汪國(guó)玉，張 蕾，耿亞迪，馮曉俊，陳昭琳，趙曉曉，姜 玲,，魏 偉

欖香烯是從傳統(tǒng)中藥姜黃屬溫郁金中提取分離的一種新型抗腫瘤藥物，β-欖香烯是其主要成分，占60%～72%[1]。到目前為止，β-欖香烯作為一種非細(xì)胞毒性抗腫瘤藥物，臨床上已經(jīng)用于腦癌、乳腺癌及肝癌等一些腫瘤的治療[2]。結(jié)腸癌是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，在我國(guó)男女發(fā)病率和死亡率呈顯著上升趨勢(shì)，且多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已屬于中晚期[3]。目前結(jié)腸癌的治療多以手術(shù)為主，5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑等化療和放療為輔，但會(huì)出現(xiàn)惡心嘔吐、脫發(fā)、免疫功能下降等副作用，且患者容易復(fù)發(fā)，因此急需有效低毒的抗腫瘤藥物治療結(jié)腸癌[4]。有研究[5-6]表明β-欖香烯對(duì)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞和Lovo細(xì)胞有抑制增殖作用，但具體作用特點(diǎn)和機(jī)制尚未提及。故該研究旨在觀察β-欖香烯對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞DLD-1增殖及凋亡的影響，并初步探討β-欖香烯對(duì)DLD-1細(xì)胞活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)生成的影響。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑β-欖香烯(大連金港制藥有限公司)；CellTiter 96?AQueous單溶液細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(MTS)(普洛麥格北京生物技術(shù)有限公司)；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒(貝博生物有限公司)；Hoechst 33342活細(xì)胞染色液(100×)、活性氧檢測(cè)試劑盒(DCFH-DA)、Western及IP細(xì)胞裂解液、PMSF(100 mmol/L)、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；凋亡抗體套盒(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)DLD-1細(xì)胞由安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院細(xì)胞庫(kù)饋贈(zèng)，復(fù)蘇后加入含10%胎牛血清、20 U/ml的青霉素和鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的條件培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%時(shí)用胰酶消化進(jìn)行傳代，細(xì)胞傳3代穩(wěn)定后采用狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

1.3MTS法檢測(cè)細(xì)胞活力胰酶消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的DLD-1細(xì)胞并制成單細(xì)胞懸液，以每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種至96孔板中，每孔200 μl，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至50%～60%時(shí)依序加入不同濃度β-欖香烯(25、50、100、200、300、400、500、600 μmol/L)作為藥物組，設(shè)一個(gè)空白對(duì)照組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。分別處理24、48、72 h后，顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。相應(yīng)時(shí)間后每孔加入MTS/PMS混合物40 μl，1 h后于490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光度( optical density，OD)值。結(jié)果以細(xì)胞活力大小表示，細(xì)胞活力(%)=藥物組OD / 空白對(duì)照組OD ×100%。

1.4克隆形成實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期DLD-1細(xì)胞接種到6孔板中，每孔2 ml，1×103個(gè)細(xì)胞；待細(xì)胞貼壁后每孔依次加入不同濃度β-欖香烯(50、100、200、300 μmol/L)作為藥物組，設(shè)一個(gè)空白對(duì)照組。24 h后吸棄藥液，每孔加入2 ml含10%胎牛血清、20 U/ml的青霉素和鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2 d換液1次。待長(zhǎng)出細(xì)胞集落，14 d后處理。PBS清洗細(xì)胞2次，每孔加入1 ml多聚甲醛固定液固定30 min后吸棄，加入1 ml過(guò)濾的結(jié)晶紫染色液染色15 min，用清水輕輕沖掉結(jié)晶紫染色液，將6孔板殘余的水分晾干、拍照。

1.5Hoechst33342染色實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期DLD-1細(xì)胞接種到12孔板中，每孔1 ml，1×105個(gè)細(xì)胞；待細(xì)胞貼壁后每孔依次加入不同濃度β-欖香烯(50、100、200、300 μmol/L)作為藥物組，設(shè)一個(gè)空白對(duì)照組。24 h后吸棄藥液，PBS清洗1次，每孔加入1 ml Hoechst 33342染色液，放入培養(yǎng)箱孵育15 min后吸棄，PBS清洗2次后于熒光顯微鏡下觀察。

1.6AnnexinV/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期DLD-1細(xì)胞接種到6孔板中，細(xì)胞密度為105個(gè)/ml。待細(xì)胞貼壁后依次加入不同濃度β-欖香烯(50、100、200、300 μmol/L)作為藥物組，設(shè)一個(gè)空白對(duì)照組。置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取5×105個(gè)細(xì)胞進(jìn)行Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞收集后用冷PBS洗滌2次，離心后用400 μl 1× Annexin V結(jié)合液重懸細(xì)胞，加入5 μl Annexin V-FITC進(jìn)行染色，2～8 ℃避光孵育15 min，再加入10 μl PI染色液輕輕混勻，于2～8 ℃避光孵育5 min，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.7Westernblot法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)β-欖香烯(100、200、300 μmol/L)及空白對(duì)照組處理DLD-1細(xì)胞24 h后，提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度并將蛋白調(diào)整為相同濃度。SDS-PAGE法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，兔抗人GAPDH(1 ∶1 000)、Cleaved PARP(1 ∶1 000)、PARP(1 ∶1 000)、Cleaved Caspase-9(1 ∶1 000)、Caspase-9(1 ∶1 000)、Cleaved Caspase-3(1 ∶1 000)和Caspase-3(1 ∶1 000)一抗4 ℃孵育過(guò)夜，二抗(1 ∶5 000)室溫孵育2 h，顯影。

