況 亮，呂逸麗，韓振敏，陳 鵬，姚余有,2，唐 偉

抑郁癥是一種常見的心境障礙，實驗研究[1]顯示，抑郁的發(fā)病與下丘腦、杏仁核、大腦皮層和海馬等部位異常有關(guān)。本課題組前期研究[2]顯示，妊娠期慢性應(yīng)激可引起子代雄鼠呈現(xiàn)抑郁癥狀，但其機制不明。促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin-releasing hormone，CRH)主要由下丘腦室旁核分泌，大腦皮層、杏仁核、海馬等腦組織也表達一定量的CRH[3]。以往研究[2,4]顯示高水平CRH可能與抑郁的發(fā)生有關(guān)，但CRH是否介導(dǎo)妊娠期慢性應(yīng)激致抑郁尚不清楚。因此，該研究擬用妊娠期慢性不可預(yù)見性復(fù)合應(yīng)激建立子代雄鼠抑郁模型，并用CRHR1拮抗劑(antalarmin)對子鼠進行干預(yù)，觀察子代雄鼠抑郁程度并進一步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器antalarmin hydrochloride(美國Sigma公司)；雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)單克隆抗體(美國Abcam公司)；β-actin單克隆抗體、山羊抗兔二抗、化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；小鼠CRH酶聯(lián)免疫試劑盒(武漢華美生物公司)；電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)(北京Tanon公司)；強迫游泳圖像采集及分析系統(tǒng)(上海欣軟公司)；曠場實驗圖像采集及分析系統(tǒng)(荷蘭Noldus公司)。

1.2實驗動物與分組8周齡SPF級小鼠，雌性40只，雄性10只，由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。遵循安徽醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會動物飼養(yǎng)要求，室溫為(23±1)℃，攝食飲水自由，50%的相對濕度，飼養(yǎng)1周。按照雌雄比例2 ∶1在晚上19:00合籠，第2天早上07:00前檢查陰栓，查到陰栓的小鼠單獨飼養(yǎng)，并標(biāo)記為受孕第1天，并將孕鼠按2 ∶1隨機分為慢性應(yīng)激組和正常處理組。慢性應(yīng)激組正常飼養(yǎng)1周，受孕第8天施加應(yīng)激：束縛、禁水(24 h)、夾尾(5 min)、溫水游泳(30 ℃，15 min)、禁食(24 h)、改變居住環(huán)境(讓鼠在潮濕的墊料上生存24 h)、冰水游泳(4 ℃，5 min)等7種應(yīng)激方式。小鼠每天隨機接受一種應(yīng)激方法(禁水、禁食除外)，直至小鼠分娩。正常處理組正常飼養(yǎng)即可。子代雄鼠母乳喂養(yǎng)21 d斷奶，隨機分為三組(n=10)：正常對照組(Control組)、產(chǎn)前應(yīng)激+溶劑對照組(CPS組)、產(chǎn)前應(yīng)激+CRHR1拮抗劑組(CPS+ANT組)，CPS+ANT組子代雄鼠于產(chǎn)后21～41 d每天腹腔注射微量CRHR1拮抗劑[5](20 μg/g)，CPS組和Control組注射等量的生理鹽水。

1.3行為學(xué)實驗

1.3.1曠場實驗 每組隨機選取8只子代雄鼠于產(chǎn)后45 d進行曠場實驗，在實驗的過程中確保實驗室安靜，曠場實驗時將小鼠轉(zhuǎn)移至試驗箱的中央，于2 min后開始測試，記時3 min，記錄小鼠爬行總路程、平均速度、穿越象限次數(shù)、站立次數(shù)。每結(jié)束一次實驗，用酒精擦拭曠場實驗箱并清理小鼠的糞便和尿液，待酒精揮發(fā)完，再換下一只小鼠進行實驗。

1.3.2強迫游泳實驗 每組隨機選取8只子代雄鼠于產(chǎn)后47 d進行強迫游泳實驗，第1天將三組小鼠置于裝有25 ℃水的鋼化玻璃桶中游泳15 min(水深30 cm，直徑20 cm)，一次實驗只能用一只鼠，以免小鼠互相影響。第2天，隨機將子代雄鼠放入裝有水的鋼化玻璃桶中(水深及溫度與前1 d相同)，錄像、記錄并觀察小鼠6 min內(nèi)后4 min小鼠在桶內(nèi)禁止不動時間，即小鼠在水面漂浮不動或僅有四肢微小的動作維持身體平衡的時間。

