侯夢瑤，孫應明,，營 秀，張夢潔，陶 睿

口腔中定植了大量細菌，齲病、牙周病等常見口腔疾病均與口內致病菌有關。人們一直尋求消滅口內致病菌的有效方法，以此來預防這些口腔疾病的發(fā)生[1-2]。傳統(tǒng)的口內去除細菌方式主要通過機械去除牙菌斑或者使用廣譜抗生素。然而，機械去除牙菌斑只能暫時除菌。使用廣譜抗生素也有耐藥性和廣泛殺菌的問題[3]。因此，該實驗致力于尋求新型抗菌劑來有效殺滅敏感致病菌，并且對正常菌群無負面影響，保證口腔中的菌群平衡。該研究合成了一種新型抗菌肽C8gpm11。通過C8gpm11對口腔常見致病菌的作用來分析其抑菌殺菌能力，并觀察細菌表面形態(tài)的改變，研究其殺菌機制，明確臨床應用價值。

1 材料與方法

1.1菌株及其生長條件本實驗所需菌株見表1，主要是由ATCC菌株和實驗室菌株(第四軍醫(yī)大學)組成。變異鏈球菌(變鏈菌)(Streptococcusmutans)UA 140、UA 159、血液鏈球菌(血鏈菌)(Streptococcussanguinis)ATCC 10556、牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis)和糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)ATCC 29212在BHI (Difco, Detroit, MI)培養(yǎng)基中。嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus) ATCC 4356在MRS(Difco, Detroit, MI)培養(yǎng)基中。各菌株37 ℃厭氧(80% N2, 10% CO2，10% H2)隔夜培養(yǎng)至109CFU/ml，再用BHI培養(yǎng)基稀釋至105CFU/ml備用。

1.2多肽制備將多肽C8gpm11(上海生工合成)溶解在無菌超純水中，配制成終濃度為40.62 mg/ml的溶液濃度溶解，置于-20 ℃保存。

1.3最小抑菌濃度(minimalinhibitoryconcentration，MIC)和最小殺菌濃度(minimalbactericideconcentrationconcentration，MBC)測定采用二倍稀釋法對MIC和MBC進行測定[臨床實驗室標準化委員會(CLSI)][4]。稀釋后不同濃度C8gpm11溶液按梯度依次加入96孔板，用同等量無菌超純水取代C8gpm11作陰性對照。將新鮮待測菌液(105CFU/ml)依次加入梯度濃度C8gpm11及無菌超純水中至總容量200 μl。37 ℃厭氧培養(yǎng)20～24 h。肉眼觀察各孔菌液渾濁情況。MIC值為肉眼觀察所有菌液變澄清孔所對應的最低多肽濃度[5]。取所有澄清孔中的菌液100 μl，分別稀釋鋪板至固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37 ℃厭氧培養(yǎng)20～24 h。肉眼觀察固體培養(yǎng)基菌落長勢情況。MBC值為不能觀察到固體培養(yǎng)基有菌落生長的最低多肽濃度[5]。各菌種實驗重復3次。

1.4掃描電鏡觀察多肽對細菌作用取對數(shù)期變鏈菌UA 159、血鏈菌新鮮菌懸液于4 ℃、4 500 r/min離心10 min，棄上清液，PBS洗滌3次。C8gpm11(最終濃度為4倍MIC濃度)室溫處理細菌懸液(100 μl)24 h。4 ℃、4 500 r/min離心10 min，棄上清液，PBS洗滌3次，2.5 %戊二醛固定4 h，乙醇梯度脫水(50%-70%- 80%- 90%-95%-100%-100%), 標本在每個梯度內浸泡15 min。獲得完全脫水的細菌沉淀，梯度降溫(-20 ℃～ -40 ℃～ -80 ℃)，細菌沉淀置于冷凍干燥機中凍干。掃描電鏡觀察。取C8gpm11處理過的菌液5 μl稀釋到100 μl，鋪板，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，觀察是否有菌落生長。陽性對照為未經(jīng)C8gpm11處理的細菌，其余步驟同上。

1.5抑菌圈實驗收集無菌唾液[6]。配置C8gpm11三種規(guī)格溶液：溶于三蒸水4倍MIC濃度溶液、溶于無菌唾液4倍MIC濃度溶液和溶于三蒸水8倍MIC濃度溶液。將新鮮109CFU/ml菌液加入軟瓊脂培養(yǎng)基搖勻，稀釋至108CFU/ml，平鋪于瓊脂培養(yǎng)基。冷卻凝固后，將三種規(guī)格溶液各取5 μl依次點在含有細菌的瓊脂板上。陰性對照為不含多肽的唾液。孵育1 h后，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 ～ 48 h。使用十分度游標卡尺測量抑菌圈直徑。各菌種實驗重復3次。