1.8ROS檢測(cè)

1.8.1熒光顯微鏡觀察ROS水平 β-欖香烯(50、100、200、300 μmol/L)及空白對(duì)照組處理DLD-1細(xì)胞24 h后，PBS清洗2次，每孔加入1 ml DCFH-DA熒光探針，放入培養(yǎng)箱孵育20 min，用無(wú)血清培養(yǎng)基清洗3次，去掉未進(jìn)入細(xì)胞的DCFH-DA，熒光顯微鏡下觀察。

1.8.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ROS水平 β-欖香烯(50、100、200、300 μmol/L)及空白對(duì)照組處理DLD-1細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞于1.5 ml離心管，用PBS清洗2次離心，每管加入1 ml DCFH-DA熒光探針，吹打混勻放入培養(yǎng)箱孵育20 min，3 min顛倒混勻1次，用無(wú)血清培養(yǎng)基清洗3次，充分去掉未進(jìn)入細(xì)胞的DCFH-DA，上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1β-欖香烯對(duì)DLD-1細(xì)胞活力的影響β-欖香烯(25、50、100、200、300、400、500、600 μmol/L)處理細(xì)胞24 h后，倒置顯微鏡下觀察，空白對(duì)照組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈不規(guī)則梭形、邊緣光滑；β-欖香烯藥物組隨著藥物濃度的升高，細(xì)胞存活數(shù)目減少、細(xì)胞間隙變大，細(xì)胞皺縮且形態(tài)模糊，見(jiàn)圖1。MTS法結(jié)果顯示，50～400 μmol/L β-欖香烯顯著抑制DLD-1細(xì)胞的活力(F=97.78、153.3、175.7，P<0.05，P<0.01)，見(jiàn)圖2。

圖1 β-欖香烯處理DLD-1細(xì)胞24 h后細(xì)胞形態(tài) ×200

圖2 β-欖香烯抑制DLD-1細(xì)胞增殖

2.2β-欖香烯對(duì)DLD-1細(xì)胞克隆形成能力的影響克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，β-欖香烯顯著抑制DLD-1細(xì)胞增殖。與空白對(duì)照組相比，隨著β-欖香烯濃度增大，細(xì)胞克隆數(shù)目變少，細(xì)胞集落數(shù)逐漸減少(F=337.9，P<0.01)，見(jiàn)圖3。

2.3β-欖香烯對(duì)DLD-1細(xì)胞核的影響β-欖香烯(50、100、200、300 μmol/L)處理細(xì)胞24 h后進(jìn)行Hoechst 33342染色，結(jié)果顯示細(xì)胞均出現(xiàn)藍(lán)染，空白對(duì)照組細(xì)胞核規(guī)則均勻，核膜完整，但藥物組隨著β-欖香烯濃度增加，部分細(xì)胞核成碎塊狀，核染色質(zhì)固縮發(fā)生高亮呈現(xiàn)致密濃染(F=140.9，P<0.05，P<0.01)，見(jiàn)圖4。

2.4β-欖香烯對(duì)DLD-1細(xì)胞凋亡的影響采用β-欖香烯(50、100、200、300 μmol/L)處理DLD-1細(xì)胞24 h后，與空白對(duì)照組相比，β-欖香烯給藥組的凋亡率增加(F=305.4，P<0.01)，表明當(dāng)β-欖香烯濃度增大時(shí)，可以誘導(dǎo)DLD-1細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，見(jiàn)圖5。

圖3 β-欖香烯對(duì)DLD-1細(xì)胞克隆形成能力的影響

圖4 Hoechst 33342染色實(shí)驗(yàn)測(cè)定DLD-1細(xì)胞凋亡 ×200

圖5 β-欖香烯誘導(dǎo)DLD-1細(xì)胞凋亡

圖6 β-欖香烯對(duì)DLD-1細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.5β-欖香烯對(duì)DLD-1細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Western blot結(jié)果表明，β-欖香烯作用DLD-1細(xì)胞24 h后，Cleaved PARP、Cleaved Caspase-9和Cleaved Caspase-3表達(dá)水平隨著β-欖香烯濃度增大而增加；PARP、Caspase-9和Caspase-3蛋白的表達(dá)水平變化不明顯(F=18.61、7.92、261.3、33.68、213.9、17.99，P<0.01)。提示β-欖香烯促進(jìn)PARP、Caspase-9和Caspase-3蛋白剪切，促進(jìn)了DLD-1細(xì)胞的凋亡，見(jiàn)圖6。