1.3.3糖水偏好實驗 每組隨機選取4只子代雄鼠于產(chǎn)后50 d進行糖水偏好實驗，小鼠單籠飼養(yǎng)在安靜的鼠房內(nèi)，每籠放置兩個水瓶(大小、形狀，顏色相同)。第一個24 h，兩瓶都放置相同重量1%的蔗糖水，使小鼠適應(yīng)蔗糖的甜味；第二個24 h，讓小鼠適應(yīng)兩種不同甜味的飲用水，其中一瓶裝有1%的蔗糖溶液，第二瓶裝有相同體積的飲用水；第三個24 h，禁食禁水24 h，隨后給予相同重量的蔗糖水和純水進行糖水偏好實驗，24 h后對兩水瓶進行稱重，計算糖水偏好率。

1.4HE染色觀察病理形態(tài)學(xué)改變所有行為學(xué)實驗結(jié)束后，隨機選取5只小鼠，眼球取血，頸椎脫臼處死，在冰上取腦。用4%多聚甲醛將取下來的腦組織固定，然后脫水、包埋，最后于前囪后3 mm作6 μm的冠狀切片。應(yīng)用HE染色技術(shù)將每組相同位置的腦組織切片進行染色，每組取6張，在顯微鏡下觀察海馬CA3區(qū)神經(jīng)元的形態(tài)變化，拍照保存。然后用Image-Pro Plus Image 軟件計算出神經(jīng)元的數(shù)目并求出平均值。

1.5Westernblot法檢測海馬組織mTOR的表達量冰上取腦結(jié)束后，將取出的全腦在冰上進行海馬剝離，置于勻漿機中，提取總蛋白，應(yīng)用BCA試劑盒測定海馬組織蛋白的總濃度并定量，變性10 min。灌制8%的膠，每孔上樣28 μg；電泳(60 V/50 min，120 V/300 min)；轉(zhuǎn)膜(200 mA/300 min)；室溫封閉1.5 h；洗膜3次；一抗4 ℃孵育24 h；洗膜3次，二抗室溫孵育1.5 h；洗膜，滴加顯影液，測量條帶的光密度值。所用抗體濃度：一抗 β-actin(兔單抗，1 ∶2 000)、mTOR(兔單抗，1 ∶1 000)，二抗(羊抗兔，1 ∶2 000)。

1.6ELISA法檢測海馬CRH水平用研磨機將海馬研碎，按照說明書離心取海馬組織上清液并測量海馬組織CRH濃度。

2 結(jié)果

2.1CRHR1拮抗劑抑制妊娠期慢性應(yīng)激致子代雄鼠抑郁與Control組相比，CPS組強迫游泳實驗中小鼠不動時間增多(P<0.05)；糖水偏好實驗中糖水偏好率下降(P<0.05)；曠場實驗中鼠爬行總路程、平均速度、穿越象限次數(shù)、站立次數(shù)減少(P<0.05)；與CPS組相比，CPS+ANT組強迫游泳實驗中小鼠不動時間減少(P<0.05)，糖水偏好率增高(P<0.05)，曠場實驗中鼠爬行總路程、平均速度、穿越象限次數(shù)、站立次數(shù)增加(P<0.05)。見表1。

2.2CRHR1拮抗劑改善妊娠期慢性應(yīng)激所致的子代雄鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元病理改變HE染色結(jié)果顯示，Control組小鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元染色清晰，數(shù)量相對較多，排列緊密，細胞核表現(xiàn)出圓形，核仁較明顯；CPS組神經(jīng)元排列疏松，數(shù)量相對較少，脫失現(xiàn)象明顯，部分細胞核濃染、固縮。CPS+ANT組小鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元染色清晰，數(shù)量較多，呈椎體狀、圓球狀，細胞核呈圓形，核仁明顯。用Image-Pro PlusImage分析軟件計數(shù)海馬CA3區(qū)神經(jīng)元總數(shù)，結(jié)果顯示與Control組(173.000±8.888)相比，CPS組(85.667±8.737)神經(jīng)元總數(shù)明顯減少(P<0.05)；與CPS組相比，CPS+ANT組(171.667±6.506)神經(jīng)元總數(shù)明顯增多(P<0.05)。見圖1。

2.3CRHR1拮抗劑上調(diào)妊娠期慢性應(yīng)激子代雄鼠海馬下降的mTOR的表達Western blot結(jié)果顯示，與Control組相比，CPS組小鼠海馬組織mTOR表達量減少(P<0.05)；與CPS組相比，CPS+ANT組小鼠海馬組織的mTOR表達量增加(P<0.05)；Control組與CPS+ANT組小鼠海馬組織mTOR表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖2。

2.4妊娠期慢性應(yīng)激致子代雄鼠海馬CRH水平升高ELISA法檢測小鼠海馬CRH結(jié)果顯示，3組子代雄鼠海馬CRH濃度差異有統(tǒng)計學(xué)意義，與Control組相比，CPS組子代雄鼠海馬CRH水平升高(P<0.05)；與CPS組相比，CPS+ANT組小鼠海馬CRH水平降低(P<0.05)，見圖3。