1.6部分抑菌濃度(fractionalinhibitoryconcentration，F(xiàn)IC)、部分殺菌濃度(fractionalbactericideconcentration，F(xiàn)BC)測定

1.6.1NaF和CHX 的MIC和MBC測定 NaF或CHX梯度稀釋后分別加入96孔板，用同等量無菌超純水取代NaF或CHX作為陰性對照，將變鏈菌UA 159菌液(105CFU/ml)依次加入梯度濃度NaF或CHX及無菌超純水中至總容量200 μl。NaF濃度范圍在0.125～16 g/L，CHX濃度范圍在0.05～6.4 mg/L，37 ℃厭氧培養(yǎng)20 ～ 24 h。MIC值、MBC值測定見前述。

1.6.2FIC和FBC測定 NaF(或CHX)和C8gpm11分別稀釋成梯度濃度。將對應梯度濃度的NaF(或CHX)和C8gpm11溶液分別加入96孔板同一孔中配成混合制劑。在NaF和C8gpm11混合制劑中，NaF濃度范圍為0.125～16 g/L, C8gpm11濃度范圍為1～128 μg/ml。在CHX和C8gpm11混合制劑中，CHX濃度范圍為0.012 5～1.6 mg/L，C8gpm11濃度范圍為0.5～64 μg/ml。陰性對照為不含NaF(或CHX)和C8gpm11的無菌超純水。加入變鏈菌UA 159菌液(105CFU/ml)至每孔200 μl，37 ℃厭氧培養(yǎng)20～24 h。

FIC(或FBC)≤0.5 表示抗菌藥物和C8gpm11有協(xié)同抗菌作用；0.54.0表示有拮抗作用[7-8]。

2 結果

2.1MIC和MBC測定結果MIC、MBC結果見表1。C8gpm11對6種口腔微生物MIC值范圍為64～256 μg/ml，MBC值范圍為128～>256 μg/ml。變鏈菌UA 159和嗜酸乳桿菌各自MBC值均是MIC值的兩倍。變鏈菌UA 140、血鏈菌和牙齦卟啉單胞菌各自MIC值和MBC值相等。糞腸球菌MBC值未測出。變鏈菌不同亞型(UA 159和UA 140)菌種MIC值和MBC值不完全相同。

表1 多肽C8gpm11的抗菌能力(μg/ml)

2.2掃描電鏡觀察多肽對細菌作用結果電鏡下結果見圖1。觀察細菌細胞膜形態(tài)變化。未經(jīng)C8gp11處理的細菌(A、C)表面光滑，形態(tài)完整，細胞膜無破碎。經(jīng)4倍MIC濃度C8gpm11處理的細菌(B、D)形態(tài)不完整，細胞膜的完整性遭到破壞。C8gpm11處理后變鏈菌UA 159表面形態(tài)發(fā)生改變，表型輪廓模糊，以及細胞膜呈現(xiàn)微孔樣改變。此外，C8gpm11處理后細菌,鋪板培養(yǎng)均無菌落生長。

2.3抑菌圈測定結果抑菌圈測定結果見圖2和表2。水溶4倍MIC濃度抑菌圈略大于唾液溶4倍MIC濃度抑菌圈。水溶8倍MIC濃度抑菌圈略大于水溶4倍MIC濃度抑菌圈。多肽C8gpm11在不同條件下抑菌圈大小略有差異。

圖1 C8gpm11(4倍MIC)處理后掃描電鏡圖 ×20 000

圖2 抑菌圈測定結果

表2 5種細菌抑菌圈直徑

經(jīng)單因素方差分析，統(tǒng)計量F值分別為變鏈菌UA 159：73.353，變鏈菌UA 140：52.642，血鏈菌：74.050，糞腸球菌：25.335，嗜酸乳桿菌：33.805，牙齦卟啉單胞菌：60.396。即各菌種三組數(shù)據(jù)不全相等，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。三組數(shù)據(jù)兩兩比較，使用Tukey HSD檢驗。除嗜酸乳桿菌水溶4倍MIC濃度和水溶8倍MIC濃度數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計學意義(P=0.21)、牙齦卟啉單胞菌水溶4倍MIC濃度和唾液溶4倍MIC濃度數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計學意義(P=0.09)以外，其余各菌種三組數(shù)據(jù)兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.4FIC和FBC測定結果C8gpm11、NaF和CHX單獨MIC、MBC值以及NaF(或CHX)和C8gpm11混合制劑FIC、FBC值見表3。在協(xié)同性研究中，C8gpm11和NaF聯(lián)合抗菌FIC值為1.125，F(xiàn)BC值為0.625，F(xiàn)IC值和FBC值均大于0.5。C8gpm11和CHX聯(lián)合抗菌FIC值為0.312 5，F(xiàn)BC值為0.312 5，F(xiàn)IC值和FBC值均小于0.5。