2.6DLD-1細(xì)胞內(nèi)ROS的表達(dá)熒光顯微鏡下觀察結(jié)果顯示，β-欖香烯(50、100、200、300 μmol/L)作用于DLD-1細(xì)胞24 h后，與空白對(duì)照組相比，β-欖香烯藥物組DCF的熒光強(qiáng)度依次增加(F=279.7，P<0.01)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果與熒光顯微鏡相一致(F=280.22，P<0.01)，表明β-欖香烯濃度增大使細(xì)胞內(nèi)ROS水平增加，見(jiàn)圖7、8。

圖7 熒光顯微鏡下觀察β-欖香烯對(duì)DLD-1細(xì)胞內(nèi)ROS的影響 ×100

圖8 流式細(xì)胞儀檢測(cè)β-欖香烯對(duì)DLD-1細(xì)胞內(nèi)ROS的影響

3 討論

姜黃屬植物莪術(shù)作為我國(guó)常用的傳統(tǒng)中藥，具有行氣止痛、積散結(jié)、破血祛瘀作用，《醫(yī)家心法》論“廣茂即莪術(shù)，凡行氣破血，消積散結(jié)皆用之”等。大量研究[7-8]表明莪術(shù)對(duì)多種腫瘤如乳腺癌、肝癌及胃癌等有很好的治療作用，β-欖香烯是從中藥莪術(shù)根莖中提取并分離的有效活性單體，其具有低毒有效、廣譜的性質(zhì)，對(duì)多種腫瘤有明顯的抑制作用，是臨床上常用的抗腫瘤藥物。有研究[9]表明，β-欖香烯作為一種天然的抗血管生成劑，可以通過(guò)抑制VEGF介導(dǎo)的血管生成，抑制黑素瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。另外，β-欖香烯通過(guò)上調(diào)P53蛋白的表達(dá)促進(jìn)外泌體的釋放，抑制人肺癌細(xì)胞的增殖[10]。在本研究中，MTS實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示，β-欖香烯能夠顯著抑制結(jié)腸癌DLD-1細(xì)胞的增殖。

在一定條件下，細(xì)胞受內(nèi)在遺傳機(jī)制的控制自動(dòng)結(jié)束生命的過(guò)程稱之為細(xì)胞凋亡，其對(duì)多細(xì)胞生物體的胚胎發(fā)育和組織穩(wěn)態(tài)起著至關(guān)重要的作用[11]。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，細(xì)胞體積縮小，線粒體膜電位消失，核質(zhì)濃縮，DNA降解，胞膜內(nèi)側(cè)外翻到膜表面，最終細(xì)胞被分割包裹為幾個(gè)凋亡小體，繼而被吞噬細(xì)胞吞噬[12]。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中Caspases扮演著十分重要的角色，細(xì)胞凋亡過(guò)程其實(shí)就是Caspases不可逆有限水解底物的級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)過(guò)程。當(dāng)細(xì)胞色素C進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后，募集Caspase-9前體并使其剪切活化，從而進(jìn)一步激活效應(yīng)Caspase-7和Caspase-3，而PARP是細(xì)胞凋亡核心元件Caspase-3 的切割底物，共同啟動(dòng)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡[13]。本研究探討了β-欖香烯誘導(dǎo)DLD-1細(xì)胞凋亡的初步機(jī)制。Hoechst 33342染色顯示β-欖香烯可使細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核聚縮和致密濃染的表現(xiàn)，Annexin V/PI雙染結(jié)果表明，β-欖香烯可誘導(dǎo)DLD-1細(xì)胞出現(xiàn)凋亡；Western blot結(jié)果表明β-欖香烯誘導(dǎo)DLD-1細(xì)胞凋亡與PARP、Caspase-3、Caspase-9的活化有關(guān)。以上說(shuō)明β-欖香烯作為中藥有效活性成分能夠誘導(dǎo)結(jié)腸癌DLD-1細(xì)胞發(fā)生凋亡。

ROS作為一種自由基，與腫瘤之間的關(guān)系密切，越來(lái)越多的研究表明ROS不僅與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，還和腫瘤的治療有著密切聯(lián)系。ROS在不同水平下會(huì)有不同的作用。低水平的ROS促進(jìn)細(xì)胞分裂與增殖，中等水平的ROS導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，而高水平的ROS誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死[14]。許多抗癌藥物如烷化劑和喜樹(shù)堿等會(huì)通過(guò)介導(dǎo)ROS的大量釋放和線粒體膜電位的變化，激活Caspase-3 等蛋白酶來(lái)誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生凋亡[15]。本研究觀察了β-欖香烯對(duì)ROS的影響，熒光顯微鏡下觀察和流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示β-欖香烯處理DLD-1細(xì)胞24 h后，隨著β-欖香烯作用濃度增加，藥物組細(xì)胞內(nèi)ROS 水平與空白對(duì)照組相比明顯增加，表明ROS可能在β-欖香烯抑制DLD-1細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，β-欖香烯抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞DLD-1的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這可能與ROS升高及上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白有關(guān)，為β-欖香烯應(yīng)用于結(jié)腸癌的臨床治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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