮組細(xì)胞質(zhì)偶見少許棕色，生理鹽水組、模型組陽性染色明顯，片狀濃染分布于胞質(zhì)，見圖1、2。與模型組相比，柴胡疏肝散組和多潘立酮組IRE1、TRAF2蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.05)，IRE1中F值：10.41，TRAF2中F值：15.18。各組結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠胃竇組織IRE1、TRAF2蛋白表達(dá)量的比較

2.4各組大鼠胃竇組織IRE1及TRAF2的mRNA表達(dá)如圖3所示，RT-PCR檢測結(jié)果顯示，在143 bp處可見GAPDH的條帶。生理鹽水組、模型組在118 bp和123 bp處分別可見IRE1和TRAF2擴增條帶，其余組只有微量的表達(dá)。相比正常組，模型組和生理鹽水組的IRE1、TRAF2 mRNA的表達(dá)均升高(P<0.05)；相比模型組，治療組IRE1、TRAF2 mRNA表達(dá)下降的更為明顯，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 各組大鼠胃竇組織IRE1、TRAF2 mRNA的實時定量PCR電泳結(jié)果及相對表達(dá)量

3 討論

FD作為消化系統(tǒng)常見疾病，嚴(yán)重影響著人類正常的生活和健康。在對1 016個健康中國人的隨機調(diào)查中顯示：239例患有FD，其中有93例被不同程度的抑郁和焦慮困擾[7]。怎樣有效地預(yù)防與治療該疾病越來越受到醫(yī)學(xué)界的關(guān)注。中醫(yī)在防治FD方面有其獨特的優(yōu)勢，臨床上應(yīng)用柴胡疏肝散治療FD取得了不錯的效果[8]。

ERS是把雙刃劍，它可以通過自己的代償作用消除對機體不利的影響，但是當(dāng)自身代償不足以維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)時，通過細(xì)胞凋亡或細(xì)胞自噬途徑,細(xì)胞會發(fā)生損傷甚至死亡[9]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中蓄積的或錯誤折疊的蛋白可通過自噬或凋亡被清除。這個過程的發(fā)生離不開內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子IRE1的參與，ERS促使IRE1與GRP78分離，通過二聚化和轉(zhuǎn)磷酸化使IRE1的核酸內(nèi)切酶活性被激活，可招募接頭分子TRAF2，并可后續(xù)引起細(xì)胞自噬或凋亡等其他變化，造成FD的發(fā)生[10-11]。本研究顯示，與正常組大鼠比較，模型組胃竇的IRE1和TRAF2蛋白與mRNA表達(dá)明顯增高，說明FD大鼠的IRE1信號通路被激活。

本研究表明，與正常組比較，模型組大鼠的胃排空率偏低，說明造模使大鼠發(fā)生了胃腸動力障礙，大鼠胃竇無潰瘍、腫脹、潮紅改變，伴有情緒暴躁易怒、體重減輕，說明FD造模成功。柴胡疏肝散立足肝脾胃, 常用于治療合并有脅肋疼痛，情志抑郁易怒，胸悶喜太息，或噯氣，腹脹痞滿等癥狀的患者。柴胡疏肝散在臨床上已廣泛應(yīng)用于治療FD、腸易激綜合征等胃腸動力障礙疾病，對這類疾病有明顯的改善作用[12-14]。關(guān)于柴胡疏肝散對FD大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子IRE1和TRAF2表達(dá)的影響，相關(guān)文獻報道較少。該研究在FD造模成功基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)復(fù)方柴胡疏肝散可以提高FD大鼠的胃排空率，同時RT-PCR和免疫組化結(jié)果顯示該藥物可以降低大鼠胃竇組織中IRE1、TRAF2基因和蛋白的表達(dá)，說明其可以抑制IRE1、TRAF2的過度表達(dá)，改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而提高胃腸道細(xì)胞活力，來達(dá)到緩解FD的作用。

參考文獻

[1] Tack J, Talley N J, Camilleri M, et al.Functional gastroduodenal disords[J].Gastroenterology, 2006, 130(5):1466-79.

[2] Breckenridge D G, Germain M, Mathai J P, et al.Regulation of apoptosis by endoplasmic reticulum pathways[J].Oncogene, 2003, 22(53):8608-18.

[3] 張 智, 凌江紅, 寧海恩,等.柴胡疏肝散含藥血清對大鼠胃間質(zhì)細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響[J].世界華人消化雜志, 2015, 23(30):4792-9.

[4] 鄧 靜, 凌江紅, 曾麗君,等.柴胡疏肝散對功能性消化不良大鼠胃竇間質(zhì)細(xì)胞增殖及其超微結(jié)構(gòu)的影響[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2017, 36(4):1410-7.

[5] 徐叔云，卞如濂，陳 修.藥理實驗方法學(xué)[M].3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002:202-4.

[6] 王煜姣, 凌江紅, 張鈺琴等.復(fù)合病因造模法制備功能性消化不良大鼠模型[J].世界華人消化雜志, 2014, 22(2):210-4.

[7] 吳柏瑤, 張法燦, 梁列新.功能性消化不良的流行病學(xué)[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志, 2013, 22(1):85-92.

[8] 楊建軍, 趙廣利, 柯 彤.柴胡疏肝散對功能性消化不良患者胃動力及胃腸激素的影響[J].吉林中醫(yī)藥, 2013, 33(8):801-3.

[9] 馬光斌, 陸倫根.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的細(xì)胞效應(yīng)分子機制[J].生命科學(xué), 2012,24 (3):287-91.

[10] Han D, Lerner A G, Vande W L, et al.IRE1alpha kinase activation modes control alternate endoribonuclease outputs to determine divergent cell fates[J].Cell, 2009, 138(3):562-75.

[11] Yoshida H, Matsui T, Yamamoto A, et al.XBP1 mRNA is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor[J].Cell, 2002, 107(7):881-91.

[12] 金連寧, 甘 淳, 何麗華.柴胡疏肝散加減治功能性消化不良肝胃不和證36例[J].江西中醫(yī)藥, 2012, 43(1):19-20.

[13] 郭慶廣.柴胡疏肝散加減治療功能性消化不良110例[J].中醫(yī)臨床研究, 2016, 8(5):88-9.

[14] 朱丹薇.中醫(yī)藥治療功能性消化不良研究進展[J].河南中醫(yī), 2014, 34(12):2504-5.