表3 C8gpm11和NaF(或CHX)協(xié)同抗菌作用研究

3 討論

口腔黏膜和牙齒表面定植細菌主要有三個特點：定植在牙面形成生物膜；通過機體代謝產(chǎn)酸；對酸性環(huán)境有一定的耐受性[9]。在以往實驗中，實驗者往往寄希望于預防細菌在牙面的定植[10]。但是這種方式并不能完全殺滅細菌，牙面仍有再次感染的風險[11]。近年來Eckert et al[12]提出了一種新型抗菌劑概念：STAMP[specifically (or selectively) targeted antimicrobial peptides],并且通過實驗證明了STAMP的可行性。感受刺激多肽(the competence stimulating peptide,CSP)(SGSLSTFFRLFNRSFTQALGK)的受體結合區(qū)域是一種可以針對變鏈菌的STAMP多肽區(qū)域。Eckert et al[11]合成的CSP衍生物C16G2，其可以抑制變鏈菌細胞分裂最終導致細胞凋亡。C8(TFFRLFNRG)為CSP的 C端8個氨基酸。Pm11是一種新型優(yōu)化多肽[13]，該多肽可以作用于細菌細胞膜流體雙分子層，在細胞膜表面“打孔”，形成離子通道。這些小孔使細胞質內容物大量外滲，最終導致細菌死亡[14]。由C8、Pm11和鏈接部結合形成的新型多肽即本實驗所用C8gpm11。變鏈菌對C8gpm11的敏感性應較其余細菌更強。

MIC、MBC測定結果顯示變鏈菌UA 159 MIC值是所有細菌中最小數(shù)值。表明其抑菌、殺菌作用效果最好，敏感性最強。C8gpm11對上述口內致病菌均有抑菌、殺菌作用(糞腸球菌殺菌作用較差，表明糞腸球菌對其敏感性較弱)。C8gpm11對不同致齲菌、同種菌不同亞型的抑菌、殺菌作用效果均有差別。這可能與細菌細胞膜的結構差異有關。

電鏡下結果可以肉眼觀察細菌細胞膜形態(tài)變化。C8gpm11處理后的變鏈菌UA 159形態(tài)發(fā)生改變，表型輪廓模糊，以及細胞膜呈現(xiàn)微孔樣改變。血鏈菌細胞表面形態(tài)改變沒有變鏈菌明顯，表明C8gpm11對血鏈菌作用效果沒有變鏈菌UA 159明顯。目前認為有兩種殺菌機制：一是多肽可在不損害細菌細胞膜的同時抑制核酸和蛋白質的合成；二是陰陽離子募集多肽至細菌細胞膜表面，穿透細胞膜脂質雙分子層，使細胞膜局部形成孔隙，最終發(fā)揮殺菌效果[14]。

抑菌圈結果表明除嗜酸乳桿菌外，其余菌種水溶8倍MIC較水溶4倍MIC直徑略大。表明C8gpm11抗菌效果呈現(xiàn)一定濃度依賴性。濃度相對越高，抗菌效果越好。口腔環(huán)境以及唾液成分復雜，抗菌多肽可在唾液蛋白酶的作用下被分解成氨基酸，喪失活性。抑菌圈結果表明除牙齦卟啉單胞菌外，其余菌種唾液溶4倍MIC較水溶4倍MIC直徑略小。表明溶解在唾液中的C8gpm11活性雖然略有降低，但依然具有較強的抗菌能力。Watnick et al[15]研究證明，抗菌劑對浮游態(tài)的細菌具有更好的殺菌效果。但在口腔環(huán)境中，細菌多以生物膜形式定植繁殖，所以，C8gpm11對口內以生物膜形式存在的細菌是否具有殺菌能力，還有待進一步實驗驗證。

在臨床實踐中，對于耐藥菌株，單一抗菌劑不能達到很好的殺菌效果。因此，有必要采用聯(lián)合抗菌劑殺滅致病菌。C8gpm11和CHX聯(lián)合抗菌劑FIC值和FBC值均小于0.5，表明C8gpm11和CHX之間具有協(xié)同抗菌作用。C8gpm11和CHX聯(lián)合抗菌劑較單獨使用C8gpm11或CHX對口內致病菌殺菌效果應更明顯。C8gpm11和NaF聯(lián)合抗菌劑FIC值和FBC值均大于0.5，因此不能認為C8gpm11和NaF聯(lián)合使用對于變鏈菌UA 159具有協(xié)同抗菌作用。將C8gpm11和CHX作為一種聯(lián)合抗菌藥物在臨床應用中具有良好的前景。

本實驗證明了C8gpm11的臨床應用潛力，但其臨床應用效果和殺菌機制尚需進一步探討。抗菌肽殺菌方式多種多樣，對其確切殺菌機制尚缺乏足夠的認識，需要進一步研究。

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