3 討論

CRH神經(jīng)元處于HPA軸頂端、具有整合心理和物理刺激的功能，被公認為是應(yīng)激反應(yīng)的中樞驅(qū)動力[6]。CRH主要由下丘腦室旁核分泌，大腦皮層、海馬、杏仁核等腦組織也表達一定量的CRH[7]。本研究結(jié)果顯示，CPS組較Control組海馬組織CRH濃度上升，說明妊娠期慢性應(yīng)激可致子代海馬組織CRH升高。

表1 CRHR1拮抗劑抑制妊娠期慢性應(yīng)激致子代雄鼠抑郁

圖1 CRHR1拮抗劑改善妊娠期慢性應(yīng)激所致的子代雄鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元 HE×40

圖2 CRHR1拮抗劑上調(diào)妊娠期慢性應(yīng)激子代雄鼠海馬下降的mTOR的表達量

圖3 妊娠期慢性應(yīng)激致子代雄鼠海馬CRH水平升高

強迫游泳實驗、糖水偏好實驗和曠場實驗是目前測量小鼠抑郁程度的常用實驗。實驗很好的分析了小鼠的無助程度、對快感缺乏的程度和在新環(huán)境中的探索行為。本研究行為學(xué)實驗顯示CPS組子代雄鼠較Control組小鼠靜止漂浮時間增多；糖水偏好實驗中糖水偏好率下降；曠場實驗中鼠爬行總路程、平均速度、穿越象限次數(shù)、站立次數(shù)減少。CPS+ANT組較CPS組小鼠靜止漂浮時間減少，糖水偏好率上升，曠場實驗中鼠爬行總路程、平均速度、穿越象限次數(shù)、站立次數(shù)增多。說明妊娠期慢性應(yīng)激導(dǎo)致子代雄鼠行為學(xué)改變，使子代雄鼠產(chǎn)生抑郁樣行為，CRHR1拮抗劑可逆轉(zhuǎn)妊娠期慢性應(yīng)激致子代雄鼠抑郁，提示CRH介導(dǎo)了妊娠期慢性應(yīng)激致子代雄鼠抑郁。

實驗研究[8-9]顯示，海馬部位異常與抑郁的發(fā)病有關(guān)，其中CA3區(qū)與抑郁的形成密切相關(guān)。因此該區(qū)神經(jīng)元數(shù)目、形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能的改變必然會導(dǎo)致行為學(xué)的改變。本實驗的海馬CA3區(qū)HE染色結(jié)果顯示，CPS組較Control組海馬CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，并且排列疏松紊亂，異常神經(jīng)元明顯增多，部分細胞核濃染、固縮，而CPS+ANT組較CPS組海馬CA3區(qū)神經(jīng)元染色清晰，數(shù)量較多，核濃染、固縮減少。說明CRHR1拮抗劑逆轉(zhuǎn)妊娠期慢性應(yīng)激致子代雄鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元損傷，提示CRH致海馬CA3區(qū)神經(jīng)元損傷可能是妊娠期慢性應(yīng)激致子代雄鼠抑郁的原因。

mTOR信號通路是調(diào)控細胞生長與增殖的一個關(guān)鍵通路，該通路將從營養(yǎng)分子、能量狀態(tài)以及生長因子傳來的信號整合在一起，從而調(diào)控生命過程。mTOR分為mTORC1 和mTORC2，mTORC1信號在調(diào)節(jié)神經(jīng)元的存活和分化、樹突的長度和分支、軸突的生長和突觸的可塑性中發(fā)揮重要作用，同時也介導(dǎo)抑郁的發(fā)病[10-11]。本研究顯示，CPS組較Control組海馬mTOR明顯下降，CPS+ANT組較CPS組海馬mTOR明顯上升并接近Control組水平。說明CRH受體拮抗劑可上調(diào)mTOR水平。提示妊娠期慢性應(yīng)激通過升高的CRH下調(diào)mTOR的表達進而致子代雄鼠抑郁。

本研究結(jié)果還顯示， CPS+ANT組較CPS組海馬組織CRH濃度下降，提示CRHR1拮抗劑可以降低海馬CRH水平，其機制是否與CRHR1拮抗劑下調(diào)糖皮質(zhì)激素濃度有關(guān)尚不清楚，有待于進一步研究。

綜上所述，CRH介導(dǎo)了妊娠期慢性應(yīng)激致子代抑郁[12-13]，其機制可能與妊娠期慢性應(yīng)激致子代海馬CRH升高，下調(diào)mTOR蛋白表達，進而引起海馬 CA3 區(qū)神經(jīng)元損傷有關(guān)。

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